Abstract
microRNAs er små ikke-kodende RNA som fysiologisk modulerer proteiner uttrykk, og regulerer en rekke cellulære mekanismer. Endring av mikroRNA uttrykk er blitt beskrevet i kreft og er forbundet til tumor initiering og progresjon. Den mikroRNA 148a (MIR-148a) er ofte nedregulert i kreft. Vi har tidligere vist at dens nedregulering av DNA hypermethylation er en tidlig hendelse i bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) carcinogenesen, noe som tyder på en svulst undertrykkende funksjon. Her undersøker vi den potensielle rolle MIR-148a over-uttrykk i PDAC som et terapeutisk verktøy. Vi først rapportere konsekvensene av MIR-148a over-uttrykk i PDAC cellelinjer. Vi viser at Mir-148a over-uttrykk har ingen dramatisk effekt på celleproliferasjon og celle chemo-følsomhet i fire godt beskrevet PDAC cellelinjer. Vi undersøker også modulering av protein uttrykk ved en global proteomikk tilnærming (2D-DIGE). Vi viser at til tross for sin massive over-uttrykk, MIR-148a svakt modulerer protein uttrykk, og dermed hindre identifisering av protein mål i PDAC cellelinjer. Enda viktigere,
in vivo
data viser at moduler MIR-148a ekspresjon enten i epitel tumorceller og /eller i svulsten mikromiljøet ikke hindre tumorvekst. Til sammen viser vi her at Mir-148a ikke påvirker PDAC spredning både
in vitro Hotell og
in vivo
dermed tyder på en svak potensial som et terapeutisk verktøy.
Citation : Delpu Y, Lulka H, Sicard F, Saint-Laurent N, Lopez F, Hanoun N et al. (2013) The Rescue av MIR-148a Expression i kreft i bukspyttkjertelen: En Upassende Terapeutisk Tool. PLoS ONE 8 (1): e55513. doi: 10,1371 /journal.pone.0055513
Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 06.01.2012; Godkjent: 02.01.2013; Publisert: 31 januar 2013
Copyright: © 2013 Delpu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Institut National de la Santee et de la Recherche Medicale (INSERM, www.inserm.fr) og Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC, www.arc-cancer.net). Proteomikk studier ble støttet av Toulouse Proteomics Infrastruktur med økonomisk støtte fra «Association pour la Recherche sur le Cancer» (ARC-ARECA Program). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største dødsårsaken av kreft i vestlige land, mens den representerer bare 3% av nye tilfeller hvert år [1]. PDAC prognose ofte skyldes en mangel på tidlige spesifikke diagnostiske markører og ved fravær av effektive behandlinger. Til dags dato utgjør kirurgi den eneste kurative tilnærming for PDAC ledelse, men dreier seg om en liten undergruppe av pasienter på grunn PDAC aggressivitet og invasiv fenotype. For de resterende pasienter diagnostisert med lokalavansert eller metastatisk PDAC, er gemcitabin kjemoterapi standard palliativ behandling med beskjeden effekt på overlevelse [2]. Derfor har bemerkelsesverdige studier er utført for å belyse de viktigste hendelsene kjøre bukspyttkjertelen kreftutvikling, for å identifisere nye mål og utvikle tumorrettet behandling [3], [4]. Genetiske og epigenetiske forandringer har blitt beskrevet som en tidlig begivenhet i utviklingen av PDAC [5]. I det siste tiåret, betydelige verk fremhevet betydningen av slike molekylære endringer på microRNAs uttrykk i PDAC. MicroRNAs er små ikke-kodende RNA som hemmer oversettelsen av sine mål mRNA. De spiller en viktig rolle i kreftutvikling, invasivitet og motstand mot kjemoterapi [6].
Vi har tidligere vist at mikroRNA-148a uttrykk (MIR-148a) blir nedregulert tidlig under PDAC utvikling av hypermethylation av sin genomisk DNA sekvens [7]. Andre studier rapporterte nedregulering av MIR-148a-ekspresjon i andre kreftformer (
dvs. product::. Kolorektale, øsofageal, gastrisk kreft og kreft metastase) [8], [9], [10], [11]. Flere MIR-148a mRNA mål ble beskrevet i ulike typer kreft. Disse målene omgruppere cellesyklus, apoptose eller DNA metylering effektorer.
Tidligere studier vakte en svulst undertrykkende effekt påfølgende til en over-uttrykk for MIR-148a i tykk- og magekreft cellelinjer utvunnet [8], [10 ]. Følgelig til denne studien rettet avgjøre om å gjenopprette MIR-148a uttrykk konsekvenser PDAC spredning både
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og derfor kunne bli foreslått som et terapeutisk verktøy.
Materialer og metoder
Cell kultur
menneske~~POS=TRUNC PDAC CAPAN-2 og IMIM-PC2 cellelinjer ble dyrket i RPMI medium supplert med 100 ml /L føtalt kalveserum, L-glutamin (2 mM ) (Life Technologies), antibiotika og antimycotic cocktail (Life Technologies) og Plasmocin® (5 mikrogram /ml) (InvivoGen). MIA PACA-2 og PANC-1 PDAC celler og humane embryonale nyre HEK-293ft-celler ble dyrket i DMEM inneholdende 4,5 g /l glukose (Life Technologies), 100 ml /l føtalt kalveserum, L-glutamin, antibiotika, og Fungizone® Plasmocin® (InvivoGen). Humane PDAC-avledet BxPC-3-celler ble dyrket i DMEM inneholdende 1 g /l glukose (Life Technologies), 100 ml /l føtalt kalveserum, L-glutamin, antibiotika og antimykotiske cocktailer. Human bukspyttkjertel nestin positive Epitelceller (HPNE) ble dyrket i DMEM 75% 4,5 g /l glukose (Life Technologies), 25% middels M3 base (Incell Corp.), føtalt bovint serum 5%, 10 ng /ml humant rekombinant EGF ( Sigma-Aldrich) og 750 ng /ml gentamycin (Life Technologies). Alle cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) er forventet for HPDE celler og HPNE celler som er slag gaver fra Dr. M.S. Tsao (University of Toronto, Canada) og Dr. M. Ouellette (University of Nebraska Medical Center, Omaha, USA), henholdsvis [12], [13]. IMIM-PC2 celler ble hentet fra Dr FX Fast (Spanish National Cancer Research Centre, Madrid, Spania).
Cell transfeksjon
For all
in vitro
eksperimenter, speil 148a pre-Mir ™ miRNA forløpere (ambion) på 25 nM og 50 nM ble transfektert hjelp SIPORT ™ NeoFX ™ Transfeksjon Agent (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. Cy ™ 3 fargestoff-merket Pre-MIR ble anvendt som negativ kontroll, og ble transfektert ved bruk av de samme betingelser.
cellesyklusanalyse ved strømningscytometri
Transfekterte CAPAN-2-celler ble samlet opp, skylt en gang i fosfat-bufret saltvann (PBS) og fiksert i iskald 70% etanol over natten ved 4 ° C. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering ved 1,000 g og skylt med PBS. Celler ble merket med propidiumjodid (Life Technologies) etter produsentens anbefalinger. Cellesyklus distribusjon ble vurdert ved hjelp av BD FACS Calibur apparat (Beckton Dickinson) og Cell søken pro programvare (Beckton Dickinson) som beskrevet av Hanoun
et al.
[14].
2D-DIGE elektroforese
Cell lyse ble utført i Urea 8M, Thiourea 2M, CHAPS 4%, pH 8,5. Etter opprydding nedbør (2D Clean Up kit, GE Healthcare), ble proteiner resuspendert i 2D-DIGE sample buffer (Urea 8M, Thiourea 2M, CHAPS 4%, pH 8,5). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt med 2D Quant kit (GE-Healthcare). Femti mikrogram proteiner ble merket med 400 pmol CyDye DIGE Fluor Minimal Fargestoffer (GE Healthcare) og inkubert på is i mørket i 30 minutter i henhold til produsentens instruksjoner. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 pl av 10 mM lysin og inkubert på is i 10 min. Den differensielt Cy-3 og Cy-5 merkede prøver ble blandet med den Cy-2-merket intern standard (prøve sammensatt av like aliquoter av hver prøve av eksperimentet) og isoelektrisk fokusering (IEF) re-hydratation buffer (urea 8M, Tiourea 2M , CHAPS 2%, 10 mM DTT, 1,2% IPG (Immobilisert pH-gradient) buffer, pH 4-7, GE Healthcare) ble tilsatt til 350 ul. For 2D-DIGE analyse ble IEF utført ved hjelp av en IPGPhor 2 apparat (GE Healthcare) i henhold til produsentens anbefalinger med immobilisert pH-gradient (IPG) pH 4-7, 18 cm. Strimler ble først inkubert i ekvilibreringsbuffer (Urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCl 50 mM pH 8,6, glycerol 30%, bromfenolblått spor) inneholdende 1% DTT i 15 minutter og deretter i den samme buffer med 4,5% jodacetamid, i 15 min i mørket. Strimlene ble lagt på toppen av 12,5% akrylamidgeler og løp på 1 W /time i 1,5 timer og ved 15 W /h inntil bromfenolblått når bunnen ende av gelen. De geler ble skannet med en Typhoon trio Imager (GE Healthcare) på 100 mikrometer oppløsning med λex /em av 488/520, 532/580, og 633/670 nm for Cy-2, Cy-3 og Cy-5, henholdsvis. Bildeanalyse ble utført ved hjelp DeCyder 6.5 programvare (GE Healthcare).
Plasmider
pLVMND-sluc plasmid som koder for utskilt Gaussia Luciferase (Gluc) ble vennlig levert av Cayla-InVivoGen (Toulouse, Frankrike ). Lentiviral uttrykk vektor koding MIR-148a og copGFP (pMIRNA1-miR148a) eller copGFP alene (pMIRNA1-GFP) ble hentet fra Biovalley (Marne-la-Vallée, Frankrike). Plenti6-TR, som koder for TET repressor, ble hentet fra Life Technologies. For den induserbare uttrykk for MIR-148, to delvis komplementære oligonukleotider tilsvarende modne MIR-148a eller en kontroll egge MIR (MIR-CT) ble hybridisert og klonet inn pcDNA6.2-GW /emGFP-Mir vektor (Life Technologies) før rekombinasjon inn pLenti4 /TO /V5 MÅL vektor (Life Technologies) med Gateway® strategi. For lentivectors produksjon, ble emballasje plasmider pHCMV-G, koding for VSV-G protein, og pCMVΔ8.91, koding for HIV-1 tilbehørs proteiner, vennlig donert av Dr. A. Dubart-Kupperschmitt (Paris, Frankrike).
lentiviral vektor produksjon
Alle replikering defekte, selv inaktivere lentiviral vektorer ble generert i en BSL-3 anlegg (Vectorology plattform, INSERM U1037 Cancer Research Center i Toulouse, Toulouse, Frankrike) som tidligere beskrevet av Torrisani
et al.
[15]. Kort sagt ble transient transfeksjon av HEK-celler 293ft med emballasje og lentivirale vektorplasmider utført ved anvendelse av kalsiumfosfat utfelling. pLenti4 /TO /GFP-MIR-148a, pLenti4 /TO /GFP MIR-CT ble brukt for å lentiviral partikler som koder induserbar MIR-148a eller MIR-CT (nemlig LV-TO-MIR-148a eller LV-TO-speil henholdsvis CT,). På den annen side ble pMIRNA1-miR148a og pMIRNA1-GFP anvendes for å oppnå lentivirale partikler konstitutivt som koder for MIR-148a eller MIR-CT (LV-MIR-148a eller LV-GFP, henholdsvis). Plenti6-TR og pLVMND-sluc plasmider ble anvendt for å oppnå lentivirale partikler som koder for Tet repressor eller det utskilte luciferase (LV-TR eller LV-Gluc, henholdsvis). Alle satser ble bekreftet replicative virusfri. De virale titere ble bestemt på HT-1080-celler og uttrykt i transduksjon enhet /ml (TU /ml) som beskrevet andre steder. I tillegg ble vektor konsentrasjoner kvantifisert ved p24 ELISA (Innotest, INGEN, Paris).
Generering av MIA PACA-2 stabil cellelinje over-uttrykker Mir-148a
MIA PACA-2 celler ble inkubert med LV-TR lentivirale partikler (multiplisitet av infeksjon = 5) i 24 timer og deretter velges med blasticidin (Invivogen, Toulouse, Frankrike) ved 100 ug /ml i 2 uker og klonet ved seriefortynning for å oppnå MIA PACA-2- TR celler. MIA PACA-2 TR celler ble ytterligere transducted av LV-Gluc (mangfold av infeksjon = 5) og klonet ved seriefortynning å gi MIA Pac-2 TR-Gluc celler. De sistnevnte celler ble inkubert med LV-TO-MIR-148a eller LV-TO-MIR-CT (mangfold av infeksjon = 5) i 24 timer, og valgt med zeocin (Invivogen) på 100 mikrogram /ml i 3 uker og klonet ved serie fortynning å generere MIA Paca-2 TR-Gluc MIR-148a og MIA PACA-2 TR-Gluc MIR-CT cellelinjer, henholdsvis. En optimal doxycyklin konsentrasjon på 1 mg /ml ble bestemt å indusere en maksimal uttrykk for MIR-148a. De forskjellige stabile cellelinjer ble deretter stadig dyrket i nærvær eller fravær av doxycyklin.
Måling av MIR-148a-ekspresjon ved QRT-PCR
Celler ble først transient transfektert eller stabilt transducted som beskrevet over. Total RNA ble isolert fra cellelinjer med TRIzol reagens (Life Technologies) i henhold til leverandørens anvisninger. RNA-konsentrasjonen ble målt med et Nanodrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Den miScript PCR System (Qiagen) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner for å kvantifisere modne microRNAs fra 1 mikrogram total RNA. U6 og 5S RNA ble brukt som intern kontroll. cDNA prøvene ble fortynnet 1 til 100 for mikroRNA påvisning eller U6 og en til 10.000 for 5S RNA deteksjon. Duplicate QRT-PCR-analyser ble utført i en StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) med SYBR Grønn PCR Master Mix (Qiagen). Relative mengdene av miRNA ble beregnet ved sammenlignende terskelen syklus (CT) metode som 2-ΔCT, hvor ΔCT = CTmiRNA -. CT geometrisk gjennomsnitt av U6 og 5S
spredningsanalyse
MiR-148a forløper eller Cy ™ 3 fargestoffmerkede negativ kontroll forløperceller transfekterte celler ble sådd ut på 6 x 10
3 celler pr brønn i en 96 brønners skål og dyrket i fullstendig medium. Antall levedyktige celler ble bestemt ved kolo metode med CellTiter 96® vandig ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner på dag 4. For måling spredning, ble cellene sådd på 5 × 10
4 celler per brønn en 35 mm retter. Celler ble dyrket i fullstendig medium supplementert med 1 ug /ml doksycyklin. Fem hundre nanogram doksycyklin ble tilsatt i 48 timer for å hindre at den forråtnelse i kulturmedium. Cellene ble telt med en Coulter teller modell ZM (Beckman Coulter) etter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer av kultur.
gemcitabin følsomhet analysen
Twenty fem tusen eksponentielt voksende MIA Paca -2-celler som stabilt uttrykker Mir-148a eller kontrollere mikroRNA vokst med eller uten doksycyklin ble sådd ut i 35 mm retter. Tjuefire timer senere ble cellene behandlet med gemcitabin (Eli Lilly) i forskjellige doser varierende fra 1 x 10
-9 M til 1 x 10
-4 M. Etter 72 timers behandling, ble cellene tellet ved bruk av Coulter teller modell ZM (Beckman Coulter). Gemcitabin «Lethal konsentrasjon 50» (LC
50) er konsentrasjonen av gemcitabin for hvilken 50% av behandlede celler døde relativt til ubehandlede celler ved 96 timer. For måling av gemcitabin følsomhet i celle transient over-uttrykker MIR-148a, 1000 av eksponentielt voksende celler PDAC transient over-uttrykker MIR-148a eller et kontroll mikroRNA (MIR-CT) ble platet i 96-brønners plate. Celler ble behandlet med forskjellige doser av gemcitabin som varierer fra 1 x 10
-9 M til 1 x 10
-4 M i 72 timer. For hver cellelinje, ble cellenes levedyktighet bestemt ved kolorimetrisk metode, sammenlignet med levedyktighet målt i 1 x 10
-9 M behandlede brønner og representert som en prosentandel av overlevende celler.
migrering og invasjon assays
Ett hundre tusen eksponentielt voksende celler over-uttrykker Mir-148a eller GFP reporter protein ble serum-sultet i 24 timer og sådd inn i 24 godt plate store innsatser (8 mikrometer porøse 24 brønners format innsatser for migrasjon analyser og Biocat Matrigel invasjonen kamre for invasjon analyser, BD Falcon) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 15 timer ble migrerte celler farget med 1% krystallfiolett i 20% metanol løsning, lysert og celletettheten ble bestemt ved optisk tetthet måling av cellelysater ved 560 nm. Resultatene er uttrykt som prosentandel av trekkende eller invadere MIR-148a over-uttrykkende celler i forhold til GFP uttrykker cellene.
ortotopiske celle pode
Åtte uker gamle SCID /beige CB 17 lekk mus ( TAKONIC) ble anvendt for celle pode-eksperimenter. Hver mus mottok 12 x 10
6 av eksponentielt voksende MIA PACA-2-celler som stabilt overuttrykk MIR-148a i 100 ul PBS injisert i halen i bukspyttkjertelen. Injeksjoner ble utført med en 29 måler lymfografi kateter satt med en 29 måler insulin nål. Mus podet med MIR-148a uttrykker cellene fikk vann
ad libitum
supplert med sukrose (25 g /l) og doksycyklin (2 g /L). Kontrollmus mottok vann
ad libitum
supplert med sukrose bare (25 g /L). Tretti dager etter xenograft, ble musene avlivet og tumorene ble fjernet, veid og målt. Tumorvolumet ble bestemt ved formelen ((Tumor lengde) x (tumorbredde
2)) /2. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i diagrammet for omsorg og bruk av forsøksdyr i INSERM. Alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi, og hver innsats ble gjort for å minimere lidelse. Alle protokoller inkludert dyr ble godkjent av ANEXPLO etikk komité. Makroskopisk observasjon av svulster ble utført av en dyktig patolog.
In vivo
svulst transduksjon av MIA PACA-2 svulster
ortotopiske svulster ble etablert i SCID CB17 mus bukspyttkjertelen ved injeksjon av 12 x 10
6 av eksponentielt voksende MIA PACA-2-Gluc (som beskrevet ovenfor). Svulster ble dyrket i 15 dager før injeksjon av 250 ng p24 av LV-miR148a lentivector ved hjelp av en 29 måler lymfografi kateter satt med en 29 måler insulin nål. LV-GFP ble injisert i kontroll mus. Tumorprogresjon før og etter transduksjon ble overvåket ved måling av Gluc nivå i mus serum (som beskrevet nedenfor) og ved abdominal palpasjon.
Luciferase-aktivitet i museserum
Luciferase-aktivitet ble målt fra mus serum . Blod ble samlet opp fra retro-orbital sampling ved hjelp av Pasteur kapillær pipette (VWR) forhåndsfylt med 10 ul av en 20% EDTA-oppløsning. Blodprøvene ble holdt på is inntil sentrifugering. Prøvene ble sentrifugert 3,000 g i 15 min ved 4 ° C og serum ble oppsamlet og lagret -20 ° C inntil bruk. Luciferase-aktiviteten ble bestemt fra 5 ul av serum og 45 pl av en 50 uM løsning coelenterazine (Fluka analytisk) på en Luminoskan stigning anordning (Thermo Scientific).
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil. Den statistiske signifikans av forskjeller ble målt med Mann-Whitney ikke parametrisk test, med en
p
verdi 0,05 ansett som statistisk signifikant. Symbolet * indikerer en
p
verdi 0,05, ** indikerer en
p
verdi 0,01 og *** angir en
p
verdi. 0,005
Resultater
Effekt av forbigående MIR-148a over-uttrykk på PDAC cellevekst
Vi har tidligere rapportert at Mir-148a uttrykk er undertrykt av DNA hypermethylation av sin genomisk sekvens i PDAC celle linjer og tumorer [7]. Man kan spekulere at tapet av MIR-148a uttrykk er avgjørende for PDAC utvikling. For å vurdere kreft undertrykkende effekter av MIR-148a i PDAC, CAPAN-2, PANC-1, ble MIA PACA-2 og BxPC-3 PDAC cellelinjer transfektert med en MIR-148a oligonukleotid forløper (MIR-148a) eller en kontroll forløper ( MIR-CT). HPNE celler som er humane pankreatiske celler som viser en normal fenotype ble anvendt som «ikke-kreft» kontrollceller. Celleproliferasjon ble målt ved kolorimetrisk metode 4 dager etter transfeksjon. MiR-CT-transfekterte celler ble anvendt som intern referanse for hver cellelinje (figur 1A). Transfeksjonseffektiviteten ble vurdert for hver cellelinje ved Cy3 fluorescens-måling og nådde 90-100% (data ikke vist). Resulterer MIR-148a uttrykk ble målt ved QRT-PCR (figur S1 A). MiR-148a over-uttrykk i HPNE bukspyttkjertelen normale celler induserte ikke signifikante endringer i celleproliferasjon. På lignende måte ble ingen signifikant endring i celleformering observert i de fire PDAC cellelinjer sammenlignet med kontroll Cy3 transfekterte celler. Parallelt ble cellesyklusfordelingen i CAPAN-2-celler bestemt ved FACS-analyse (figur 1B). Ifølge fravær av virkning om cellulær proliferasjon, ble ingen endringer i cellesyklusfordeling ble observert i MIR-148a transfekterte celler sammenliknet med MIR-CT-celler. Disse resultatene indikerer at transient MIR-148a over-ekspresjon ikke har noen særlig virkning på celleformering av fire PDAC cellelinjer.
(A) CAPAN-2, PANC-1, MIA PACA-2 og BxPC-3 PDAC avledede cellelinjer og ikke-kreft HPNE cellelinje ble transient transfektert med MIR-CT eller MIR-148a forløpere. Fire dager etter transfeksjon, ble cellenes levedyktighet bestemt ved kolorimetriske metoder. For hver cellelinje, ble det MIR-148a-celle-levedyktighet i forhold til MIR-CT cellenes levedyktighet (100%). Resultatene er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (± SEM) og er uttrykt som prosentandel av cellelevedyktigheten til kontrollceller. (B), ble cellesyklusfordelingen målt ved propidiumjodidfarging fulgt av FACS-analyse 72 timer etter transfeksjon av CAPAN-2-celler med MIR-CT eller MIR-148a forløpere.
Effekt av stabil speil 148a over-ekspresjon på PDAC cellelinje oppførsel
i tillegg til forbigående transfeksjon eksperimenter, genererte vi Tet-ON-baserte lentivirale partikler for stabil ekspresjon av MIR-148a for å forhindre rask oligonukleotid nedbrytning og for å tillate en langvarig etter -up av cellulære hendelser i PDAC cellelinjer. Vi transducted MIA PACA-2 celler på grunn av deres lave uttrykk nivå av endogen MIR-148a [7]. I disse cellene, fører doxycycline behandling til en fem-ganger økning i MIR-148a uttrykk, sammenlignet med MIR-CT over-uttrykke celler (figur S1B). Imidlertid ikke stabil ekspresjon av MIR-148a ikke føre til vesentlige endringer i cellulær proliferasjon i disse cellene, når sammenlignet med kontrollceller (figur 2). I tillegg migrering og invasjon potensialet av celler som over-uttrykker MIR-148a ble målt og sammenlignet med kontrollceller (figur S2). Her observerte vi at Mir-148a overuttrykk endrer ikke disse to cellefunksjoner i vår MIA Paca-2 cellelinje modell. Til sammen viser vi at på samme måte som forbigående over-uttrykk, langvarig uttrykk for MIR-148a er ineffektiv for hemming av PDAC celleproliferasjon og påvirker ikke celle atferd
in vitro
.
MIA PACA-2-celler ble inkubert med induserbar lentiviral vektorer koding for rykke mikroRNA (MIR-CT) eller MIR-148a (MIR-148a). MIA PACA-2 MIR-CT eller MIR-148a proliferasjonsrate ble vurdert i nærvær eller fravær av doksycyklin i dyrkingsmedium. For hver tilstand, ble celletall utføres hver 24. time, og i forhold til antall heftende celler på dag 1. Resultatene er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter (± SEM).
gemcitabin følsomheten PDAC cellelinjer over-uttrykker Mir-148a
Det har blitt foreslått tidligere at microRNAs kan påvirke kjemosensitivitet ved å målrette legemiddeltransportører eller svekke mobil vei avgjørende for legemiddelmetabolisme eller celle overlevelse [16]. Som beskrevet ovenfor, er gemcitabin referanse kjemoterapi for PDAC. Vi vurderte om MIR-148a deltar i PDAC celler følsomhet mot dette stoffet. Vi først merke ingen signifikant korrelasjon mellom MIR-148a endogent nivå (figur 3A) og gemcitabin følsomhet i flere PDAC cellelinjer (figur 3B). Parallelt vurderes vi gemcitabin følsomhet i MIA PACA-2 celler stabilt over-uttrykker Mir-148a eller en MIR-CT (Figur 3C). Resultatene oppnådd fra tre uavhengige analysene indikerer en ikke-signifikant reduksjon i den dødelige konsentrasjon 50 verdi (LC50) av gemcitabin i nærvær av MIR-148a i forhold til kontrollceller. Lignende resultater ble oppnådd etter forbigående transfeksjon av MIR-148a i flere PDAC cellelinjer (figur S3). Til sammen indikerer disse resultatene at MIR-148a ikke dramatisk påvirke PDAC cellelinjer følsomhet mot gemcitabin.
(A) MIR-148a endogen ekspresjon nivået ble målt ved QRT-PCR i flere PDAC cellelinjer og i hPDE og hPNE normale bukspyttkjertelen cellelinjer. (B) Celle følsomhet for gemcitabin ble målt etter en 72 timers behandling i flere PDAC cellelinjer og i normale hPNE bukspyttkjertelen celler. Overlevende cellefraksjon representerer antallet av behandlede celler i løpet av 72 timer sammenlignet med antallet av ubehandlede celler (representert som 100%). Den letale konsentrasjon 50 (LC50) angir den dose av gemcitabin tilstrekkelig for å oppnå 50% av overlevende celler i forhold til ubehandlede celler. Resultatene er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter (± SEM). (C) Cell følsomhet for gemcitabin ble målt i MIA PACA-2 celler stabilt over-uttrykker Mir-148a (LV-TO-MIR-148a) eller en kontroll MIR (LV-TO-MIR-CT) til gemcitabin i nærvær av doksycyklin etter en 72 h-behandling. Overlevende cellefraksjon representerer antallet av behandlede celler i løpet av 72 timer sammenlignet med antallet av ubehandlede celler (representert som 100%). Resultatene er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter (± SEM).
Protein uttrykk profilanalyse etter transient MIR-148a over-uttrykk
Hver mikroRNA kan potensielt påvirke oversettelsen av dusinvis av mRNA mål i henhold til bevaring av sine mål sekvens [6]. Fraværet av cellulære effekter etter MIR-148a over-ekspresjon kan forklares både ved en svak endring i proteinekspresjon profil, utilstrekkelig til å gi en cellulær effekt, eller ved oppregulering av en redning molekyl vei, påfølgende til MIR-148a target forfall. Derfor utførte vi en stor skala analyse av protein uttrykk profiler ved 2D-DIGE etter transient MIR-148a over-uttrykk i CAPAN-2 celler. CAPAN-2-celler transfektert med MIR-CT ble anvendt som kontroll. Fluorescens analyse av 2D-gels avdekket at Mir-148a over-uttrykk bare resulterer i en svak modulering av ca 2200 protein uttrykk når sammenlignet med kontrollceller (figur S4). Ingen av disse variasjonene nådd cut-off verdi (1,5 gangers forandring i forhold til kontroll transfekterte celler) til tross for en massiv over-ekspresjon av MIR-148a (figur S1A). Følgelig ble det ikke proteinarter identifisert ved massespektrometri.
Disse resultater indikerer at MIR-148a ikke skiller seg dramatisk å påvirke protein ekspresjonsprofiler i CAPAN-2-celler som kan forklare fraværet av biologiske effekter påfølgende til sin spissen ekspresjon.
in vivo
effekter av MIR-148a over-uttrykk
for å finne ut om MIR-148a kan påvirke tumorvekst
in vivo
, genererte vi ortotopiske PDAC svulster i SCID CB17 mus ved bruk MIA PACA-2 celler stabilt over-uttrykker Mir-148a med 5 ganger (figur S1B). Disse cellene konstitutivt uttrykke Gaussia luciferase (Gluc) for ikke-invasiv sporing av tumorvekst. Som beskrevet av Chung og medarbeidere, Gluc kvantifisering i serum nøyaktig gjenspeiler mengden av levedyktige kreftceller i xenografttumorer [17]. For
in vivo
studier ble Gluc samplet hver 5. dag og mus ble avlivet etter 33 dager, ifølge tumor størrelse anslått av abdominal palpasjon. Korrelasjonen mellom tumorvekten og Gluc signal (R «sup> 2 = 0,79) ble bekreftet etter tumor-reseksjon og sammenligning med Gluc dosering i serum samplede operasjonsdagen (figur S5).
I løpet av denne eksperiment, fant vi at Gluc nivåene ikke ble endret ved MIR-148a uttrykk som indikerer at Mir-148a ikke hemmer PDAC tumorprogresjon
in vivo plakater (Figur 4A). I samsvar med disse funn analyse av tumorer etter kirurgi ikke klarte å avdekke MIR-148a hemmende effekter på tumorvekt (Dox: 0,368 g ± 0,16 g
vs
Ubehandlet: 0,348 g ± 0,22 g) (figur 4B). Videre histologisk studium av tumorene indikerer ingen forskjell i vev organisasjon mellom de forskjellige gruppene (figur S6). Disse observasjonene indikerer ingen dramatisk effekt av MIR-148a uttrykk på tumorvekst eller utvikling svulstvev
in vivo
(A)
In vivo
overvåking av xenograft tumor progresjon.: MIA PACA-2 celler uttrykker Mir-148a og utskilles Gaussia luciferase (Gluc) ble injisert i bukspyttkjertelen av SCID-mus. Mus fikk vanlig vann (ubehandlet, n = 10) eller vann supplert med doksycyklin (doksycyklin, n = 12) for MIR-148a uttrykk induksjon til offer. Gluc nivåene ble målt i mus serum. Resultatene er gjennomsnittet av Gluc aktiviteter (± SEM) og er uttrykt som vilkårlig Lys Unit (A.L.U.). (B) Svulster ble fjernet og veid operasjonsdagen. Resultatene er gjennomsnitt (± SEM) av tumorvekt i den ubehandlede gruppen (n = 10) og doksycyklin behandlede gruppen (n = 12) (C)
In vivo
overvåking av xenograft tumorprogresjon: MIA PACA-2- -celler som uttrykker utsondret Gaussia luciferase ble injisert i bukspyttkjertelen av SCID-mus (n = 10). Femten dager senere, lentivirale vektorer som koder MIR-148a (MIR-148a, n = 7) eller GFP bare (GFP, n = 3) ble injisert i tumorene (pilen indikerer lentivirale partikler injeksjon). Mengden av Gluc ble målt i mus serum og sammenlignet med den Gluc mengden målt dagen for lentivector injeksjon (dag 0). Resultatene er gjennomsnittet av Gluc nivå forholdet i hver gruppe (± SEM) og uttrykkes som en vilkårlig lysenhet forhold. (D) Svulster som fikk MIR-148 (MIR-148a, n = 7) eller GFP (GFP, n = 3) ble fjernet 10 dager etter lentiviral injeksjon og ble vektet. Grafen representerer sammenligningen av tumorvekt som uttrykker MIR-148a (n = 7) eller GFP (n = 3). Resultatene er gjennomsnittet av tumor vekt i hver gruppe (± SEM).
In vivo
måling av MIR-148a terapeutisk potensial
For å vurdere en anti -tumor potensialet i en akutt MIR-148a over-uttrykk i både kreftceller og mikromiljøet, injiserte vi lentiviral partikler som koder MIR-148a (LV-MIR-148a) i pre-etablerte MIA Paca-to-Gluc svulster innpodet i bukspyttkjertelen av SCID CB17 mus. Lentiviral partikler som koder GFP rapportørprotein (LV-GFP) ble anvendt som kontroll. MiR-148a over-uttrykk i LV-MIR-148a-injisert svulster ble verifisert ved QRT-PCR (figur S7). Tumor progresjon ble overvåket ved Gluc sampling i mus serum. En reduksjon i Gluc signal ble observert i løpet av 5 dager etter tumor-transduksjon for begge partikler (figur 4C). Fra dag 5 til dag 10, Gluc nivåene var strengt lik i MIR-148a og kontroll-transducted svulster, som viser ingen forskjell i tumorviabilitet følgende lentiviral vektorer injeksjon. I samsvar med Gluc dosering, resected tumor vekter på dag 10 er like i LV-MIR-148a og LV-GFP-transducted grupper (LV-MIR-148a: 1,77 g ± 0,30 g
vs
LV-GFP: 1,97 g ± 0,63 g) (Figur 4D). Disse resultatene indikerer at Mir-148a genoverføring i både svulstvev og mikromiljøet ikke påvirker tumorviabilitet og avslører ingen spesiell terapeutisk potensiale.
Diskusjoner
MiR-148a uttrykket er endret på flere typer kreft og dens nedregulering er godt beskrevet i ulike faste tumorer så som colorektal, ovarie, prostata og gastrisk kreft [8], [11], [18], [19].
