Abstract
Bakgrunn
Transketolase lignende 1 (TKTL1) induserer glukose nedbrytning gjennom anaerobe veier, selv i nærvær av oksygen, favoriserer ondartet aerobic glycolytic fenotype karakteristisk for tumorceller. Som TKTL1 ser ut til å være en gyldig biomarkør for kreft prognose er målet med denne studien var å relatere sitt uttrykk med tumor stadium, sannsynligheten for svulst tilbakefall og overlevelse, i en serie av pasienter med kolorektal kreft.
Methodolody /hovedfunnene
tumorvev fra 63 pasienter diagnostisert med tykktarmskreft på ulike stadier av progresjon ble analysert for TKTL1 ved immunhistokjemi. Farging ble kvantifisert ved beregningsbildeanalyse, og sammenhenger mellom enzymet uttrykk, lokal vekst, lymfe-node engasjement og metastaser ble vurdert. De høyeste verdiene for TKTL1 uttrykk ble påvist i gruppen av scenen III svulster, som viste signifikante forskjeller fra de andre gruppene (Kruskal-Wallis test,
P
= 0,000008). Dypere analyser av T, N og M klassifikasjoner avdekket en svak sammenheng mellom lokal tumorvekst og enzymuttrykk (Mann-Whitney test,
P
= 0,029), en signifikant sammenheng av enzymet uttrykk med lymfe-node engasjement ( Mann-Whitney test,
P
= 0,0014) og en betydelig reduksjon i TKTL1 uttrykk forbundet med spredning (Mann-Whitney test,
P
= 0,0004).
Konklusjoner /betydning
Så vidt vi vet, har få studier undersøkt sammenhengen mellom variasjoner i TKTL1 uttrykk i primærtumor og metastasedannelse. Her rapporterer vi nedregulering av enzymet uttrykk når metastase vises, og en sammenheng mellom enzym uttrykk og regional lymph-node engasjement i tykktarmskreft. Dette funnet kan øke vår forståelse av metastaser og føre til nye og mer effektive behandlinger mot kreft
Citation. Diaz-Moralli S, Tarrado-Castellarnau M, Alenda C, Castells A, Cascante M (2011) Transketolase- som en Expression er modulert under Colorectal Cancer Progresjon og metastasering formasjonen. PLoS ONE 6 (9): e25323. doi: 10,1371 /journal.pone.0025323
Redaktør: Michael Lisanti, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 24 august 2010; Godkjent: 01.09.2011; Publisert: 27.09.2011
Copyright: © 2011 Diaz-Moralli et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den regionale autonome regjeringen i Catalonia (Generalitat) gjennom «Agencia de GESTIO ad’juts Universitaris jeg de Recerca» (2009 SGR 849 og 2009 SGR 1308), Ministerio de Ciencia e Innovación-spanske regjeringen og europeiske regionale utviklingsfond (ERDF) «Una manera de hacer Europa» (SAF2010-19273 og SAF2011-25726), «Instituto de Salud Carlos III» gjennom ISCIII-RTICC (RD06_0020_0046) og CIBEREHD, og »Asociación Española contra el kreft» ( «Fundación Científica y Junta de Barcelona «). MC erkjenner mottatt støtte gjennom prisen «ICREA Academia» for fremragende forskning, finansiert av ICREA foundation-Generalitat de Catalunya. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tumor utvikling er forårsaket av en sekvensiell oppbygging av genetiske og epigenetiske endringer som fører cellene gjennom en flertrinnsprosess som gjengir friske celler ondartet [1] – [4]. Gjennom hele denne prosessen, endringer som favoriserer dannelsen av primære tumorer som regel avviker fra de tilpasninger som kreves for avanserte karsinogenese [5] – [7]. Carcinogenesis utbruddet er på grunn av deregulering av celle-celle og celle-matrise interaksjoner vekstinhibitoriske og akkumulering av flere genetiske endringer som fører til aktivering av proto-onkogener og hemning av tumor-suppressor-gener [7], [8]. Etter disse tidlige hendelser, utvikler ondartet transformasjon, styrt av en prosess med darwinistisk utvalg der fenotyper, snarere enn genotyper, er valgt. Dette gir tumorceller en fordel i forhold til ikke-transformerte celler. Dette valget av fenotyper, uavhengig av de tilknyttede genotyper, er grunnlaget for den høye genetisk heterogeniteten av kreftceller, siden forskjellige (epi) genetiske mekanismer kan konvergere i lignende fenotyper [7], [9]. En av de viktigste fenotypiske egenskapene til kreftceller er aerob glykolyse assosiert med forhøyet, men ineffektiv, ATP produksjon, så vel som høy produksjon av NADPH og syrer (H
+) som for eksempel laktat [10]. Dette fenomen, kjent som «Warburg-effekten», ble beskrevet av Otto Warburg i 1924 [11]. Den danner grunnlaget for positronemisjonstomografi (PET), en teknikk som er mye brukt til å detektere endringer i glukoseforbruk hos kreftpasienter. Den høye glykolytisk frekvens er ikke rettferdiggjøres ved energisk krav, ettersom mer enn 80% av ATP-syntese i tumorceller forekommer ved oksidativ fosforylering, og bare ca. 17% skjer gjennom Embden-Meyerhof veien (EMP). Disse mengdeforhold er lik dem som finnes i ikke-tumorceller [12]. På den annen side, er NADPH formasjon viktig for tumor-celle metabolisme, da det beskytter dem mot oksidativt stress og gir brensel til økt forekomst av fettsyresyntese karakteristisk for kreftceller. Til slutt, laktatproduksjon og mikromiljøet surgjøring gi tumorceller en fordel i forhold til friske celler, ved å forbedre deres invasivitet og metastase [7], [13] – [16]. Overraskende, er forsuring av miljøet uavhengig av EMP, siden i glykolyse synte celler dette fenomenet er fortsatt observerbar [17], [18].
I tillegg til aerob glykolyse, den pentosefosfateveien pathway (PPP) er viktig for tumor metabolisme, ettersom mer enn 85% av ribose nødvendig for nukleinsyresyntese i tumorceller blir generert, direkte eller indirekte, fra den ikke-oksiderende gren av PPP [19]. Derfor ligger den PPP på basis av tumor metabolisme-regulering. G6PDH og TKT, som kontrollerer den veien, er nok til å forklare de grunnleggende metabolske funksjoner overtas av kreftceller under transformasjon. Gjennom PPP, cellene ikke bare syntetisere nukleinsyresekvensene forløpere som er nødvendige for å opprettholde den akselererende formeringshastigheten karakteristisk i kreft. G6PDH regulerer fluksen av den oksidative gren gjennom hvilken NADPH syntetiseres og CO
2 frigjøres, noe som fører til matrise surgjøring av karboanhydrase. Den tiamin-avhengig enzym TKT viser den høyeste styrekoeffisient forhold til den ikke-oksidative gren av veien, og viser dens nøkkelrolle i reguleringen av PPP [20], [21]. TKT er postulert å knytte PPP og EMP i kreftcellene, slik at oksygen-uavhengig glukose nedbrytning [22]. På den annen side har den rolle TKT i tumor-cellemetabolismen blitt understreket av rapporter om en betydelig reduksjon i tumor-celleformering etter behandling med spesifikke TKT inhibitorer, både
in vitro
og
in vivo product: [21] – [30]. Dessuten, når TKT er aktivert ved tilsetning av sin kofaktor, tiamin, tumorvekst stimuleres [31].
Én TKT og to transketolase-lignende gener (TKTL1 og TKTL2) har blitt beskrevet i det humane genom [32 ]. Dette funn har ført til undersøke ekspresjonen av alle tre enzymer i kreftceller og konkluderer med at TKTL1 var den eneste spesifikt oppregulert i tumorer [33]. Senere studier viste at TKTL1 er ansvarlig for rundt 60% eller 70% av transketolase aktivitet i menneskelever og tykktarm-kreftceller [33] – [35] viser den viktige rollen spilt av dette isoenzymet i disse svulstene. Det har vært en teori om at TKTL1 kan generere acetylCoA for fettsyrer, noe som ville knytte anaerob glukose nedbrytning og lipogenese [32]. Videre overekspresjon av enzymet har blitt rapportert i flere tumorceller og vev, f.eks i tykktarm og urothelial kreft [33], [36], magekreft [37], ulike gynekologisk kreft (eggstokkene, granulose celle av eggstokk og livmor cervix) [38] – [40], brystkreft [41], [42 ], papillær skjoldbrusk karsinom [43] og ikke-småcellet lungekreft [44]. Det er også blitt vist at den spesifikke inhibering av TKTL1 ekspresjon av shRNA utløser apoptose og hemmer tumorvekst [35]. Denne korrelasjonen mellom overekspresjon av TKTL1 og tumorvekst, dårlig overlevelse og tumor tilbakefall, i tillegg til den transkripsjonelle oppregulering av enzymet uttrykket forårsaket av promoter demetylering [45] førte Smith og medarbeidere å foreslå enzymet som en potensiell proto-onkogen [46 ]. Videre har det også blitt foreslått at TKTL1 induserer den ondartede aerobe glykolytiske fenotype ved å forbedre fruktose-6-fosfat og glyceraldehyd-3-fosfat-produksjon, noe som resulterer i forhøyede flukser til pyruvat og laktat [16], [46]. Det er likevel et behov for mer detaljert studie av korrelasjonen av TKTL1 med tumorprogresjon i kolorektal cancer, for å klargjøre dets rolle i lymph node-ømhet og metastasering. Videre har til dags dato bilde kvantifisering av enzym-ekspresjon i vev er utført av semikvantitative metoder basert på ekspert observasjon og subjektiv vurdering [38], [47] beviser behov for en forbedring i evalueringssystem som gjør det mulig å oppnå objektive resultater.
Her presenterer vi en ny bildeanalyse kvantifisering metode for evaluering av immunostains som tillater oss å undersøke hvordan TKTL1 uttrykk varierer med progresjon scenen i en serie av kolorektal karsinom. Prøvene er klassifisert i fire grupper eller stadier av progresjon (I-IV) i henhold til den amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) iscenesettelse anvisningen (sjette utgaven), som tar hensyn til transmuralt forlengelse, lymfe node engasjement og tilstedeværelse av fjernmetastaser. Mulige sammenhenger mellom TKTL1 uttrykk og tumorprogresjon er undersøkt, for å bestemme sin rolle under svulst utvikling.
Resultater
Pasienter
Uttrykk for TKTL1 ble analysert ved immunhistokjemi i 63 pasienter med primære kolorektal kreft (CRC). Demografiske, kliniske og kreftrelaterte egenskaper er oppført i tabell S1 og Tabell S2. Etter en median oppfølging av 49 måneder hadde 26 pasienter døde.
Immunhistokjemisk påvisning av TKTL1 uttrykk
Primære svulster inkubert med anti-TKTL1 antistoff viste signifikant merking, mens kontrollprøver ikke viser enhver uspesifikk merking (figur 1 og figur 2). Levene og Cochrand tester ikke fastslå at våre data normalt ble distribuert (resultater ikke vist) så vi utført metriske tester for å vurdere betydningen av forskjellene. Ved å bruke Mann-Whitney U eller Kruskal-Wallis tester, bekreftet vi at TKTL1 uttrykket ikke ble kjønns eller aldersavhengig (resultater ikke vist). Klinisk-patologisk og immunhistokjemiske data er oppsummert i tabell S1.
Disse farge photomicrographs avsløre cytoplasmatic immunhistokjemisk farging (brune innskudd) for transketolase lignende 1 (TKTL1) i tykktarmssvulster (original forstørrelse × 200). I høyre kolonne (E-H) det er farget vev på ulike stadier av progresjon og i den venstre kolonnen (A-D) homologe områder i negative kontroller. Farging for TKTL1 er observerbare i alle positive prøver, noe som indikerer dens uttrykk i tumorvev; den høyeste intensitet er oppdaget i stadium III prøver.
Disse monokromatiske photomicrographs ble analysert med ImageJ programvare for å kvantifisere farging og evaluere TKTL1 uttrykk (opprinnelig forstørrelse × 200). I høyre kolonne (E-H) er farget vev på ulike stadier av progresjon og i venstre kolonne (A-D) homologe områder i negative kontroller.
TKTL1 variasjoner i henhold til tumorstadium
uttrykk for TKTL1 varierte: 1,8 til 26,4 au (Mener, 13,3 ± 7,9) i stadium I svulster, 4,0 til 37,3 a.u. (Mener, 20,8 ± 9,9) i fase II, 17,3 til 50,0 a.u. (Mener, 32,9 ± 11,5) i stadium III og 3,7 til 41,3 a.u. (Gjennomsnitt, 13,7 ± 8,7) i trinn IV (figur 3A). Disse dataene viser at uttrykk for TKTL1 i fase III svulster var høyere enn på noe annet stadium (Kruskal-Wallis test,
P
= 0,00003, figur 3B). Men en prøve (id. # 7118) viste et unormalt høyt verdi (41,3) i forhold til resten av prøvene i denne gruppen. Den Dixon Q-test identifisert denne verdien som en avvikende med et konfidensnivå på 99,9% og følgelig ble det ekskludert fra analysen. Etter eksklusjon av denne prøven, TKTL1 uttrykk i stadium IV svulster varierer 3,7 til 20,8 a.u. (Mener, 12,0 ± 5,1) og uttrykk for TKTL1 i fase III svulster bli enda mer annerledes (Kruskal-Wallis test,
P
= 0,000008).
Disse grafene viser uttrykk for transketolase- som en (TKTL1) i CRC vev analysert, delt på grupper etter deres stadium av progresjon. (A) Hvert punkt svarer til en prøve. I stadium IV gruppen korset representerer en avvikende. Gjennomsnitt er preget av en horisontal svart linje i hver gruppe. (B) Denne boksen-and-whisker plott viser forskjeller mellom gruppene. Uteliggeren av stadium IV gruppen er representert ved en svart firkant. Stage III gruppe er vesentlig forskjellig fra resten av gruppene (Kruskall-Wallis test,
P
= 0,000008).
TKTL1 uttrykk i fase III svulster var betydelig høyere enn på noe annet progresjon scenen. Dessuten, når betraktet hver for seg, viste nesten hver enkelt scene signifikant forskjellige verdier for TKTL1 ekspresjon fra både den foregående og den etterfølgende trinn: trinn I viste en tendens til å være lavere enn stadium II (Mann-Whitney U-test,
P
= 0,06). Enzym uttrykk i trinn II svulstene var betydelig lavere enn i fase III svulster (Mann-Whitney test,
P
= 0,02) og stadium III verdiene var betydelig høyere enn de av stadium IV (Mann-Whitney U test,
P
= 0,000003).
Sammenheng mellom tilstedeværelsen av fjernmetastaser og tumor TKTL1 uttrykk
En sterk nedgang i primærtumor TKTL1 uttrykk ble observert hos pasienter som hadde hatt fjernmetastaser. Faktisk prøver fra pasienter uten metastaser (M0) viste uttrykk verdier mellom 1,8 og 50,0 a.u. (Middel 23,5 ± 12,4) mens verdier for prøver fra pasienter som utviklet fjernmetastaser (M1) varierte 3,7 til 20,8 a.u. (Gjennomsnitt 12,0 ± 5,1) (Mann-Whitney U test,
P
verdi = 0,0004) (figur 4A). Tatt i betraktning de forskjeller mellom M0 (ikke-metastatisk) og M1 (metastatisk) svulster, utførte vi følgende sammenligninger bare for prøver fra M0 gruppen.
Disse søylediagrammer illustrerer sammenhengen mellom transketolase-lignende en ( TKTL1) uttrykk og kreft klassifisering verdier. (A) Tumor TKTL1 uttrykk hos pasienter som ikke presenterer med fjernmetastaser (M0) er betydelig høyere enn uttrykket hos pasienter som hadde utviklet metastaser (M1) (Mann-Whitney U test,
P
= 0,0004) . (B) Hos pasienter som ikke hadde utviklet metastaser, tenderer uttrykk for TKTL1 å være lavere i tidlig stadium svulster med hensyn til transmuralt invasjon (T1-2) enn i mer avanserte svulster (T3-4) (
P
= 0,029, Mann-Whitney U-test). (C) lymfeknute invasjon korrelerer med en økning i TKTL1 uttrykk i primærtumor (Mann-Whitney U test,
P
= 0,0014).
TKTL1 engasjement i tumorprogresjon
Med hensyn til transmuralt progresjon, tidlig stadium svulster (T1 og T2) present TKTL1 uttrykk verdier mellom 1,8 og 45,5 au (Middel 16,5 ± 12,6), mens ekspresjonen av enzymet i mer avanserte primærtumor (T3 og T4) varierte 4,0 til 50,0 a.u. (Gjennomsnitt 25,5 ± 11,8). Disse dataene indikerer en svak økning i TKTL1 uttrykk når lokal utvikling av tumor øker (Mann-Whitney U test,
P
= 0,029, figur 4B).
TKTL1 uttrykk i prøver uten regional lymph- node engasjement (N0) varierte 1,8 til 37,3 au (Gjennomsnitt 18,6 ± 9,8), mens de tilsvarende verdier for de med regional lymph-node engasjement (N1 og N2) varierte 17,3 til 50,0 a.u. (Gjennomsnitt 32,9 ± 11,5) (Mann-Whitney U test,
P
= 0,0014) (Figur 4C).
TKTL1 uttrykk og overlevelse
Univariat Kaplan-Meier analyse gjorde ikke avsløre signifikant sammenheng mellom TKTL1 farging og overlevelse i CRC vevsprøver (Mantel-Cox log-rank test,
P
= 0,37) (figur 5A). På den annen side, oppstår når behandlingen muligens forskjeller. Våre data indikerer en signifikant sammenheng mellom TKTL1 uttrykk og overlevelse hos pasienter behandlet med 5-fluoroacyl (Mantel-Cox log-rank test,
P
= 0,017) (figur 5B), er denne sammenhengen ikke observert hos ubehandlede pasienter (Mantel-Cox log-rank test,
P
= 0,993) (figur 5C).
(A) Kaplan-Meier plott samkjøre TKTL1 uttrykk og overlevelse hos pasienter med ikke-metastatisk CRC. (B) Kaplan-Meier plott samkjøre TKTL1 uttrykk og overlevelse hos ubehandlede pasienter. (C) Kaplan-Meier plott samkjøre TKTL1 uttrykk og overlevelse hos pasienter med CRC behandlet med 5-fluoroacyl. Solid linjen representerer de med TKTL1 uttrykk under gjennomsnittsverdien, og stiplet linje representerer de med TKTL1 uttrykket ovenfor gjennomsnittsverdien for hver gruppe.
Validering av bildeanalyse basert farging kvantifisering metode
for validering av bildeanalyse kvantifisering metode, ble 5 prøver som tilhører stadium i, II og III av progresjon, og med forskjellig TKTL1 uttrykk nivå analysert ved western blot. Immundeteksjon av TKTL1 og aktin som lasting kontroll viste en klar korrelasjon mellom TKTL1 ekspresjon bestemt ved Western blot og ved immunohystochemical analyse (Figur 6).
TKTL1 protein og aktin ble analysert ved western blot ved anvendelse av spesifikke monoklonale antistoffer. TKTL1 /loven representerer kvantitativ analyse av TKTL1 korrigert av aktin. TKTL1 IHC er uttrykk verdier av TKTL1 bestemmes av immunohystochemical analyse. Alle de fem tykktarmskreft prøve homogenates analysert viser lignende uttrykk verdier for TKTL1 i begge analysene.
Diskusjoner
uttrykk for TKTL1 har blitt oppdaget og korrelert med flere typer kreft så langt . Mesteparten av forfatterne som rapporterer korrelasjoner følge en protokoll som er analog med den som er beskrevet i den aktuelle papir, ved anvendelse av samme antistoff og kit for immunologisk farging. Men til dags dato den evalueringen av farging var unøyaktig, siden det har vært utført søker en semikvantitativ system basert på tildeling av score av observatører. Den aktuelle manuskript beskriver en ny og mer objektiv system for å kvantifisere farge gjennom beregningsbildeanalyse. Denne teknikken gjør det mulig å oppnå kvantitative data fra immunohystochemical flekker som fører til en mer nøyaktig evaluering av enzym uttrykk. Derfor rapporterte metoden er avslørt som en virkelig kraftig verktøy for immunohystochemical kvantifisering av protein uttrykk som gir saklig numeriske data i stedet for vilkårlige poeng.
Våre resultater gir bevis for at TKTL1 uttrykk i primær kolorektal kreft er sterkt korrelert med tumorprogresjon . Evnen til å degradere glukose under anaerobe forhold er avgjørende for tumorvekst, særlig ettersom den primære svulsten utvider seg og de indre cellene blir båret bort fra den basalmembran og deres oksygentilførsel. I denne situasjonen, overfører TKTL1 overekspresjon en fordel på ondartede celler og gir dem mulighet til å vokse raskere. Våre data viser at TKTL1 uttrykk korrelerer sterkt med lokal progresjon (T) og regional lymfeknute hengivenhet (N). Dette er første gang at korrelasjonen mellom TKTL1 uttrykk og N-klassifikasjon er rapportert hos CRC. Videre viser vi at korrelasjonen er sterkere enn mellom TKTL1 ekspresjon og T klassifikasjon (figur 4B og C), noe som indikerer at effekten av enzymet øker etter hvert som tumoren skrider frem. Denne virkemåten er i samsvar med det funn at overekspresjon av TKTL1 favoriserer den anaerobe metabolisering av glukose, øke laktatproduksjon og indusering av miljøet surgjøringen som fremmer lokal invasivitet. Selv om våre data ikke viser noen signifikant sammenheng mellom tumor TKTL1 farging og pasient overlevelse, den univariate Kaplan-Meier analyse plottet i Figur 5A ville tendens til å foreslå at et større utvalg kan avsløre en signifikant sammenheng. Videre, selv om antallet av samples er liten, virker korrelasjon mellom TKTL1 ekspresjon og overlevelse hos pasienter som gjennomgår kjemoterapi klar. Den observerte korrelasjon antyder at 5-fluoroacyl kan være effektive i behandling av tumorer med høy TKTL1, de med en høy grad av lokal progresjon (figur 5B). Imidlertid, kjemoterapi ikke viser noen effekt på overlevelse av pasienter med tumorer som inneholder lave nivåer av enzymet, de metastatiske de (figur 5C). Disse dataene antyder at TKTL1 nivåer kan være en potensiell biomarkør for å forutsi tumor respons på kjemoterapi.
Den aktuelle studien viser også et annet interessant funn, svært betydelig reduksjon i TKTL1 uttrykk observert når man sammenligner ikke-metastaserende pasienter (M0) med metastatisk de (M1). Denne nedregulering av enzymet når metastase finner sted, i likhet med korrelasjon med den regionale lymfe-node engasjement, ikke har blitt rapportert tidligere. Dette er første gang at uttrykket av TKTL1 har blitt korrelert med tumor iscenesettelse og metastasedannelse i CRC. Interessant nok har lignende oppførsel er beskrevet i forekomst av mutert
ras
i CRC: forekomsten av mutasjoner øker fra -7% i tidlig adenom til ~55% i middels, og til -60% i slutten av karsinomer, men reduseres til ~45% i invasive karsinomer, noe som indikerer en implikasjon av denne mutasjonen i celle aggressivitet, men ikke i metastasized celler [7], [48].
reguleringen av TKTL1 uttrykk i tumorceller er stort sett uutforsket, men det er blitt foreslått at det kunne bli oppregulert i respons til hypometylering [46]. Mekanismen er ansvarlig for global demetylering i kreftceller er ukjent, selv om Ras-familien har vært implisert i regulering av metylering [49] – [52]. I de fleste tilfeller har Ras-signalisering er knyttet til hypermethylation og hemming av tumorsuppressorgener. Imidlertid har det også vært knyttet til demetylering i noen studier [53] – [56]. Her foreslår vi en ny rolle for Ras-signalisering i tumor transformasjon som består av aktivering av hypometylering forskjellige onkogener, inkludert TKTL1 i CRC.
Spesielt, har Ras Superfamily medlemmer vært innblandet i reguleringen av aerob glykolyse av økende glukoseopptak og 6-phosphofructo-2-kinase /fruktose-2,6-bisphosphates 3 (PFKFB3) ekspresjon [57] – [59]. PFKFB3 aktivitet fører til opphopning av fruktose-2,6-bisphosfate (F26bP) og den etterfølgende oppregulering av 6-phosphofructo-1-kinase (PFK-1) aktivitet, noe som til slutt fører til forhøyet laktatproduksjon. Den metabolske substrat for PFKFB3 og PFK-1-reaksjoner, som er avgjørende for laktatproduksjon, er fruktose-6-fosfat (F6P), ett av produktene av TKTL1. Videre favoriserer TKTL1 overekspresjon normoksiske stabilisering av malignitet fremmende transkripsjonsfaktor hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) [16] og oppregulering av nedstrøms glykolytiske enzymer slik som glukosetransportør 1 (GLUT1) og PFKFB3 [16], [ ,,,0],60]. Som vi har sett, spiller TKTL1 en viktig rolle i pyruvat og laktatproduksjon via sin endelige produkter, fruktose-6-fosfat og glyceraldehyd-3-fosfat. Derfor, siden pyruvat og laktat regulere hypoksi-induserbar genekspresjon og inaktiverer HIF-1α forråtnelse [61], [62], TKTL1 overekspresjon kan stimulere akkumulering av HIF-1α i et hypoksisk-uavhengig måte og fremme ekspresjon av HIF-1 -regulated gener involvert i glycolytic metabolisme, angiogenese og celleoverlevelse.
kort sagt, i kreft utbruddet, mutasjoner i Ras medlemmer kan samle og føre til TKTL1 arrangøren demetylering og aktivering av dens uttrykk. Dette fenomenet vil bli valgt fordi TKTL1 aktivitet ville tillate transformerte celler til å konsumere glukose i fravær av oksygen, produserer laktat og surgjøre deres mikromiljøet, og dermed styrke invasivitet. TKTL1 kan også føre til hypoksisk-uavhengig HIF-1α stabilisering og den påfølgende overekspresjon av flere glykolytiske og angiogene gener, noe som gir et egnet miljø for tumorprogresjon. Angående metastasedannelse to mulige mekanismer kan forklare den observerte data: i) TKTL1 overekspresjon ikke bare føre til tumorprogresjon, men også kan føre til at metastasedannelsen, og når metastase er etablert, er TKTL1 ikke lenger nødvendig, og som forekomsten av muterte
ras
, synker det. ii) TKTL1 er nødvendig for tumorprogresjon in situ og lokal invasivitet, men svulster som ikke overuttrykker enzymet er i stand til å vokse i sitt nærmiljø og indusere metastatisk atferd som en svulst overlevelsesstrategi gjennom en darwinistisk utvelgelsesprosessen.
Denne rapporten belyser rollen TKTL1 i tumorprogresjon, og har som mål å være det første skrittet mot en ny tilnærming til studiet av metastaser og kreftbehandling.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
etikk godkjenning for studien ble innhentet fra etisk komité ved Hospital Clinic i Barcelona, skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og all klinisk undersøkelse har blitt gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i erklæringen Helsinki.
Pasienter
i denne studien, 46 menn og 17 kvinner (70 ± 11 år) med kolorektal kreft (CRC) som ble operert mellom november 2000 og oktober 2001 ble inkludert. Ifølge TNM klassifisering av tykktarm og endetarmskreft av amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC), 9 pasienter presenteres med scene jeg svulster, 21 med fase II, 16 med stadium III og 17 med stadium IV.
Alle pasienter ble rekruttert ved Gastroenterology Institutt for Hospital Clinic i Barcelona, og var en del av EPICOLON prosjekt, en prospektiv, multisenter, landsdekkende, ble populasjonsbasert studie som tar sikte på å etablere forekomst og kjennetegn ved arvet og familiære med kolorektal kreft former i Spania [63]. I dette prosjektet ble alle nydiagnostiserte CRC pasienter i alle deltakende sentrum i løpet av ett år ble inkludert i studien.
Etter kirurgisk reseksjon, pasienter gjennomgikk vanlige terapeutiske og oppfølgingstiltak i henhold til anbefalte retningslinjer. Faktisk, postoperativ adjuvant behandling med 5-fluorouracil og folinsyre ble rutinemessig gitt til pasienter med stadium II og III svulster, og strålebehandling ble indisert hos pasienter med endetarmskreft. Postoperativ overvåkning besto av sykehistorie, fysisk undersøkelse og laboratoriestudier inkludert serum carcinoembryonic antigen (CEA) nivåer hver tredje måned, abdominal ultralyd eller computertomografi hvert halvår, og brystet røntgenbilde og total koloskopi gang i året. Videre alle tumorer som oppdages under oppfølgingen ble histologisk bekreftet.
Immunhistokjemisk farging
Umiddelbart etter kirurgisk reseksjon, svulster var snap-frosset og oppbevart i flytende nitrogen. For å utføre farging ble CRC seksjoner innhentet ved hjelp vibrotom kutt, ble desiccated å hindre nedbrytning og holdt ved normale laboratorieforhold inntil bruk.
kolorektalcancer prøvene ble kuttet i deler av 2-5 mikrometer, plassert på lysbilder og festes med paraformaldehyde. Glassene ble hydrert ved å skylle dem i avtagende konsentrasjoner av etanol. For antigen avsløring Prøvene ble oppvarmet til 65 ° C ca. i 10 mM natriumsitratbuffer (pH 6,0) i 5 minutter. Etter skylling i destillert H
2o, inhibering av endogen peroksidase ble utført med en 10 minutters inkubasjon med 3% H
2o
2. Platene ble vasket med PBS og inkubert med 3% BSA i PBS i 15 min for å blokkere uspesifikk farging. Etterpå snittene ble inkubert med et muse-monoklonalt anti-TKTL1 antistoff (klon JFC12T10) som beskrevet tidligere av Coy [32] ved en konsentrasjon på 4 ug ml
-1 i 60 min i et fuktet kammer ved romtemperatur. Deretter ble objektglassene vasket med PBS, inkubert med biotinylerte anti-mus immunoglobuliner (biotinylert Link, LSAB + -kit, DakoCytomation, Hamburg, Tyskland) i 25 min, og etter en ny vask med PBS, ble behandlet med streptavidin-peroksidase (Streptavidin-HRP , LSAB + -kit, DakoCytomation, Hamburg, Tyskland) for 25 min mer. Endelig prøver ble inkubert med 3,3′-diaminobenzidin (DAB + kromogen, DakoCytomation, Hamburg, Tyskland) i 20 minutter ved romtemperatur for å oppnå farging.
TKTL1 ekspresjon ble evaluert med bildeanalyse ved hjelp av et Leica DM 4000 B mikroskop (Leica Microsystems, Tyskland), en monokromatisk IEEE-1394 CFW-1312M kamera (Scion Corporation, Frederik, MD, USA) og den offentlige sfæren NIH bildeprogram ImageJ, tilgjengelig via internett fra URL: http: //rsbweb .nih.gov /ij /. Intensiteten ble målt som «relativ intensitet /area» og kvantifisert ved interpolering til en kalibreringskurve plottet ved hjelp av en grå skala. For hver prøve 3 eller 4 bilder fra forskjellige områder ble tatt og farging av en homolog område av en negativ kontroll, inkubert med 3% BSA i PBS uten anti-TKTL1 antistoff, ble subtrahert. Verdiene presenteres som «Relativ verdi × 1000» vilkårlige enheter (a.u.). Denne typen Informatics kvantifisering av fargings krever åtte-bits monokromatiske bilder (figur 2) og kvantifiserer grå intensitet innenfor et kalibrerings skala [64], [65] gir en evaluering av TKTL1 uttrykk som tillater mye mer objektiv sammenligning mellom prøvene enn klassifikasjoner av vilkårlige poeng.
protein Extraction
Totalt protein ble renset 6-19 mg av frosne kirurgiske prøver. Prøvene ble lydbehandlet ved 4 ° C med en titan sonde i lyseringsbuffer inneholdende 20 mM HEPES pH 7,5, 10% (v /v) glyserol, 0,4 M NaCl, 0,4% (v /v) Triton X-100, 10 mM EGTA, 5 mM EDTA, 25 mM NaF, 25 mM Na-p-glycerofosfat, 1 mM DTT, 1 x proteasehemmere, 0,4 mM Pefabloc SC og 20 ug /ml pepstatin. Etter ultralydbehandling ble prøvene sentrifugert ved 4 ° C og 16 000 RCF i 20 minutter.
