Abstract
Progestin motstand er et stort hinder for å behandle tidlig stadium, godt differensiert livmorkreft samt tilbakevendende livmorkreft. Mekanismen bak den suboptimale respons på progestin er ikke godt forstått.
PTEN
tumor suppressor genet er ofte mutert i type I livmorkreft og denne mutasjonen fører hyperaktive av PI3K /AKT veien. Vi antok at økt aktivering av AKT fremmer en utilstrekkelig respons på gestagener i endometrial kreft celler. Ishikawa-celler stabilt transfektert med progesteronreseptoren B (PRB23-celler) ble behandlet med en AKT-inhibitor MK-2206, noe som effektivt reduserte nivåer av p (Ser473) -AKT på en doseavhengig (10 nM til 1 uM), og tidsavhengig måte (0,5 timer til 24 timer). MK-2206 hemmet nivåer av p (Thr308) -AKT og en nedstrøms mål, p (Thr246) -PRAS40, men ikke endre nivåer av p (Thr202 /Tyr204) ERK eller p (Thr13 /Tyr185) SAPK /JNK, viser spesifisitet av MK-2206 for AKT. I tillegg er MK-2206 behandling av PRB23 celler resulterte i en betydelig økning i nivåene av progesteron reseptor B (PRB) protein. Microarray analyse av PRB23 celler identifisert PDK4 som den mest høyt oppregulert gen blant 70 oppregulert gener som svar på R5020. Hemming av AKT videre oppregulert progestin-mediert uttrykk for PDK4 men ikke påvirke en annen progestin-responsive genet, SGK1. Behandling av celler med PRB23 R5020 og MK-2206 uavhengig redusert levedyktighet av cellene mens kombinasjonen av R5020 og MK-2206 forårsaket den største reduksjon i celleviabilitet. Videre mus med xenopodet tumorer som ble behandlet med MK-2206 alene eller sammen med progesteron alene oppviste små reduksjoner i sin tumorvolumet. Den største reduksjon i tumorstørrelse ble observert i mus behandlet med både MK-2206 og progesteron; disse tumorer viste den minste proliferasjon (Ki67) og den mest apoptose (spaltet caspase-3) i alle behandlingsgruppene. I sammendraget, hemming av AKT stabiliserer Progesteron Receptor B og forsterker progesteron respons i livmorkreftceller som har hyperactivated AKT
Citation. Pant A, Lee II, Lu Z, Rueda BR, Schink J, Kim JJ ( 2012) Hemming av AKT med oralt aktive allosterisk AKT Sperre, MK-2206, sensitizes livmorkreft celler til gestagen. PLoS ONE syv (7): e41593. doi: 10,1371 /journal.pone.0041593
Redaktør: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 13 mars 2012; Godkjent: 22 juni 2012; Publisert: 24.07.2012
Copyright: © 2012 Pant et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Institutes Helse R21 CA127674 (JJK), National Institutes of Health /National Cancer Institute trening stipend T32CA09560, og fra Malkin Scholars Program fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center of Northwestern University (IIL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den vanligste gynekologiske kreftform i USA. I 2010 ble 43,470 nye tilfeller forventes resulterer i 7950 dødsfall [1]. De aller fleste endometrial kreft tilfeller er relatert til uhindret østrogen handling blir referert til som Type I livmorkreft. Den vanligste genetisk mutasjon som oppstår hos ca 50-80% av alle tilfeller i Type I livmorkreft er i tumorsuppressorgenet
PTEN product: [2], [3]. En mutasjon i
PTEN
genet resulterer i nedstrøms konstitutiv aktivering av phosphatidylinositol 3′-kinase (PI3K) /AKT sti [4]. AKT er en serin /treonin-kinase som aktiverer forskjellige reaksjonsveier som fremmer cellulær overlevelse og inhiberer apoptose [4], [5]. Det har tidligere blitt vist at det er økte nivåer av aktivert AKT i endometriecancer og at dette kan varsle en dårlig prognose i disse pasientene [6]. I tillegg har det blitt vist at inhibering av AKT-reaksjonsveien i endometrial cancer celler resulterer i økt apoptose, hvilket viser at modulering av denne reaksjonsvei kan spille en viktig terapeutisk rolle [7], [8].
Endometriekreft behandles vanligvis med kirurgisk fjerning av livmoren og adjuvant terapi som indikeres av den spesifikke patologi. For tidlig stadium sykdommen denne behandling resulterer i gode 5-års overlevelse på mer enn 90% [9]. Imidlertid utelukker dette definitiv kirurgi ytterligere fruktbarhet. Som fedme øker i befolkningen, dette resulterer i stadig flere yngre kvinner med livmorkreft og fruktbarhet spar terapi vil bli mer uvurderlig. Foreløpig er progestin brukt som primærbehandling ved avansert eller tilbakevendende sykdom hos pasienter som ikke er operative kandidater på grunn av medisinsk sykelighet, og hos pasienter i håp om å bevare deres fremtidige fruktbarhet. Multiple case serie av pasientene behandlet med progestiner er publisert med oppmuntrende, men ikke absolutt, resultater. Responsrater for endometriehyperplasi med atypi har variert fra 67-82% og responsrater for lav karakter livmorkreft varierer fra 50-70% (anmeldt i [10]). For de pasienter som ikke responderer på progestin terapi, er hysterektomi anbefales. Denne kliniske situasjonen er vanlig som prosentandelen av pasienter yngre enn 45 diagnostisert med livmorkreft nå varierer fra 5 til 29% [10],.
Progesteron medierer sin hemmende effekt på endometriet og livmorkreft via progesteron reseptor (PR), en intracellulær steroid-reseptor med A og B isoformer. En økning i responsrater til progestin terapi og forbedret overlevelses utfall har blitt rapportert i svulster med en høyere prosentandel av PR [12]. PRA mangler 164 aminosyrer fra den N-terminale ende og begge isoformer omregnes fra individuelle mRNA-arter av et enkelt gen under kontroll av forskjellige promotorer og betraktes funksjonelt distinkte [13]. Mens de spesifikke roller for PRA og PRB fortsatt uklare i livmorkreft, studier tyder på at PRB kan være den primære isoform ansvarlig for veksthemmende og kreft undertrykkende handlinger av progesteron in vitro. I PRB-stabilt transfekterte Ishikawa-celler, MPA behandlingen resulterte i inhibering av proliferasjon, migrering og invasjon, mens PRA-stabilt transfekterte Ishikawa-celler ikke klarte å inhibere disse prosessene [14], [15]. I tillegg PRB-transfekterte Hec50co celler behandlet med progesteron vist betydelige reduksjoner i celleproliferasjon og invasjon, mens Hec50co celler som uttrykker PRA hadde bare beskjedne hemmende effekter [16].
MK-2206 er en oralt aktiv, allosterisk hemmer av AKT. Tallrike prekliniske studier har demonstrert effektivitet i å hemme AKT og fremme cancercelledød som et enkelt middel, så vel som i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler [17], [18], [19], [20]. Kliniske studier er i gang ved hjelp av denne nye forbindelsen for kreftbehandling for ulike solide svulster. MK-2206 viste seg å være generelt godt tolerert ved doser opp til 60 mg gjennom munnen qod og resulterte i plasmakonsentrasjoner innenfor akseptert terapeutiske området [21]. Foreløpig er det en åpen fase II studie sponset av NCI for pasienter med avansert eller residiverende livmorkreft. Den primære utfall er progression- overlevelse og objektiv tumorrespons.
I denne studien rapporterer vi at hemming av AKT sti av MK-2206 resulterer i redusert levedyktighet og økt apoptose av endometrial kreft celler. I tillegg hemming av AKT øker PRB proteinnivåer, endrer ekspresjonen av progestin-regulerte gener, og synergizes med progestin for å redusere tumorvolumet av xenotransplantater. Kombi behandling med progestiner og AKT-hemmere kan anses å bevisst endometrial adenokarsinom til progestin terapi.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble godkjent av Northwestern University Animal Care komiteen.
livmorkreft Cells
PRB23 Ishikawa celler ble hentet fra L. Blok (Erasmus University i Nederland). Ishikawa celler stammer fra en godt differensiert endometrial adenokarsinom med en kjent PTEN mutasjon [14]. De PRB23 Cellene ble samlet ved stabil transfeksjon av pcDNA3.1 PRB ekspresjonsvektoren inn i Ishikawa-celler blottet for endogent PR [14]. De PRB23 Cellene ble holdt i DMEM /F12 med 10% FBS, natriumpyruvat, penicillin /streptomycin, hygromycin og G418. Ved omtrent 60-80% konfluens, ble cellene sultet over natten serum i DMEM /F12. Cellene ble deretter behandlet den neste dag med kjøretøyet, 100 nM MK-2206 (2 h forbehandling), 10 nM R5020, eller en kombinasjon av MK-2206 og R5020. MK-2206 (Merck) ble oppnådd gjennom kreftbehandling Evaluering Program.
Western Blot
Hele cellelysater ble oppnådd på isen ved hjelp av M-PER pattedyr lysis løsning (Thermo Scientific) supplert med protease og fosfatase hemmere (Sigma). Konsentrasjonen av protein i lysatene ble målt ved hjelp av Micro BCA kit (Thermo Scientific). Isolerte proteinprøver ble kjørt på 8% akrylamidgeler og deretter overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Whatman). Membranene ble blokkert i 5% bovint serumalbumin (BSA, Sigma) i TBS-T ved romtemperatur i en time. Membranene ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot fosforylert (Ser473) -AKT, fosforylert (Thr 308) -AKT, fosforylert PRAS40, PRAS40, fosforylert (Thr202 /Tyr 204) ERK, ERK, (pThr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK, kløyvde PARP, kløyvde caspase 3 (Cell Signaling), og PR (Dako). Blottene ble vasket fire ganger i TBS-T ved romtemperatur og deretter inkubert med sekundært peroksidase-konjugert geite-anti-kanin eller geit-anti-mus-antistoff i en time ved romtemperatur. Membranene ble utviklet med ECL Super Signal West Femto deteksjon kit (Thermo Scientific). Membranene ble strippet ved hjelp av Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce) og analysert med et antistoff til beta-aktin (Sigma) for en lasting kontroll.
celleviabilitet
For å vurdere for celle levedyktighet, den AlamarBlue celleviabilitet reagens (Invitrogen) ble anvendt. PRB23 celler ble sådd i en 96-brønns klar bunn sort plate på omtrent 1,500 celler pr brønn i en 37 ° C inkubator. Cellene fikk feste seg over natten og den neste dag, ble vasket med PBS og deretter serum sultet over natten i serumfritt DMEM /F12. Den neste dag ble cellene forbehandlet med 1 uM MK-2206 i én time og deretter behandlet med 100 nM R5020 i 120 timer. På slutten av behandlingstiden ble 10 pl av AlamarBlue reagens tilsatt til hver brønn i to timer og deretter ble fluorescens-signalet ble målt på den Synergy HT plateleser fra Bio-Tek med KC4 3,4 programvaren ved 530/590 nm for å bestemme celle levedyktighet.
microarray analyse og statistisk analyse
Tre separate PRB-Ishikawa cellekulturer ble brukt for microarray analyse. De eksperimentelle betingelsene var kjøretøy eller behandling med 10 nM R5020 i 2 timer. Alle RNA prøver ble behandlet på Genomics Kjerne Facility i Senter for Genetic Medicine ved Northwestern University (Chicago, IL). Kvaliteten av total RNA ble evaluert ved bruk av Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). 1,5 pg av hver RNA-prøve, med 260/280 og 28S /18S-forhold som er større enn 1,8, ble brukt til å lage dobbelt-trådet cDNA. Kvalitetskontroller og sonde nivå behandlingen av Illumina microarray data ble videre gjort med R Bioconductor pakken, lumi (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/lumi.html). Databehandling også inkludert en normalisering prosedyre utnytte quantile normalisering metoden [22] for å redusere skygging variasjon mellom mikromatriser, som kan bli innført i løpet av prosessene i prøveopparbeidelse, produksjon, fluorescens merking, hybridisering, og /eller skanning. Hierarkisk clustering og Principal Component Analysis ble utført på de normaliserte signaldata for å vurdere prøven forholdet og variasjon. Prober fraværende i alle prøvene ble filtrert ut i henhold til Illumina s deteksjons p-verdier i nedstrøms analyse. Differensial genuttrykk mellom de ulike forhold ble vurdert av en statistisk lineær modell analyse bruker bioconductor pakken limma, der en empirisk Bayes metode ble brukt til å moderere standardfeil av de estimerte log-fold endringer i genuttrykk, og resulterte i en mer stabil slutning og forbedret effekt, spesielt for eksperimenter med små mengder mikromatriser ([23]; https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). De moderert t-statistikk p-verdier avledet fra limma analysen ovenfor ble ytterligere justert for multippel testing av Benjamini og Hochberg metode for å kontrollere falske funnrate (FDR). Listene over differensielt uttrykte gener ble oppnådd ved FDR kriteriene for mindre enn 5% og fold change cutoff av . 1.5, og visualisert ved vulkan tomter
Real Time PCR
RNA ble isolert fra celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Konsentrasjon og renhet hentet RNA ble bestemt ved bruk av ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop). Total RNA prøver ble DNase I (Zymo Research) behandles for å fjerne eventuelle kontaminerende DNA. Totalt RNA ble revers-transkribert med Smart MMLV revers transkriptase (Invitrogen) for syntese av cDNA ved anvendelse av produsentens protokoll. Real-time PCR ble utført ved hjelp av spesifikke primere (Applied Biosystems) til PDK4 og SGK1 og husholdningsgenet TBP. Den ganger endring i ekspresjon ble beregnet ved anvendelse av ΔΔCt metoden [24], med TBP som en intern kontroll. Alle PCR-reaksjoner ble utført på en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 40 sykluser (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min) etter 10 minutters inkubering ved 95 ° C.
tumorxenotransplantater
Seks uker gamle CD-1 nude, ovarieektomiserte hunnmus ble kjøpt fra Charles River Laboratories. Alle dyreforsøk ble godkjent av Northwestern University Animal Care Committee. En million PRB23 Cellene ble suspendert i PBS 1:02 /Matrigel (BD Biosciences) i et totalt volum på 100 ul og injisert subkutant inn i høyre og venstre dorsum av hver mus. Totalt 32 mus ble injisert for å ha 8 mus per behandlingsgruppe. Tumorene fikk vokse i 8 uker. Av 32 mus, svulster vokste i 28 mus. I tillegg, 2 mus døde av ukjente grunner. De gjenværende 26 mus ble delt inn i 4 grupper, bærer (6), progesteron (7), MK-2206 (7), og MK-2206 + progesteron (6). Progesteron pellets (50 mg, 21-dagers utslipp for 2,4 mg /dag) ble implantert subkutant. Musene ble gitt 120 mg /kg MK-2206, 3 ganger per uke i 9 dager i et volum på 0,3 ml av 30% Captisol. Alle studier toksisitet har blitt utført hos gnagere ved Merck og 120 mg /kg er anbefalt dose for å studere effekter på svulster uten å forårsake toksisitet [25]. Verdien for bærerkontrollgruppen mus ble gitt 0,3 ml av 30% Captisol. Musene ble veid før og etter behandlingene. Tumor størrelser ble målt med calipers gjennom i løpet av 8 uker samt etter behandlinger. Tumorvolumer ble beregnet ved hjelp av formelen:
Tumor volum
= 1/2 (
lengde
×
bredde
)
2 [25] . Svulster ble skåret ut og behandlet for immunhistokjemi.
Immunohistochemistry
Vev ble fiksert i formalin og parafin innebygd, og 4 pm vevssnitt ble plassert på objektglass. Tumor seksjonene ble de-paraffinized. Varmeinduserte epitop gjenfinning ble så utført i en 10 nM natriumcitrat-buffer med 0,05% Tween (Sigma) ved pH 6,0. Citratbufferen ble forvarmet i et vannbad ved 99 ° C og deretter glassene ble plassert i bufferen i 45 minutter. Platene ble tillatt å avkjøles i 30 minutter ved romtemperatur og ble vasket i TBS-T i 5 minutter. Den Dako EnVision HRP IHC kit ble brukt. 3% hydrogenperoksyd ble påført på vevssnittene i 10 minutter, etterfulgt av 2 vaskinger i 10 minutter i TBS-T. Protein blokken ble påført i 30 minutter ved romtemperatur. Vevssnittene ble deretter inkubert med primære antistoffer mot PR (Dako) eller spaltet Caspase 3 (Cell Signaling) over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. Anti-kanin eller anti-mus sekundært antistoff ble deretter påført på vevssnittene i 1 time ved romtemperatur og deretter vasket i TBS-T to ganger i 5 minutter. DAB løsning ble påført på hvert vev seksjon i 5 minutter og deretter skylt. Mayer Hematoxylin ble brukt til å counterstain og objektglassene ble skylt. Seksjonene ble deretter plassert i en løsning av 28% ammoniumhydroksid og deretter skylles. Snittene ble dehydrert via 2 endringer av 95% etanol, 2 endringer av 100% etanol, og 2 med xylen. Seksjonene ble så montert på dekkglass ved hjelp Cytoseal fortelle XYL montering media (Richard-Allan Scientific). Platene ble deretter visualisert ved hjelp av Axiovert 200 (Zeiss) mikroskop og bilder tatt med Zeiss Axiocam kameraet.
Resultater
MK-2206 Hemmer AKT
Det har tidligere vært rapporterte at Ishikawa-celler bærer en mutasjon PTEN, og dette resulterer i konstitutiv aktivering nedstrøms av AKT [7], [8]. For å bestemme hvorvidt MK-2206 hemmet AKT i PRB23 cellene, ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av MK-2206 (0-1 mm) og inkubert i forskjellige tidsrom (0-24 h) (fig. 1A, 1B). Fosforylert (Ser473) -AKT ble påvist i celler behandlet med vehikkel og nivåer falt progressivt med økende konsentrasjoner av MK-2206 (Fig. 1A). Totalt AKT nivåer ble ikke påvirket av behandling med MK-2206. Nivåer av p (Ser473) -AKT redusert, så tidlig som i 1 time, og holdt seg lavere enn bærerbehandlede celler ved 24 timer (fig. 1B). Nivåer av p (Thr308) -AKT også gått ned med 100 nM MK-2206 behandling på både 4 timer og 24 timer (Fig. 1C). PRAS40 er et direkte substrat av AKT og nivåer av p (Thr246) -PRAS40 redusert ved MK-2206 behandling på 4 timer og 24 timer, noe som indikerer at AKT-aktivitet er redusert (fig. 1C). Neste, for å vise at MK-2206 var spesifikk for AKT-reaksjonsveien i PRB23 celler, nivåene av andre fosforylerte kinaser, som ikke er direkte mål av AKT ble målt. Nivåer av p (Thr202 /Tyr204) -ERK samt p (Thr183 /Tyr185) -JNK endret ikke på MK-2206 behandling enten ved 4 t eller 24 timer (Fig. 1C).
PRB- spesifikke Ishikawa (PRB23) celler ble behandlet med a) økende konsentrasjoner (0-1 uM) av MK-2206 i 24 timer og B) 100 nM MK-2206 i forskjellige tidsrom (0-24 h). Protein nivåer av p (Ser473) -AKT, AKT og aktin ble målt ved Western blot. C) PRB23 celler ble behandlet med 100 nM MK-2206 i 4 timer eller 24 timer og nivåer av p (Thr308) -AKT, AKT, s (Thr246) PRAS40, PRAS40, p (Thr202 /Tyr204) ERK, ERK, p ( Thr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK og aktin ble målt ved western blot.
Hemming av AKT Øker PRB protein nivåer
Interessant, behandling med MK-2206 resulterte også i en betydelig økning i pRb nivåer i PRB23 cellene, noe som indikerer at AKT påvirker nivået PR-protein i disse cellene (fig. 2A). Gitt den antagonistiske funksjon av progesteron i endometriet, implikasjonene av modulerende PR-nivåene er betydelig. Først ble en microarray utført for å identifisere PRB-regulerte gener i PRB23 celler. Nærmere bestemt PRB23-celler ble behandlet med 10 nM R5020 i 2 timer, og således bare den tidlige responsgener til progestiner ville bli identifisert. Totalt 70 gener ble signifikant oppregulert med mer enn 1,5 ganger og 16 gener ble nedregulert betydelig (Fig. 2B). De mest oppregulert gener var PDK4 (9,92 ganger), TIPARP (7,79 ganger), og SGK1 (4,41 ganger). Gener ble videre analysert med «funksjonell annotering clustering» verktøy fra Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) [26]. Genene ble kategorisert i henhold til SP-PIR nøkkelord database. Kategorien som inkluderte det høyeste antall gener som ble regulert av R5020 var «fosfoproteiner» og den nest høyeste var gener at produktene var knyttet til kjernen (Fig. 2C).
A) PRB-spesifikke Ishikawa (PRB23) celler ble behandlet med bærer, 100 nM MK-2206, 10 nM R5020, eller en kombinasjon av MK-2206 + R5020 (M + R) i 4 timer og proteinnivåer av p (Ser473) -AKT, AKT, pRb , og aktin ble målt ved Western blot. B) Microarray analyse av PRB23 celler behandlet med bærer eller 10 nM R5020 ble utført, og genene i betydelig grad regulert av 1,5-ganger eller større ble identifisert. C) Gene ontologi kategorier analyse ble gjort ved hjelp av DAVID for gener reguleres av mer enn 1,5 ganger av R5020.
Neste, påvirkning av AKT på PRB målgener ble undersøkt. PRB23-celler ble behandlet med 10 nM R5020 i nærvær eller fravær av 100 nM MK-2206. Uttrykk for PDK4 og SGK1 ble deretter målt ved real time PCR. PDK4 og SGK1 ble kategorisert som fosfoproteiner. Som vist i figur 3, ble begge PDK4 og SGK1 signifikant oppregulert ved R5020, og bekrefter mikroarray data. MK-2206 behandling alene ikke påvirke ekspresjon av hvilken som helst av genene som ble testet sammenlignet med bærer-behandlede celler. Når cellene ble behandlet i kombinasjon med R5020 og MK-2206, ekspresjon av PDK4 betydelig økt, men SGK1 uttrykk endret seg ikke med kombinasjonsbehandling sammenlignet med R5020 alene. Denne differensielle regulering av pRb målgener i PRB23 cellene når AKT hemmes sterkt antyder en mer komplisert mekanisme for å regulere gener enn bare økende nivåer av PRB protein.
PRB23 cellene behandlet med bærer, 10 nM R5020, 100 nM MK-2206, eller en kombinasjon av MK-2206 + R5020 (M + R) og genekspresjon av PDK4 og SGK1 ble målt ved bruk av sanntids-PCR. Data er presentert som brette endringer fra bæremiddelbehandlede prøver og representerer gjennomsnitt ± SEM av 6 uavhengige eksperimenter. «*» Betegner statistisk signifikans sammenlignet med bærerkontroll. P≤0.05.
MK-2206 og progesteron Reduserer Cell Livskraftig og tumorstørrelse
For å måle effekten av AKT og progestin på kreftcelle levedyktighet, PRB23 celler ble behandlet med R5020 i nærvær eller fravær av MK-2206 og cellelevedyktigheten ble målt. Mens R5020 og MK-2206 uavhengig redusert levedyktighet av celler i løpet av 5 dager kombinasjonen av R5020 og MK-2206 forårsaket den største reduksjon i levedyktighet (fig. 4).
PRB23 cellene behandlet med bærer, 100 nM R5020, 1 uM MK-2206, eller en kombinasjon av MK-2206 + R5020 (M + R) i 5 dager, og cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av Alamar blå analysen. Data er presentert som% levedyktighet fra bæremiddelbehandlede prøver og representerer gjennomsnitt ± SEM av 4 uavhengige eksperimenter.
Deretter effektene av progesteron og MK-2206 ble testet i xenopodet tumorer som utviklet seg fra subkutan injeksjon av PRB23 celler i nakne mus. Tumorene ble dyrket i 8 uker og ble deretter behandlet i 9 dager med kjøretøyet, progesteron, MK-2206, eller progesteron + MK-2206 (Fig. 5A). Vekt av mus ikke endres vesentlig med behandlinger (Fig. 5B). Sammenlignet med de mus som var behandlet med bærer, ble musene behandlet med MK-2206 alene eller progesteron alene oppviste små reduksjoner i deres tumorvolum basert på gangers endring fra svulststørrelsen før behandling. Den største reduksjon i tumorstørrelse ble observert i mus behandlet med både MK-2206 og progesteron (fig. 5C).
A) PRB23 celler ble xenopodet subkutant i nakne mus CD1. Etter 8 uker, ble musene behandlet med kjøretøy, 120 mg /kg MK-2206 muntlig, 3 ganger i uken i 9 dager, progesteron eller kombinasjon av MK-2206 og progesteron. B) Vekt av musene ble målt før og etter behandlinger og C) tumorene ble målt før og etter behandlingene, og volumet ble kalkulert. «*» Betegner statistisk signifikans sammenlignet med bærerkontroll. P≤0.05.
Immunhistokjemisk analyse ble gjort på kreftdelene med antistoffer mot progesteron reseptor, Ki67 og kløyvde caspase-3 (Fig. 6). Farging for PR var tydelig i svulstene, selv om ikke alle celler var positive for PR. Progesteron behandling reduserte nivåer av PR både i nærvær og fravær av MK-2206. I kontrast, fremmet MK-2206 behandling en økning i PR proteinnivået i svulstene, i likhet med det som ble observert i livmorkreftceller (Fig. 2A). Proliferasjon av cellene ble målt ved Ki67-proteinnivåer, som ble redusert med progesteron, MK-2206, så vel som kombinasjonen progesteron + MK-2206 behandling. De laveste nivåene av Ki67 farging ble observert med den kombinerte behandlingen, noe som tyder på at den kombinerte behandlingen reduseres mer effektivt spredning av kreftceller. Nivåer av kløyvde caspase-3, en indikator på apoptose, var ubetydelig i svulstene kjøretøy behandlet mus, mens flekker var tydelig i svulster progesteron eller MK-2206 behandlede mus. Den kombinerte behandlingen resulterte i det høyeste uttrykk for spaltet caspase-3, en indikasjon på økt apoptose.
xenopodet svulster ble fikset, forankret og seksjonert. Immunhistokjemisk farging av svulster for PR, Ki67 og kløyvet casapse-3 (CC3) ble utført.
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at MK-2206 effektivt reduserte nivåer av p (Ser473) -AKT og p (Thr308) -AKT i PTEN-mutert Ishikawa celler. Som et resultat av nivåer av p (Thr246) -PRAS40, en nedstrøms mål av AKT, reduseres også, noe som indikerer at aktiviteten av AKT ble inhibert med MK-2206. Dette hemmer ikke påvirke nivåene av andre kinaser, som f.eks ekstra fordel og pJNK viser spesifisitet for denne forbindelsen til den AKT pathway. Hemming av AKT også økte nivåer av PRB. Tidligere viste vi at en annen AKT-inhibitor, API-59CJ-OMe (EMD4Biosciences), også betydelig økt PR-nivåer i PRB23 Ishikawa-celler [8]. Gu et al., [27], nylig vist at inhibering av PI3K ved hjelp av LY294002 økte PR-nivåer i Ishikawa-celler. Påvirkningen av AKT sti på PR uttrykk og funksjon er ikke undersøkt i detalj og mekanismer som denne økningen i PR protein oppstår blir nå undersøkt i vårt laboratorium. Vår nåværende arbeidshypotese sentre på rollen til AKT i å redusere følsomheten til progesteron i livmorkreft. Avtagende PR nivåer var den første delen av bevis støtter vår hypotese. Det ble antatt at økt PR nivåer bør forbedre PR transkripsjonen funksjon, men data indikerer at PR handling er mer komplisert, siden ikke alle progesteron-regulerte gener ble påvirket av AKT hemming. Det er godt etablert at, i likhet med andre steroidhormonreseptorer, regulering av gener av PR omfatter en rekke interaksjoner med andre transkripsjonsfaktorer, DNA, coregulators og kromatin remodeling komplekser. PR handling er genet bestemt ved at ulike mekanismer er ansatt på ulike steder i kromatin. Vår microarray analyse identifisert PDK4 å være den mest oppregulert genet (mer enn 50 ganger økning) med korttids progestin behandling. Dette var også et gen som ble ytterligere øket med progestin da AKT ble hemmet, noe som indikerer at aktiv AKT i Ishikawa-celler demper progesteron handling på dette spesielle genet. Det har vist seg at PDK4 også er oppregulert ved glukokortikoider, gjennom GR, i HepG2-celler [28]. De viste at overekspresjon av PKBα avskaffet deksametason stimulering av PDK4 arrangøren som støtter våre funn. Videre viste de at FOXO1, som er direkte fosforylert av AKT og eksportert til cytoplasma, var nødvendig for GR-mediert oppregulering av PDK4. Vi har vist en samarbeids av PR og FOXO1 i regulerer gener i endometrial stromale celler [29], [30], [31], og således er det sannsynlig at PDK4 oppregulering av progestiner krever både PR og FOXO1 i endometrial kreft celler. Så når AKT er aktiv, utilstrekkelige nivåer av FOXO1 er tilgjengelig for å handle i kjernen og uttrykk for PDK4 dempes. Det ville være interessant å finne ut betydningen av PR og FOXO1 samarbeid i de andre progesteron-responsive gener som ble påvirket av AKT hemming i livmorkreft.
PDK4 er en kinase som inaktiverer pyruvat dehydrogenase komplekset (PDC) . PDC genererer acetyl-CoA, som er forløperen for syntesen av fettsyrer og energiproduksjon ved Krebs syklus. PDC-aktivitet er regulert av PDKs og PDC-fosfataser til å fosforylere eller dephosphorylate den E1A komponent av komplekset. Denne forskriften er viktig for å kontrollere blodsukkeret og fettstoffskiftet. Oppregulering av PDK4 av progestiner og en ytterligere forbedring av denne økningen på MK-2206 behandling antyder at progestiner kan virke til å inaktivere PDC og hemmer omdannelsen av pyruvat til acetyl-CoA. Denne hemming av acetyl-CoA produksjon kan derfor føre til utnyttelse av alternative metabolske veier som glykolyse. Gitt den sentrale rollen som PDK4 spiller ved regulering av valget mellom glykolyse og oksidativ fosforylering, er PDK4 vært implisert i en rekke forskjellige kreftformer. Det har tidligere blitt vist at inhibering av PDK-aktivitet er tilstrekkelig til å inhibere proliferasjonen og induserer apoptose i lungekreftceller, tyder på at PDKs kan drive tumorigenesis [32]. Imidlertid har nyere studier også vist at overekspresjon av PDK4 er tilstrekkelig til å inhibere proliferasjon av brystkreftceller, og at PDK4 ekspresjon nedregulert i en rekke forskjellige kreft vev [33]. Den spesifikke rolle som PDK4 spiller i livmorkreft gjenstår å tydes.
Prekliniske studier har vist MK-2206 til effektivt å hemme AKT vei samt redusere spredning og tumorvekst av ulike kreftcellelinjer [25]. Det har også vist seg at kombinasjonen av MK-2206 og kjemoterapeutiske midler er mer effektive i å hemme tumorvekst [25]. MK-2206 sammen med en MEK hemmer ble vist å ha en synergistisk effekt på tumorvekst og førte til økt overlevelse i mus med svært aggressive menneskelungesvulster [34]. MK-2206 var i stand til å gjenopprette sensitivitet av resistente celler til sorafenib, en tyrosinkinase inhibitor, for å indusere apoptose i leverkreft celler [35]. I kombinasjon med Gefitinib, et lite molekyl inhibitor av EGFR-tyrosinkinase-, MK-2206 effektivt fremmet apoptose i ondartet gliom [17].
