Abstract
Den type 2 transmembrane serin protease matriptase er bredt uttrykt i humane karsinomer og hematologiske kreftformer. Den proteolytiske aktiviteten til matriptase er et potensielt mål av narkotika og bildebehandling sonder. Vi vurderte skjebnen til aktiv matriptase etter induksjon av matriptase zymogen aktivering. Utsette åtte menneske carcinoma celler til pH 6,0 buffer indusert robust matriptase zymogen aktivering etterfulgt av rask hemming av den gryende aktive matriptase av hepatocytter vekstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1. Følgelig ble det ikke enzymatisk aktivt matriptase påvist i disse cellene. Noen aktive matriptase blir imidlertid hurtig felle til det ekstracellulære miljø ved disse karsinomceller. Mangelen på celleassosiert aktiv matriptase og avgivelse av aktiv matriptase ble også observert i to hematologiske kreft linjer. Matriptase shedding er korrelert tett med induksjon av matriptase aktivering, noe som tyder på at matriptase aktivering og shedding er kinetisk koplet. Koblingen tillater en andel av aktiv matriptase å overleve HAI-1-inhibering ved hurtig avgivelse fra celleoverflaten. Vår studie tyder på at mobilnettet gratis, aktiv matriptase er knappe, og kan ikke være en effektiv mål for
in vivo
bildebehandling og narkotika utvikling
Citation. Chu LL, Xu Y, Yang JR, Hu YA, Chang HH, Lai HY, et al. (2014) humane kreftceller Beholde Modest Nivåer av enzymatisk aktivt Matriptase Bare i ekstracellulære miljø følgende Induksjon av zymogen aktivering. PLoS ONE 9 (3): e92244. doi: 10,1371 /journal.pone.0092244
Redaktør: Jian Cao, Stony Brook University, USA
mottatt: 10 januar 2014; Godkjent: 09.02.2014; Publisert: 24 mars 2014
Copyright: © 2014 Chu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute (NCI) Grants RO1 CA 123 223 (M. Johnson og C.-Y. Lin); Taiwan Department of Defense Grant MTB-102-08 (til J.-K. Wang); og Chi-Mei Medical Center stipend CMNDMC-10211 (til J.-K. Wang og L.-L. Chu). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. C.-Y.L. er en oppfinner på amerikanske patenter # 6077938 og # 6677377 og M.D.J. og C.-Y.L. er oppfinnere på amerikansk patent # 7355015. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Proteaser kata nedbryting av proteiner ved hydrolyse av peptidbindinger. Gjennom den regulerte spaltning av proteiner, proteaser er involvert i mange svært kontrollerte fysiologiske prosesser, slik som DNA-replikasjon, cellesyklusprogresjon, celledød, angiogenese, blodkoagulering, inflammasjon, nevrogenesen og immunitet. Protease dysregulering har vært implisert i en rekke sykdommer, inkludert kreft og kardiovaskulære forstyrrelser. Proteaser er derfor ansett for å være effektive mål for utvikling som narkotika mål og biomarkører. Proteasomhemmere, for eksempel, har blitt brukt til behandling av hematologiske maligniteter [1], [2] og serumnivåer av proteasen PSA (prostataspesifikt antigen) har vært brukt som en biomarkør for overvåking av prostatakreft i ulike sammenhenger [3]. Oppfinnelsen av aktivitetsbaserte prober (ABP) tillater vurdering av protease-aktivitet i levende celler eller i hele organismer [4]. Til tross for suksessen med enkelte legemidler og prober er imidlertid rettet mot proteolytisk aktivitet for utvikling av legemiddel og biomarkører har ikke alltid vært meget tilfredsstillende. Så attraktiv som de er, proteaser-inspirert diagnostikk og terapi har mange iboende kompleksiteten og begrensninger som må tas i betraktning før utvikle nye legemidler eller sonder rettet mot proteaser og proteaser aktiviteter. Disse begrensningene omfatter activational status for proteasene, den funksjonelle lokalisering av proteasene, og endogene proteaser inhibitorer, som alle påvirker proteaseaktivitet og kan i sin tur påvirke effektiviteten av protease inhibitor og prober.
typen 2 trans serin protease (TTSP) matriptase er en spesielt interessant eksempel på de utfordringer som en protease kan presentere om sitt valg som et mål for utvikling av kliniske applikasjoner og strategier som kan være nødvendig for å effektivt benytte hemmere av og sonder for matriptase aktivitet . Matriptase er bredt uttrykt av epitelvev og faktisk er nødvendig for opprettholdelse av epitelial integritet [5] – [7]. Matriptase er vanligvis dysregulerte i karsinomer gjennom forhøyet ekspresjon, økt zymogen aktivering, og en ubalanse i uttrykket av matriptase forhold til hepatocytt-vekstfaktor aktivator inhibitor (HAI) -1, den primære endogene protease inhibitor av matriptase aktivitet [8] – [10] . I tillegg til epitelceller, er matriptase også uttrykt i monocytter [11] – [13], mastceller [14], kondrocytter [15] og nevrale stamceller [16], og matriptase har vært implisert i osteoartritt [15] og aterosklerose [1. 3]. Ekspresjonen av matriptase i mastceller tyder på at matriptase har potensial til å bidra til allergirelaterte sykdommer, for eksempel astma. Flere matriptase katalytiske inhibitorer har blitt utviklet, herunder lite molekyl og peptid-baserte inhibitorer. Disse matriptase hemmere utviser stor styrke mot matriptase aktivitet når testet ved hjelp av
in vitro
analyser som i de fleste tilfeller, har gjort bruk av rekombinant matriptase serin protease domene [17] – [22]. Antistoffbaserte inhibitorer spesielt rettet mot aktiv matriptase (i motsetning til den zymogen form) i har også blitt utviklet [23] og brukt til å detektere tumorer i mus via binding til aktiv matriptase på overflaten av kreftceller [24], [25].
Matriptase syntetiseres som en zymogen og gjennomgår autoaktivering for å kjøpe ut sin potente trypsin-lignende aktivitet. Aktiveringen av matriptase raskt fulgt av inhibering av den begynnende aktive matriptase av proteinet HAI-en og forblir festet til cellene gjennom det transmembrane domene av HAI-1. Det er uklart hvor mye og hvor lenge gryende fritt aktivt matriptase vedvarer på celleoverflaten: parametre som er viktige for noen begrunnelse for utvikling av matriptase aktivitetsbaserte hemmere og sonder for kliniske applikasjoner. I denne studien, setter vi ut for å vurdere skjebnen til aktiv matriptase etter induksjon av matriptase zymogen aktivering i menneske karsinom og hematologiske kreftceller. Uavhengig av omfanget av matriptase zymogen aktivering induserte, ble det ikke gratis, aktiv matriptase funnet å vedvare på kreftcellene. Interessant er imidlertid overlever en liten andel av den aktive matriptase HAI-1 inhibering ved å være hurtig utskilles i det ekstracellulære miljø. Vår studie tyder på at på grunn av mangel på gratis aktiv matriptase tilstede på overflaten av kreftceller, er usannsynlig å presentere en effektiv mål for kliniske applikasjoner matriptase katalytisk aktivitet.
Materialer og metoder
Kjemi og reagenser
Gelatin og 5,5′-Dithio-bis- (2-nitrobenzosyre) (DTNB) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); N-tert-butoksykarbonyl (Boc) Gln- Ala-Arg-7-amido-4- methylcoumarin (AMC) ble kjøpt fra Enzo miljø- og biovitenskap (Farmingdale, NY); Føtalt bovint serum (FBS) ble oppnådd fra Omega Scientific (Tarzana, CA).
cellekulturer
humane brystcancerceller MCF7 og MDA-MB-468 ble opprettholdt i en modifisert Forbedret Minimum Essential medium (IMEM), supplert med 10% FBS. Humane prostatakreftceller LNCaP, PC3, DU145 og, human eggstokk-kreft-celler OVCAR-3, human multiple myelomceller RPMI 8226-celler og humane Burkitts lymfomceller Ramos, ble dyrket i RPMI-1640 medium, supplert med 10% FBS. Humane brystcancerceller SK-BR-3, human keratinocytt HaCaT, og human eggstokk-kreft-celler OV-2008 ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplert med 10% FBS. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Alle cellene ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) unntatt HaCaT (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim Tyskland) og OV2008 (vennlig levert av Dr. Gaetano Marverti, Universitetet i Modena og Reggio Emilia, Italia) [26] .
monoklonale antistoffer
De menneskelige matriptase monoklonale antistoffer M24 og M69 ble brukt for immunoblot analyser for å påvise total matriptase og aktivert matriptase henholdsvis [27] – [29]. Det monoklonale antistoff M69 immobilisert på Sepharose-kuler ble brukt til immunodepletion studiene.
Tryptic aktivitetsanalyse etter induksjon av matriptase zymogen aktivering
For induksjon av matriptase zymogen aktivering i carcinoma-celler, cellene ble dyrket i 150 mm skåler eller 6-brønns plater. Cellene ble vasket med PBS tre ganger, og deretter inkubert i 20 minutter ved romtemperatur med 150 mM fosfatbuffer pH 6,0 (7 ml i 150 mm skåler og 1 ml til 6-brønns plate) eller 150 mM fosfatbuffer pH 8,0 som en ikke- -activation kontroll. I noen tilfeller, ble PBS benyttet som den ikke-aktiveringskontroll. Etter inkuberingen ble 2 M Trizma base for tilsatt for å bringe pH til 8,0. Cellene ble skrapet fra skålene eller brønnene for å gi en kombinert suspensjon inneholdende en blanding av cellene og felle proteiner. En andel av denne blanding ble underkastet sentrifugering ved 10000 rpm ved hjelp av en Eppendorf bordsentrifuge i 1 min. Supernatanten ble samlet som den skur fraksjon og cellepelleten ble resuspendert i 150 mM fosfatbuffer pH 8,0 til det samme volum som prøve forut for sentrifugering for å gi cellefraksjon. Prosedyren for opphugging av cellene fra disken og behandling ved sentrifugering dose ikke resultere i frigjøring av matriptase eller HAI-en fra cellene. Fremgangsmåten er designet for å generere cellen og kondisjonert buffer under identiske betingelser, med hensyn til pH og ionestyrke i bufferen for den proteolytiske analysen. For de to hematologiske kreftceller som vokser som suspensjonskulturer, forholdet mellom celletallet i forhold til volumet av fosfatbufferen var 5 x 10
5 celler /200 ul buffer. Den matriptase aktivitet i 195 ul av skjellet og cellefraksjoner ble bestemt ved måling av 7-amino-4-metylkumarin (AMC) frigjøring fra et syntetisk substrat Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (5 ul av en 5 mM stamløsning) i mikrofluor 96-brønns sorte mikrotiterplater (Thermo Scientific). Spalting av den syntetiske fluorogent substrat ble tatt opp med en Wallac 1420 Victor to mikroplateleser med en eksitasjon bølgelengde på 360 nm og oppdager utslipp på 480 nm.
Immunodepletion
M69 mAb ble kovalent bundet til Sepharose 4B ved 5 mg /ml gel som tidligere beskrevet [28]. For immunodepletion ble prøvene (200 ul) ble inkubert med 15 ul M69-Sepharose som roterer i kaldt rom i 2 timer. Supernatanten ble separert fra kulene ved sentrifugering og oppsamlet som den ikke-bundne fraksjon. Kulene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 1% Triton X100 fire ganger, hvoretter de fangede proteiner ble eluert fra perlene med 0,1 M glycinbuffer pH 2,4, etterfulgt av nøytralisering med 2 M Trizma base.
Western-blotting
Cellene ble lysert i PBS inneholdende 1% Triton X-100 og 1 mM DTNB. DTNB ble tilsatt til den lyseringsbuffer for å forhindre spaltning av disulfidbindinger [30]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford proteinanalyse og like mengder av proteiner eller like andeler av cellelysater og klimaanlegg buffere ble analysert ved hjelp av Western blot. Proteinprøver ble fortynnet i 5 x prøvebuffer som ikke inneholder noe reduksjonsmiddel og inkubert ved romtemperatur i 5 min. Proteiner ble oppløst ved 7,5% SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner, og deretter probet med de forskjellige mAb’er. Binding av mAbs ble oppdaget ved hjelp av HRP konjugerte sekundære antistoffer, og visualisert ved hjelp av Western Lightening® Chemiluminescence Reagens Plus (Perkin-Elmer, Boston, MA).
Gelatin zymografi
Gelatin gels ble kastet av tilsetning av gelatin (sluttkonsentrasjon 1 mg /ml) til 7,5% SDS polyakrylamidgeler. Proteinprøver ble inkubert med SDS-prøvebuffer ved romtemperatur i 5 min i fravær av et reduksjonsmiddel. Etter elektroforese ble gelatingeler vasket med 2,5% Triton X-100 /PBS tre ganger, og deretter inkubert IN100 mM Tris-buffer pH 8,0 ved 37 ° C over natten. Gelene ble deretter farget med Coomassie Brilliant Blue.
Resultater
MCF7- brystkreftceller konstitutivt aktivere matriptase men gratis aktive matriptase ikke bli assosiert med cellene
For for å begynne å utforske hvorvidt matriptase proteolytisk aktivitet assosiert med brystcancerceller kan bli brukt som et mål for utvikling av medikamenter og /eller bilde sonder, målte vi spaltingen av substratet Boc-Gln-Ala-Arg-AMC av MCF7 brystcancer -celler før og etter induksjon av robuste matriptase zymogen aktivering (fig. 1A). Matriptase zymogen aktivering tilsynelatende opptrer konstitutivt i MCF7-celler, siden den 120-kDa matriptase-HAI-1-kompleks ble lett detektert i tillegg til det 70-kDa matriptase zymogen i cellelysatene forut for induksjon av matriptase zymogen aktivering (Fig. 1 A, kolonne 1) . Etter induksjon av matriptase zymogen aktivering ved eksponering av cellene til pH 6-buffer i 20 minutter [27], [31], [32], mye av den 70 k-Da matriptase zymogenet ble omdannet til 120-kDa matriptase-HAI- 1 kompleks (fig. 1A spor 4). Deretter ble mengden av tryptiske aktiviteten forbundet med MCF7 henhold konstitutive eller syreinduserte betingelser som gir de to forskjellige nivåer av matriptase aktivering. Gitt den mulighet at HAI-1 kan binde seg til og inhibere den aktive matriptase etter at begge proteiner var blitt frigjort fra cellemembran, målte vi den tryptiske aktiviteten forbundet med overflaten av cellene i fravær av det ikke-ioniske detergent Triton X-100 . Under disse betingelser var det knapt noen spaltning av de fluoriserende substrater ved de MCF7 celler enten matriptase aktivering var konstitutiv eller indusert ved robust syre eksponering (fig. 1B, kurve 1 og 4). Disse dataene tyder på at disse brystkreftceller ikke beholder fri, aktiv matriptase uavhengig av innholdet av matriptase zymogen aktivering.
MCF7 humane brystcancerceller. En
ble inkubert med en pH 6-buffer å indusere matriptase zymogen aktivering (
A.
riktig, loven.) eller med pH 6 buffer supplert med 150 mM NaCl som en ikke-aktiveringskontroll (
A.
venstre, ikke-act .). Cellelysater ble fremstilt, og prøvene oppbevares for analyse (banene 1 og 4). De gjenværende cellelysatene ble underkastet immunodepletion med den aktive matriptase-spesifikke mAb M69 immobilisert på Sepharose-kuler for å utarme den aktiverte matriptase, hovedsakelig 120-kDa kompleks (banene 2 og 5, og D). Antistoff-bundet aktivert matriptase ble utvunnet ved en pH 2,4 buffer-eluering etterfulgt av pH-nøytralisering (felt 3, E). Disse prøver ble deretter analysert for matriptase art ved SDS-PAGE (uten å koke prøvene eller ved hjelp av reduksjonsmidler) og Western blot ved å bruke den totale matriptase mAb M24.
B.
Den cellene, immunodepleted lysatene, og eluatene ble analysert tryptisk aktivitet ved spaltning av en syntetisk fluorogent substrat med Arg som P1 område. For det tryptiske analysen, cellene forble intakt i fravær av Triton X-100. NA står for ikke-aktivering; L for lasting av immunodepletion, D for immunodepleted fraksjon; E for eluert fraksjon; En for aktivering; RFU for relativ fluorescerende enhet.
Mangelen på gratis, aktiv matriptase assosiert med cellene er på grunn av den raske hemming av aktiv matriptase av HAI-en. Tidligere genererte vi en matriptase monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner og binder seg til den aktiverte formen av matriptase (hvorvidt eller ikke det er i et kompleks med HAI-1), uten kryssreagerer med matriptase zymogen [33], [34]. Vi brukte dette mAb, M69, koblet til kulene, for å fjerne eventuelt aktivert matriptase som var til stede i cellelysatene ved immunodepletion. Som forventet, ble det 120-kDa matriptase-HAI-1-komplekset effektivt fjernet fra MCF7 cellelysatene ved denne fremgangsmåte (fig. 1A, sammenligning baner 2 og 5 med banene 1 og 4, henholdsvis). Det 70-kDa matriptase proteinbånd til stede i begge prøver ble ikke oppbrukt av det aktiverte matriptase mAb, som indikerer at den 70-kDa matriptase proteinbånd i begge preparater inneholder lite eller ingen aktiv matriptase og er matriptase zymogen. Som forventet, immunodepleted prøvene hadde ingen spalting aktivitet mot det fluorescerende substrat (Fig. 1B). De aktiverte matriptase arten bundet til M69 mAb-Sepharose-kuler som brukes til å immunodeplete prøvene ble eluert ved anvendelse av pH 2,4 glycin-buffer. Vi har tidligere vist at denne sure bufferen forårsaker dissosiasjon av matriptase-HAI-1-komplekset [33]. Nøytralisering resulterer typisk i re-sammenslutning av noen av HAI-1 og aktiv matriptase etterlot resten av dissosiert aktive matriptase i den kompleksdannede form etter nøytralisering av eluatet, med det resultat at den aktive matriptase ble påvist ved Western blot-analyse ved å bruke en total matriptase mAb hovedsakelig som et 70 kDa bånd. Intensiteten av denne 70-kDa aktiv matriptase båndet var proporsjonalt med intensiteten av det 120-kDa matriptase-HAI-1-komplekset bånd påvist i begge tilfeller (fig. 1A, sporene 3 og 6). Dette dissosiert aktiv matriptase oppviste tryptisk aktivitet som bestemt ved spaltning av det fluorogene substrat (fig. 1B, kurve 3 og 6). Substrat-spaltningsseter er observert korrelerte godt med nivået av den aktive matriptase påvist ved Western blot-analyse. Disse analysene bekrefter at 120-kDa celleassosierte matriptase arter er en inaktivert aktiv matriptase kompleks og at elueres 70-kDa arter er faktisk aktiv matriptase.
En andel av aktiv matriptase ble utgytt til ekstracellulære miljø
til tross for den hurtige HAI-1-mediert inhibering av den aktive matriptase forbundet med cellen, fri aktiv matriptase ble faktisk skur inn i det ekstracellulære miljø før HAI-1-inhibering (fig. 2). Når MCF7 brystcancerceller ble transient eksponert til pH 6,0 buffer, etterfulgt av nøytralisering til pH 8,0, ble sterk tryptisk aktivitet mot det fluorescerende substrat påvist i blandingen av cellene og klimaanlegg buffere (skur fraksjon) (Fig. 2A). Når cellene og skur fraksjonene ble separert, ble den tryptiske aktivitet bare påvist i skjulet fraksjoner (supernatant) og ikke knyttet til cellen pellets. Disse data indikerer at i tillegg til induksjon av matriptase zymogen aktivering, er noen aktive proteaser med tryptisk aktivitet felle inn i det ekstracellulære miljø. For å ta opp spørsmålet om hvorvidt dette kaster proteolytisk aktivitet er avledet fra aktiv matriptase vi bestemt om M69-perler kan immunodeplete aktiviteten fra prøvene (Fig. 2B og C). Immunodepletion av materialet skur fra kontroll-behandlede celler resulterte ikke i en betydelig endring i intensiteten av 70kDa matriptase båndet (fig. 2B, felt 1 og 2), og ingen matriptase ble påvist i materialet eluert fra kulene (Fig . 2B, kolonne 3), i samsvar med fravær eller lavt nivå av skur fri, aktiv matriptase under disse betingelser. I motsetning til dette, etter syre-indusert matriptase aktivering, nedbrytning med M69-perlene betydelig redusert nivåene av total matriptase til stede i skur fraksjon (fig. 2B, sammenlign spor 5 til spor 4), og en sterk 70-kDa matriptase båndet er til stede i eluatet fra kulene (fig. 2B, spor 6). Dette er i overensstemmelse med tilstedeværelsen av fri, aktiv matriptase i den kondisjonerte buffer fra cellene hvori matriptase aktivering var blitt indusert av syreeksponering. Når analysert for tryptisk aktivitet ved anvendelse av det fluorogene substrat analysen har vi funnet at proteolytisk aktivitet ble dramatisk redusert etter immunodepletion (figur 2C, sammenligne kurvene A-l og A-D), noe som bekrefter at de fleste av de tryptiske aktiviteten som er tilstede i skur fraksjon var tilskrives fri, aktiv matriptase. Tilstedeværelsen av aktiv matriptase i skur fraksjonen ble ytterligere bekreftet ved påvisning av et 70-kDa gelatinolytisk aktivitet i skur fraksjon (fig. 2D, kolonne 1) og uttømming av det 70-kDa gelatinase av de aktiverte matriptase mAb kuler (Fig . 2D, kolonne 2). Tatt sammen tyder disse data på at mens MCF7 brystcancerceller konstitutivt aktivere matriptase under normale forhold, blir det store flertallet av den aktive matriptase hurtig inhibert av HAI-1 selv om en liten andel av det aktive enzym kan være hurtig felle i det ekstracellulære miljø. Avgivelse av aktiv matriptase til det ekstracellulære miljø på denne måten er i samsvar med deteksjon av aktiv matriptase i det kondisjonerte medium av brystkreftceller i vårt studium tidlig [35].
A.
MCF7-celler ble indusert til å aktivere matriptase ved en pH 6,0 buffer, etterfulgt av nøytralisering til pH 8,0. Blandingen av celler og buffer (Kombiner), ble de pelleterte cellene etter sentrifugering (celle), og buffer supernatanten (utskilt fraksjon) alene (skur) analysert med hensyn til tryptisk aktivitet ved spaltning av en syntetisk fluorescerende substrat med Arg som P1 området . RFU står for relative fluorescerende enhet. B. kaste fraksjoner samlet inn fra MCF7 celler legge induksjon av matriptase aktivering (loven.) Og ikke-aktivering kontroll (Non-act.) Ble utsatt for immunodepletion med aktivert matriptase mAb M69 perler. Skuret fraksjoner (L, banene 1 og 4), er utarmet fraksjoner (D, baner 2 og 5), og de eluerte fraksjoner (E, felt 3 og 6) ble analysert for matriptase art ved hjelp av Western blot ved hjelp av mAb M24.
C.
Og
D.
Skur fraksjon fra pH 6 bufferutsatte MCF7 celler ble immunodepleted bruker M69 perler. Skuret fraksjonen (L, kolonne 1) og det immunodepleted fraksjonen (D, kolonne 2) ble analysert for tryptiske aktivitet (panel
C
) og gelatinolytisk aktivitet av gelatin zymografi (panel
D
, Gel. Zym.). RFU står for relative fluorescerende enheter; A-L for aktivert-lasting; A-D for aktivert fattig.
For å finne ut om andre matriptase-uttrykke brystkreftceller også regulere matriptase på en lignende måte å MCF7 celler, vi analysert prøver generert ved hjelp av MDA-MB-468 og SK -Br-3-brystcancerceller under normale vekstbetingelser og når de utsettes for syre-indusert matriptase zymogen aktivering. Matriptase arter og proteolytisk aktivitet ble vurdert som før gjennom en kombinasjon av fluorescerende substrat spalting assay immunodepletion og Immunoblotanalyse analyser (fig. 3). I likhet med MCF7 celler, MDA-MB-468 celler som konstitutivt aktivere matriptase (fig. 3A, kolonne 1), og kan induseres til å robust aktivere matriptase etterfulgt av rask HAI-1-mediert inhibering som respons på celle eksponering til svakt surt buffer (fig . 3A kolonne 2). Den 120-kDa matriptase-HAI-en kompleks er spesielt immunodepleted bruker de aktiverte matriptase mAb perler (Fig. 3A kjørefelt 3) og flertallet av syre-dissosiert fritt aktivt matriptase ble eluert og forble kompleksbundne følgende nøytralisering (Fig. 3 kjørefelt 4 ). Tryptiske aktivitet ble oppdaget bare i skjulet fraksjoner og ikke i celle fraksjoner (fig. 3B), de fleste som ble immunodepleted ved aktivert matriptase mAb M69 (Fig. 3 C), som bekrefter tilstedeværelsen av aktive matriptase i ekstracellulære miljø. Den tredje brystkreft celler, ligner SK-BR3 MCF7 og MDA-MB-468 med hensyn til syre-indusert matriptase aktivering (fig. 3D, kolonne 1), immunodepletion, og elueringen av kompleksdannede aktivert matriptase fra de aktiverte matriptase mAb kuler ( fig. 3D, sporene 2 og 3). Igjen ble den tryptiske aktiviteten genereres sammen med induksjon av matriptase zymogen aktivering skur og ikke beholdes med cellene (fig. 3 E), og hoveddelen av skur tryptiske aktiviteten var avledet fra aktiv matriptase (fig. 3 F).
A Hotell og
D
: MDA-MB-468 og SK-BR-3 menneskelige brystkreft celler ble overtalt til å aktivere matriptase (eller ikke) ved pH 6 (eller kontroll) buffer-eksponering. Cellelysater fremstilt fra cellene ble underkastet immunodepletion for å fjerne aktivert matriptase. Lysater fra ikke-aktiveringskontrollcellene (N), syre-aktiverte celler (A), M69 utarmet lysater (D), og den eluerte fraksjonen (e) ble analysert for total matriptase art ved immunoblot ved å bruke matriptase mAb M24.
B Hotell og
E
. MDA-MB-468 (
B
) og SK-BR-3 (
E
) ble behandlet med pH 6,0 buffer for å indusere matriptase aktivering. Etter nøytralisering, blanding av cellene og buffer (Kombiner), de pelleterte cellene etter sentrifugering (celle), og buffer supernatanten (utskilt fraksjon) alene (skur) ble analysert for tryptisk aktivitet.
C Hotell og
F
. MDA-MB-468 og SK-BR-3 cellelysater ble utarbeidet etter induksjon av matriptase aktivering immunodepleted hjelp av mAb M69. Cellelysatene (A-L) og immunodepleted fraksjoner (A-D) ble analysert for tryptiske aktivitet.
Regulering av matriptase i prostata og eggstokkreft celler
Matriptase er også uttrykt i prostata kreft, og de tre mest brukte prostatakreft linjer, DU145, PC3, og LNCaP alle uttrykker matriptase selv om DU145 uttrykker mye mindre enn de to andre linjer (fig. 4A, til venstre, søyle 1, 3 og 5). Alle tre linjer aktivere matriptase som respons på ekstracellulære syre eksponering som indikert ved tilstedeværelsen av 120 kDa matriptase-HAI-1-komplekset (Fig. 4A, venstre, sporene 2, 4 og 6), som også påvises når prøvene er immunoblottet ved å bruke aktivert matriptase-spesifikke mAb M69 (fig. 4A, rett, baner 2, 4 og 6). Acid eksponering av cellene også indusert utgytelsen av tryptiske aktivitet i det ekstracellulære miljøet ved PC3 og LNCaP celler, men ikke av DU145 celler (Fig. 4 B-D). Som med de brystkreftcellelinjer, de fleste av skur tryptiske aktivitet skur fra, PC3 og LNCaP celler, ble bekreftet å være assosiert med aktiv matriptase av immunodepletion som beskrevet ovenfor (data ikke vist). Mangel på detekterbar tryptisk aktivitet skur av DU145 celler ut på grunn av det lave nivå av matriptase ekspresjon i denne cellelinje. Disse dataene antyder at prostatakreftceller ligne brystkreft celler om den raske HAI-1-mediert hemming av celle aktiv matriptase og for å utgyte noen nivåer av fritt aktivt matriptase i det ekstracellulære miljøet.
A
. De menneskelige prostata kreft celler, DU145 (DU), PC3 (PC3), og LNCaP (LN) ble utsatt til pH 6,0 (eller kontroll) buffer for å indusere matriptase aktivering. Cellelysater fra pH 6-eksponerte celler (A, sporene 2, 4 og 6) og de ikke-aktiveringskontrollcellene (N, banene 1, 3 og 5), ble analysert for totalt matriptase arter (venstre) ved hjelp av mAb M24 og aktivert matriptase hjelp av mAb M69 (til høyre).
B
,
C
, og
D
. De menneskelige prostata kreft celler, DU145 (
B
), PC3 (
C
), og LNCaP (
D
) ble behandlet med pH 6,0 buffer for å indusere matriptase aktivering. Etter nøytralisering, ble kombinasjonen av cellen og skuret fraksjoner (kombinere), cellene fraksjoner alene (celle), og skuret fraksjonen alene (skur) analysert med hensyn til tryptisk aktivitet. RFU står for relative fluorescerende enheter.
To eggstokkreft cellelinjer som uttrykker matriptase, OCAR3 og OV2008, ble også undersøkt og avslørt identiske egenskaper med hensyn til matriptase aktivering indusert ved eksponering til pH 6,0 buffer med rask dannelse av aktiverte matriptase-HAI-1 komplekser, som ble utarmet av mAb M69 (fig. 5A). Verken cellelinje beholdt celleassosiert tryptisk aktivitet, men skur aktiviteten inn i bufferen, som ble bekreftet å være avledet fra aktiv matriptase ved immunodepletion hjelp av mAb M69 (fig. 5 B og C). Skjulet matriptase utstilt gelatinolytisk aktivitet, som igjen ble tømt av mAb M69 (Fig. 5D).
A
. Menneske eggstokkreft celler OVCAR3 ble overtalt til å aktivere matriptase ved pH 6,0 (eller kontroll) buffer. Cellelysater ble immunodepleted med mAb M69. Cellelysater av de ikke-aktiveringskontrollcellene (N, spor 1), de pH 6 aktiverte celler (A, spor 2), og den immunodepleted fraksjonen (D, spor 3) ble analysert for matriptase art ved hjelp av Western blot ved anvendelse av M24 mAb .
B
. og C. celler fraksjoner (celle), The Shed fraksjoner (felle), og de aktiverte matriptase fattig skur fraksjoner (tapper) av OVCAR3 (
B
.) celler og OV2008 celler (
C
.) ble analysert for tryptisk aktivitet. RFU står for relative fluorescerende enheter.
D.
OV2008 menneskelige eggstokkreft celler ble overtalt til å aktivere matriptase ved pH 6,0 buffer. Skjulet fraksjonen (kolonne 1) og den aktiverte matriptase-utarmet skur fraksjon (kolonne 2) ble analysert for matriptase gelatinolytisk aktivitet av gelatin zymografi.
Flertallet av den aktiverte matriptase skur av hematologiske kreftceller er skur som fritt aktivt matriptase
matriptase er også uttrykt i hematologiske kreftceller, men i sterk kontrast til celler av epitelial opprinnelse, de uttrykker ingen eller svært lave nivåer av HAI-1 [36], [37]. For å utforske matriptase aktivering og Shedding dynamikk i kreft i denne typen vi midlertidig utsatt RPMI 8226 menneske myelomatose celler og Ramos Burkitt lymfom celler til pH 6,0 buffer etterfulgt av justering til pH 8 med Tris buffer som vi hadde gjort med epiteliale kreftformer. Høye nivåer av tryptisk aktivitet ble påvist i blandingen av celler og buffer (skur fraksjon) (fig. 6A), og når cellene og skur fraksjoner ble separert ved sentrifugering, ble den tryptiske aktiviteten bare detektert i skur fraksjon, og var ikke forbundet med cellene. Videre er den tryptiske aktiviteten var fullstendig fjernet når skuret fraksjonene ble tømt ved hjelp av de aktiverte matriptase mAb perler, noe som bekrefter at aktiv matriptase er kilden til den tryptiske aktiviteten detektert.
A
og
B.
Ramos menneskelige Burkitt lymfom celler (
A
) og RPMI 8226 menneskelige myelomatose celler (
B
) ble behandlet med pH 6,0 buffer for å indusere matriptase aktivering. Etter nøytralisering, kombinasjonen av cellen og skuret fraksjon (kombinere), cellefraksjonen alene (celle), og skuret fraksjonen alene (skur) ble analysert for tryptisk aktivitet.
C Hotell og
D
.
