Abstract
Helicobacter pylori product: (
H
.
pylori
) er en spiralformet Gram-negative bakterien som forårsaker den vanligste kroniske infeksjon i magesekken hos mennesket. Omtrent 1% -3% av smittede personer utvikle magekreft. Men de mekanismer som
H
.
pylori
induserer magekreft er ikke helt forstått. Den tilgjengelige bevis indikerer en sterk sammenheng mellom virulens faktor på
H
.
pylori
, cytotoxin-assosiert gen A (CagA), og magekreft. For ytterligere å karakterisere
H
.
pylori
virulens, etablerte vi tre cellelinjer ved å infisere mage kreft cellelinjer SGC-7901 og AGS med
CagA
+
H
.
pylori Hotell og trans SGC-7901 med en vektor som bærer den fulle lengde
CagA
genet. Vi oppdaget 135 ulikt uttrykte proteiner fra de tre cellelinjene med proteom- teknologi, og 10 differensial proteiner som er felles for de tre cellelinjene ble valgt og identifisert ved LC-MS /MS samt verifisert av western blot: p-aktin, L-laktat dehydrogenase (LDH), dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), pre-mRNA-prosessering faktor 19 homolog (PRPF19), ATP syntase, calmodulin (CAM), P64 CLCP, Ran-spesifikke GTPase aktiverende protein (RanGAP), P43 og calreticulin. Påvisning av uttrykket av disse proteinene og gener som koder for disse proteinene i menneskelige mage kreft vev ved real-time PCR (RT-qPCR) og western blot viste at uttrykket av
β-ACTIN
,
LDH
,
DLD
,
PRPF19 Hotell og
Kamera
gener ble oppregulert og
RanGAP
ble nedregulert i mage kreft vev og /eller metastatisk lymfeknuter i forhold til peri-cancerous vev. Høy genekspresjon ble observert for
H
.
pylori
infeksjon i mage kreft vev. Videre
LDH
,
DLD Hotell og
Kamera
gener ble demetylert ved arrangøren -2325, -1885 og -276 nettsider henholdsvis, og
RanGAP
genet ble svært metylert ved arrangøren -570 og -170 steder i
H
.
pylori
-infected og
CagA
-overexpressing celler. Disse resultatene gir ny innsikt i de molekylære patogenese og behandlingsmålene for magekreft med
H
.
pylori
infeksjon
Citation. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) proteomikk-Based Identifikasjon og analyse av proteiner assosiert med
Helicobacter pylori
i magekreft. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10,1371 /journal.pone.0146521
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 15 september 2015; Godkjent: 19 desember 2015; Publisert: 08.01.2016
Copyright: © 2016 Zhou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326), Guizhou-provinsen foundation (QianJiaoHe [2014] 06) og Key Prosjekt of Science and Technology of Guizhou provinsen (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). I den opprinnelige versjonen ble arbeidet støttet av National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326) og Key Prosjekt of Science and Technology i Guizhou-provinsen (QianKeHe SY (2011) 3067)
Konkurrerende interesser:. Den forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Helicobacter pylori product: (
H
.
pylori
) forårsaker mest vanlig kronisk mageinfeksjon hos mennesker over hele verden. Omtrent halvparten av verdens befolkning er smittet med
H
.
pylori
, og flertallet av koloniserte individer utvikler asymptomatisk gastritt. Blant smittede personer, ca 10% -20% av individer utvikler magesår sykdommer og 1% -3% utvikle magekreft [1,2]. I 1994
H
.
pylori
ble klassifisert som en type jeg karsinogen for magekreft av Verdens helseorganisasjons International Agency for Research on Cancer.
Magekreft er en av de mest vanlige typer kreft, og mer enn 70% av nye tilfeller og dødsfall forekommer i utviklingsland [3]. Selv om den globale forekomsten har vært fallende i flere tiår, fortsatt magekreft utbredt i de fleste utviklingsland, inkludert Japan, Korea og Kina [4-6]. I 2012, den kinesiske Kreftregisteret Årsrapport indikerte at magekreft sykelighet og dødelighet er andre og tredje blant alle ondartede svulster, henholdsvis.
De fleste av
H
.
pylori
stammer bære
CAG
patogenitet øya (
CAG
PAI), som inneholder 27 til 31 gener som koder for en bakteriell type 4 sekresjon system (T4SS) [7] . Den cytotoksin-assosierte gen A-genet (
CagA
), som ligger i 3′-enden av
cag
PAI, koder den eneste kjente bakterielle oncoprotein, CagA, som blir translokert inn i vertsceller av T4SS etter bakteriell vedlegg til magen. Gang inne i vertscellene, CagA er tyrosin-fosforylert av medlemmer av Abl og Src kinase-familien, og virker sammen med en rekke intracellulære effektorer, som fører til aktivering av nedstrøms signalmolekyler [8]. I kliniske studier,
CagA
-positive stammer har vært konsekvent knyttet til mer alvorlige mage betennelse og sår, og en liten brøkdel av enkeltpersoner utvikle magekreft [9]. Imidlertid har mekanismene bak foreningen av CagA med kreft ikke er klarlagt.
Proteomics har dukket opp som en lovende teknologisk plattform for rasjonell identifikasjon av biomarkører og nye terapeutiske mål for sykdommer og fastsettelse av de underliggende mekanismene for kreftutvikling [10]. Men de fleste av de viktige proteiner som detekteres av proteomforskning in vitro er ikke blitt bekreftet in vivo i kliniske prøver.
DNA metylering og demetylering spiller en viktig rolle i utvikling og progresjon av kreft ved å blokkere binding av transkripsjonsfaktorer til DNA og er nesten utelukkende forekommer i genet promotor CpG øyer [11-13]. Blant organer, viser magen den høyeste frekvensen av unormal CpG island metylering, muligens
H
.
pylori
formidlet [14-16]. Selv om studier av DNA metylering er økende, det genet metylering tilstander indusert av
H
.
pylori
er ennå ikke klart.
I dette arbeidet, vi forsøkte å identifisere spesifikke proteiner knyttet til
H
.
pylori
infeksjon ved hjelp av sammenlignende proteomikk og karakterisere genekspresjon og CpG island metylering av disse proteinene i mage kreft vev og celler.
Materialer og metoder
menneskelig vev
Det menneskelig vev ble oppnådd fra kirurgi prøver fra 30 mage kreftpasienter og matchet tilstøtende kreft vev og metastatiske lymfeknuter på Guiyang Medical Hospital, Guiyang Kina, mellom januar 2009 og juni 2010. diagnosene ble bekreftet av to patologer. Blant pasientene, 23 var menn og 7 kvinner. Pasientene var i alderen 38 til 77 år. Tjueto pasienter hadde intestinal-type adenokarsinom, og 8 hadde diffuse-type adenokarsinom. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen i Guiyang Medical Hospital, og alle fag gitt skriftlig informert samtykke.
Cell kultur
Den menneskelige magekreft cellelinje AGS (ATCC CRL-1739TM) og SGC-7901 celler ble kjøpt direkte fra American Type Culture Collection (ATCC) og Cell Bank of Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina), henholdsvis, og passert for mindre enn 3 måneder i vårt laboratorium etter mottak. Celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
H
.
pylori
kultur
H
.
pylori
belastning NCTC11637 (ATCC 43504, en gave fra den kinesiske Center of
Helicobacter pylori
belastning forvaltning og bevaring, Beijing, Kina), som er
CagA
positiv, ble dyrket i selektivt medium på en Columbia-agar plate inneholdende 10% føtalt kalveserum og
H
.
pylori
Selective Supplement (Oxoid Ltd, England) ved 37 ° C under microaerobic forhold.
Cell infeksjon med
H
.
pylori
AGS og SGC-7901-celler (5 × 10
5) ble sådd i 6-brønners plater i 24 timer og infisert med
H
.
pylori
i 6 timer og 12 timer ved en multiplisiteter av infeksjon (måneder) 1: 100, 1: 1000 henholdsvis,: 500 og 1. Celler ble infisert i 12 timer ved en MOI på 1: 1000 med
H
.
pylori
kokt i 15 min som kontroller.
Konstruksjon av ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 /
CagA
DNA ble ekstrahert fra
H
.
pylori
, og full-lengde
CagA
sekvens ble syntetisert ved PCR og klonet inn pMD18-T plasmider å konstruere pMD18-T /
CagA
.
CagA
genet ble identifisert ved sekvensering (GQ161098). pMD18-T /
CagA
ble kuttet med restriksjonsenzymer
Pst
jeg og
Bam
HI, og
CagA
ble ligert inn pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA) for å konstruere den eukaryote ekspresjonsvektoren pcDNA3.1 /
CagA
. Sekvensene av prim er gitt i tabell 1.
Cell transfeksjon med pcDNA3.1 /
CagA
SGC-7901 celler ble inkubert i 12 timer i 6-brønns plater for å oppnå 80% konfluente celler. Cellene ble deretter transfektert i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48 timer ble cellene delt 1:10 i nye 6-brønns plater og inkubert i ytterligere 24 timer og deretter holdt i selektiv zeocin-inneholdende (250 ug /ml) standard medium i 2 uker inntil klon formasjon. -Celler transfektert med tom vektor pcDNA3.1 /Zeo (-) ble benyttet som kontroller
proteinekstraksjon og western blot
Proteinekstrakter ble fremstilt ved resuspendering cellepelletene i en RIPA buffer eller homogen 200. mg vev i en RIPA buffer. En total på 30-50 ug proteinekstrakt ble underkastet SDS-PAGE gelelektroforese, overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Billerica, MA, USA) og blottet over natten med muse-monoklonalt anti-CagA-antistoff (1: 800, sc-28368), mus monoklonalt anti-fosfotyrosin antistoff (PY99, 1: 300, sc-7020), kanin polyklonale anti-beta aktin antistoff (1: 500, ab189073), kanin polyklonale anti-LDH antistoff (1: 350 , ab125683), mus monoklonalt anti-DLD (1: 800, sc-376890), kanin polyklonale anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), mus monoklonalt anti-ATP syntase antistoff (1: 300, ab54880), kanin polyklonale anti -calmodulin anbody (1: 250, ab208911), kanin-polyklonalt anti-RanGAP-antistoff (1: 200, ab92360), kanin-polyklonalt anti-p64CLCP-antistoff (1: 300, ab28722), kanin-polyklonalt anti-calreticulin-antistoff (1: 350, AB4) og muse-monoklonalt anti-glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-antistoff (GAPDH, 1: 8000) fra Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, UK) og CangChen (Shanghai, Kina), henholdsvis i 5% BSA i Tris-bufret saltvann, og 0,01% Tween-20. Konjugert sekundære antistoffer (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) ble brukt og utviklet med chemiluminescence reagent ECL Plus bruker Hyper (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Kvantifisering av de vestlige blotter ble utført ved hjelp av Antall ett-maskinen. Hvert eksperiment ble utført 3 ganger, og et representativt resultat er vist.
Protein-ekstraksjon og to-dimensjonal gelelektroforese
Cellepelleter ble oppløst i cellelyseringsbuffer over natten ved 4 ° C, og protein ble utfelt med tre volumer iskald aceton ved inkubering ved 4 ° C i 2 timer. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 20.000 rpm i 30 minutter, og pelletene ble resuspendert i cellelyseringsbuffer og lagret ved 4 ° C over natten.
Til sammen 800 ug protein ble justert til et volum på 250 ul med rehydrering løsning, og isoelektrisk fokusering (IEF) ble utført ved anvendelse av en Ettan IPGphor II isoelektrisk fokusering system (Amersham Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner. Protokollen for IEF var 300 V for1 timer, 500 V i 2,5 timer, 1000 V i 2 timer; 8000 V i 8 timer, 60 KVH (total).
Etter fullført IEF, de IPG strimler (Amersham Biosciences) ble ekvilibrert i ekvilibreringsbuffer i 15 minutter og plassert på en 12% SDS-PAGE-gel for to- dimensjonal elektroforese ved 30 mA /gel. Den resulterende SDS-PAGE-gel ble fiksert i 20% TCA i 30 minutter og deretter farget med kolloidal Coomassie G-250 [5].
Protein flekker på gelen ble scannet og analysert automatisk. Forskjellig uttrykt protein flekker ble bekreftet med Imaging Master 2D 5,0 analytisk programvare (Amersham Biosciences). T-test ble utført for kvantitativ analyse av 2D-geler. Differensial ekspresjon av et spesifikt protein ble definert som en ≥2 ganger endring i optisk tetthet sted mellom de to sett som samsvarer i duplikater. Differensial flekker ble deretter skåret ut fra SDS-PAGE-geler for ytterligere identifisering av LC-MS /MS.
RNA-ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra 50 mg vev og behandlet med DNase I (RNase-fri). Genene ble forsterket med SYBR Grønn (Applied Biosystems, Australia). Hypoksantin-guanin fosforibosyltransferase (
HPRT
) ble anvendt som en normaliseringskontroll, og relative mRNA-nivåer ble beregnet ved et sammenlignende C
t-metoden ved hjelp av trinn-en programvare (Applied Biosystems, Australia) [8]. Hver prøve ble analysert i tre paralleller, og resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig ± SD. Primere som brukes, er oppført i Tabell 1.
DNA-ekstraksjon og metylering analyse av CpG øyer
DNA ble isolert fra celler og modifisert med natriumbisulfitt å bruke en EZ DNA Metylering-Gold Kit
™ (Zymo Research, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Promotor CpG-øyer ble forutsagt ved bruk av metyl Primer Express programvare og amplifisert fra bisulfitt-modifisert DNA ved hjelp av PCR ved anvendelse av følgende fremgangsmåter: denaturering ved 96 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 40 sekunder, annealing ved 60 ° C i 40 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 40 sek, med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. De amplifiserte PCR-produktene ble klonet inn i pMD19-T-vektorer og sekvensert. I tillegg er DNA isolert fra tumorvev ble anvendt for å detektere
H
.
pylori
16S
rRNA
genet og
CagA
genet. Primersekvensene er oppført i tabell 2.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS 15,0 programvare. Én-veis analyse av varians (ANOVA) og Student t-test ble anvendt for å analysere dataene.
P
. 0,05 (tosidig) ble betraktet som signifikant
Resultater
Innføring av CagA i magekreftceller
På grunn CagA av
H
.
pylori
er en kritisk virulens faktor i utvikling og progresjon av magekreft, ble CagA påvist i magekreft cellelinjer ved RT-PCR og Western blot etter smitte av SGC-7901 og AGS celler med
H
.
pylori Hotell og transfeksjon av SGC-7901 celler med
CagA
-vector. Den CagA protein begynte å dukke opp i et forhold på celler til bakterier av 1: 500 i dyrkede celler på 6 timer, og innholdet var høyest ved et forhold på 1: 1000 ved 6 h (fig 1A og 1B). Imidlertid fosforylert CagA ble observert i celler ved et forhold på 1: 500 etter dyrkning i 12 timer, og det høyeste innholdet ble observert i celler ved et forhold på 1: 1000 etter 6 timer av kulturen. CagA mRNA og protein ble også observert i stabilt
CagA
-overexpressing SGC-7901 celler (figur 1C og 1D). Disse dataene tyder på at CagA ble med hell innført i de tre cellelinjene og fosforylert.
(A og B) Western blot-analyse av CagA og fosforylert CagA i
H
.
pylori
-infected SGC-7901 (A) og AGS (B) celler. Cellene infisert med det angitte forhold av celler til
H
.
pylori
for den angitte tid ble oppsamlet og lysert, og proteinene ble separert ved SDS-PAGE. Celler infisert med
H
.
pylori
kokt i 15 minutter ved en MOI på 1: 1000 ble brukt som en kontroll. (C og D) Påvisning av CagA mRNA og protein i
CagA
-overexpressing SGC-7901 celler ved RT-PCR (C) og western blot (D). GAPDH tjente som lasting kontroll. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Hp
,
H
.
pylori
; P-CagA, fosforylert CagA; GAPDH, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase.
Identifikasjon av differensial proteiner i magekreftceller
Etter celler ble infisert med
H
.
pylori
i 6 timer ved en MOI på 1: 1000 eller transfektert med
CagA
-vector, en proteomikk teknikk som ble brukt til å lage seks to-dimensjonal elektroforese (2-dE) kart fra de tre cellelinjer og deres respektive kontroller (figur 2), og 135 differensial flekker ble påvist, hvorav 73 ble oppregulert og 62 ble nedregulert. Ti differensial oppfattet felles for alle tre cellelinjer ble identifisert ved LC- MS /MS og verifisert av western blot, inkludert 6 oppregulert proteiner: P-aktin, LDH, DLD, PRPF19, ATP syntase og calmodulin (CAM), og 4 nedregulert proteiner som RanGAP, P64 CLCP, P43 og calreticulin (tabell 3 og figur 3A).
SGC-7901 og AGS celler infisert med
H
.
pylori
i 6 timer ved en MOI på 1: 1000 (. Celle til
H
pylori
) og SGC-7901 celler transfektert med pcDNA3.1 /
CagA
i 48 timer ble samlet og lysert, og proteinkonsentrasjonene ble bestemt ved hjelp av Bradford kolorimetri. Totalt 800 ug protein ble påsatt for to-dimensjonal elektroforese. Celler infisert med kokt
H
.
pylori
eller transfektert med tom vektor fungerte som kontroller for de infiserte eller transfekterte celler, henholdsvis. (A) SGC-7901 celler infisert med
H
.
pylori
. (B) AGS celler infisert med
H
.
pylori
. (C) SGC-7901 celler transfektert med
CagA
-vector. (D) Forstørret bilde av 10 differensial flekker. B4, B11, C6, C7, C8 og C9 flekker var oppregulert, mens D12, D16, E2 og E11 flekker ble nedregulert. Disse flekkene er identifisert i tabell 3.
(A) Western blot-analyse av de angitte proteiner i kontrollcellene (1),
H
.
pylori
-infected SGC-7901 celler (2) og
CagA
-overexpressed SGC-7901 celler (3). GAPDH tjente som lasting kontroll. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse av de angitte genene i 30 magekreft vev. Verdier er representert som gjennomsnittet Ct ganger sammenlignet med peri-cancervev, hvor peri-cancervev ble satt til 1. (C) Western blot-analyse av de angitte proteiner i 30 magekreft vev. 200 mg vev ble homogenisert og de totale proteinene ble oppsamlet. Totalt 50 pg proteinekstrakter ble underkastet SDS-PAGE-gel-elektroforese. GAPDH tjente som lasting kontroll. (D) Påvisning av
H
.
pylori
16S
rRNA
genet og
CagA
genet i mage kreft vev med PCR (Øvre). M representerer DNA molekylvekt markør. Bane 1 er den positive kontrollen. Felt 2 er den negative kontroll. Kolonnene 3, 4 og 6 er positive prøver. Lanes 5 er negative prøver. Kvantitativ RT-PCR analyse av de angitte gener i mage kreft vev med og uten
H
.
pylori
infeksjon (Nedre). Verdiene er presentert som den gjennomsnittlige Ct ganger sammenlignet med gruppen uten
H
.
pylori
infeksjon, som ble satt til 1. Figuren viser gjennomsnitt av 30 prøver. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Feilfelt representerer standardavvik. LDH, L-laktat dehydrogenase. DLD, Dihydrolipoamide dehydrogenase. PRPF19, pre-mRNA prosessering faktor 19 homolog. RanGAP, Ran-spesifikke GTPase aktiverende protein. Cam, calmodulin. P64 CLCP, kjernekraft klorid ion kanal protein. *,
P
0,05 sammenlignet med peri-kreftvev (B og C) og vev uten
H
.
pylori
infeksjon (D).
H
.
pylori
infeksjon fremmer uttrykk for differensial proteiner i magekreft vev
fordi
H
.
pylori koloniserer
selektivt magesekken hos mennesket for å aktivere et sett av patologiske prosesser, ble det genekspresjon av 10 differensial proteiner i 30 humane magecancerprøver evaluert ved kvantitativ RT-PCR. Av de 10 gener, uttrykk for
β-ACTIN
,
LDH
,
DLD
,
PRP19 Hotell og
Kamera
i mage kreft og /eller metastatiske lymfeknuter var oppregulert i forhold til peri-cancerous vev, mens uttrykk for
RanGAP
ble nedregulert. På samme måte, de 6-proteinene ble også unormalt uttrykt i de samme vev (figur 3B og 3C). Ingen signifikante forskjeller i uttrykket av andre gener ble observert.
H
.
pylori
kolonisering i mage kreft vev ble målt ved å registrere 16S
rRNA
genet og
CagA
gen av
H
.
pylori
av PCR.
H
.
pylori
var til stede i 20 av de 30 prøvene (positiv rente 67%), og alle
H
.
pylori
stammer er
CagA
positive. De mRNA nivåer av
β-ACTIN
,
LDH
,
DLD
,
PRP19 og cam
var høyere i
H
.
pylori
-positive vev enn i de negative prøvene (figur 3D).
H
.
pylori
induserer avvikende DNA metylering i magekreftceller
I tre cellelinjer, PCR-produkter av CPG øyene ovenfor gener ble vellykket ervervet etter bisulfite behandling og sekvensert. I disse genene,
LDH
,
DLD Hotell og
Kamera
gener ble demetylert ved arrangøren -2325, -1885 og -276 nettsider henholdsvis, og
RanGAP
genet ble svært metylert ved arrangøren -570 og -170 områder (fig 4).
(A) Elektro analyse av arrangøren CpG øyene de angitte gener ved sulfitt modifikasjon-PCR. (B) metylering områder av CPG øyene på de indikerte genet arrangører.
LDH
, L-laktat dehydrogenase.
DLD
, Dihydrolipoamide dehydrogenase.
RanGAP
, Ran-spesifikke GTPase aktiverende protein.
Kamera
, calmodulin. M, Molekylvekt markør. 1, ubehandlede SGC-7901 celler; 2,
H
.
pylori
-infected SGC-7901 celler; 3,
CagA
-overexpressing SGC-7901 celler. Pilene viser unormale metylering nettsider.
Diskusjoner
Akkumulert bevis indikerer at
H
.
pylori
infeksjon er en viktig faktor for
H
.
pylori
-associated mage sykdommer og at CagA er en fremmende faktor for magekreft [17,18]. Vi konstruerte tre eksperimentelle cellelinjer, inkludert to magekreft cellelinjer infisert med
H
.
pylori product: (
CagA
+) og en magekreft cellelinje overekspresjon
CagA
, og fastslo at CagA begynte å dukke opp i celler seks timer etter infeksjon og for opp til 12 timer. Deretter begynte fosforylert CagA skal vises, i overensstemmelse med injeksjon og påfølgende fosforylering av CagA inn i gastriske epitel-celler ved den T4SS av
H
.
pylori
etter infeksjon av human gastrisk mukosa. Fosforylert CagA aktiverer nedstrøms signalveier og spiller en patologisk rolle. Vi har også observert CagA i celler stabilt transfektert med
CagA
-vector. Disse data bekrefter den vellykkede konstruksjon av de tre eksperimentelle cellelinjer.
Proteomics har blitt brukt til å studere sammenhengen mellom
H
.
pylori
infeksjon og mage sykdommer, og mange forskjellig uttrykt proteiner har blitt identifisert [19-22]. Men foreningen av disse proteinene med CagA og deres uttrykk i menneskelige mage kreft vev fortsatt uklare. Vi fikk totalt 135 differensial flekker fra de tre cellelinjer, hvorav 73 ble oppregulert og 62 ble nedregulert. Ti differensial flekker var felles for alle tre cellelinjer, inkludert seks oppregulert proteiner (β-aktin, LDH, DLD, PRP19, ATP syntase, og cam) og 4 nedregulert proteiner (P64 CLCP, RanGAP, P43 og calreticulin) , og 10 proteiner «ekspresjon ble bekreftet ved western blot i disse cellelinjene. Disse proteiner er involvert i energimetabolismen, skjelett-omleiring, pre-mRNA prosessering, signaltransduksjon, og andre proteiner nært forbundet med utvikling og progresjon av mange humane cancere [23,24]. Vi oppdaget kvantitativt uttrykk av genene som koder for disse 10 proteiner i menneskelige mage kreft vev, noe som viste at
β-ACTIN
,
LDH
,
DLD
,
PRP19 Hotell og
Kamera
ble konsekvent høyt uttrykt og
RanGAP
var dårlig uttrykt i både kreft vev og /eller metastatiske lymfeknuter i forhold til peri-cancerous vev. Den avvikende ekspresjon av disse proteinene ble også bekreftet ved western blot i magekreft og metastatiske lymfeknuter. Deretter fant vi at
CagA
+
H
.
pylori
kolonisert i 20 av 30 mage kreft vev og fremmet eller hemmet uttrykket av disse genene i vivo.
LDH og DLD er nært korrelert med energiomsetningen. Forstyrrelse i energiomsetningen er ansett som en viktig faktor for utvikling og progresjon av kreft. I motsetning til normale celler, kreftceller oppviser økt avhengighet av den glykolysen med tilstrekkelig oksygen, betegnet aerob glykolyse. En stor mengde av pyrodruesyre, et endelig produkt av veien, omdannes til melkesyre ved LDH, fremme glykolysen og energimetabolismen ubalanse [25]. Melkesyre kan også redusere pH-verdi av cellemikromiljøet, og dermed øke neovaskulær respons til angiogenese-faktorer for å fremme tumorcellemetastase [26,27]. I samsvar med våre resultater,
LDH
ble sterkt uttrykt i kreftvevet i 61,8% av pasienter med magekreft; pasienter med LDH overekspresjon hadde kortere overlevelse sammenlignet med pasienter med lavt uttrykk [28]. Kim
et al
. [29] observerte at
DLD
uttrykk øker med tumorprogresjon, og dermed gi mer energi for tumorcellevekst. Derfor er høy uttrykk for LDH og DLD en avgjørende faktor for utvikling og progresjon av magekreft, og
H
.
pylori
infeksjon fremmer uttrykket av disse to genene i mage kreft vev.
Beta-aktin, en viktig del av cytoskjelettet, opprettholder struktur, bevegelse og deling av celler under normale tilstand.
β-ACTIN
er unormalt uttrykt i mange sykdommer [30]. Den PRPF19 proteinet antas å virke i pre-mRNA-spleising. Ubiquitinering av PRPF19 kan føre til DNA-skade, og unormal DNA-reparasjon er en viktig årsak til tumorgenese [31]. Calmodulin er en kalsium-bindende protein som regulerer mange signalveier og således deltar i celle-proliferasjon, mitose og gentranskripsjon. Calmodulin fremmer celle proliferasjon i leverkarsinom i kombinasjon med PI3K og overgangen fra G1 til S-fasen i kombinasjon med Cyclin E [32]. En inhibitor av kalmodulin arrestasjoner celler i G1 fase for å inhibere celledeling [33]. I samsvar med disse resultatene, fant vi ut at
H
.
pylori
kan delta i kreftutvikling av mage vev ved å fremkalle den høye uttrykket av disse tre proteiner.
I tillegg observerte vi nedregulering av
RanGAP
genet i kreft vev med
H
.
pylori
infeksjon. RanGAP er en GTPase aktiverende protein. Etter hydrolyse av GTP til BNP med en GTPase, blir aktiv RanGTP inaktiv RanGDP, som fører til blokkering av cellesignale å hemme kreft progresjon [34]. Tilsvarende redusert RanGAP aktivitet indusert av ubiquitinering fremmer kreftutvikling [35].
DNA metylering kan indusere unormal genekspresjon.
H
.
pylori
infeksjon øker metylering nivåer av noen gener og resultater i kreftutvikling av mageslimhinnen [36,37]. DNA metylering vises vanligvis i CPG øyene genet arrangører. Vi oppdaget den metylering status av CPG øyene disse genene i de konstruerte cellelinjer og fastslått at
LDH
,
DLD Hotell og
Kamera
gener ble demetylert ved promoter -2325, -1885 og -276 områder, henholdsvis, og
RanGAP
genet ble svært metylert ved arrangøren -570 og -170 områder, i tråd med den høye uttrykk for
LDH
,
DLD Hotell og
Kamera
gener og den lave uttrykk for
RanGAP
genet i mage kreft vev med
CagA
+
H
.
pylori
infeksjon.
I konklusjonen, disse resultatene tyder på at
H
.
pylori
infeksjon, via CagA trans, kan indusere avvik metylering av disse genene til å føre til dysfunksjonell genekspresjon i mage kreft vev og celler. Våre resultater gir en ny forståelse av den molekylære patogenesen av magekreft med
H
.
pylori
infeksjon. Fremtidige studier vil utforske effekten av disse endrede metylering mønstre på patogenesen av magekreft i kliniske prøver.
Takk
Vi takker den kinesiske Center of
Helicobacter pylori
belastning Ledelse og bevaring for å gi
H
.
pylori
NCTC11637 og Dr. Yang Wenxiu og Wu Jiahong for teknisk assistanse.
