Abstract
Innledning
Veksten og uttrykk for kreft stamceller (cscs) avhenge på mange faktorer i svulsten mikromiljøet. Målet med dette arbeidet var å undersøke effekten av kreftceller «vev opprinnelse på den optimale matrise stivhet for CSC vekst og markør uttrykk i en modell polyetylenglykol diacrylate (PEGDA) hydrogel uten forstyrrelser av andre faktorer i mikromiljøet.
Metoder
Menneskelig MCF7 og MDA-MB-231 bryst karsinom, HCT116 colorectal og AGS gastrisk karsinom, og U2OS osteosarkom celler ble brukt. Cellene ble innkapslet i PEGDA geler med kompresjonsmoduler i 2-70 kPa område og optimal celletetthet poding av 0.6×10
6 celler /ml. Micropatterning ble brukt for å optimalisere veksten av innkapslede celler i forhold til gjennomsnittlig tumorsphere størrelse. CSC sub-populasjon av de innkapslede celler ble preget av celle nummer, tumorsphere størrelse og antall tetthet, og mRNA uttrykk for CSC markører.
Resultater
Den optimale matrise stivhet for vekst og markør uttrykk av CSC sub-populasjon av kreftceller var 5 kPa for brystkreft MCF7 og MDA231, 25 kPa for tykktarms HCT116 og mage AGS, og 50 kPa for bein U2OS celler. Konjugering av et CD44 bindende peptid til gelen stoppet tumorsphere dannelsen av kreftceller fra forskjellige vev opprinnelse. Uttrykket av YAP /TAZ transkripsjonsfaktorer ved de innkapslede kreftcellene var høyest på en optimal stivhet som indikerer en kobling mellom Hippo transdusere og CSC vekst. Den optimale gjennomsnittlige tumorsphere størrelse for CSC vekst og markør uttrykk var 50 mikrometer.
Konklusjon
markør uttrykk Resultatene tyder på at CSC sub-populasjon av kreftceller ligger innenfor en nisje med optimal stivhet som avhenger av kreftceller «vev opprinnelse
Citation. Jabbari E, Sarvestani SK, Daneshian L, Moeinzadeh S (2015) Optimal 3D Matrix Stivhet for vedlikehold av kreftstamceller er avhengig tissue Origin av kreftceller. PLoS ONE 10 (7): e0132377. doi: 10,1371 /journal.pone.0132377
Redaktør: Adam J. Engler, University of California, San Diego, USA
mottatt: 02.03.2015; Godkjent: 13 juni 2015; Publisert: 13.07.2015
Copyright: © 2015 Jabbari et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler til EJ fra National Science Foundation i henhold til tildelings No. CBET1403545 og National Institutes of Health i henhold til tildelings No. AR063745. Virkemiddelapparatet ikke har noen rolle i å utforme eksperimenter eller i utarbeidelsen av dette manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne viser ingen potensielle interessekonflikter
Innledning
En viktig faktor som bidrar til kreftdødelighet er tilbakefall etter kirurgi, strålebehandling eller medikamentell behandling [1,2]. Brystkreft påvirker 30% av pasientene [3], mens opptil 50% av pasienter med kolorektal kreft opplever tilbakefall [4]. Malignitet i cancer antas å være knyttet til eksistensen av en liten sub-populasjon av stamceller (cscs) i tumoren med forhøyet motstandsevne mot kreftterapi [5]. I samsvar med det, den mest aggressive trippel-negativ brystkreft eller metastatisk stadium III tykktarmskreft har den høyeste sub-populasjon av cscs mellom ulike typer [6,7]. Derfor er sentral i kreftbehandling forstå faktorer i svulsten mikromiljøet som bidrar til CSC vekst [8].
Underlags stivhet påvirker avstamning engasjement og skjebnen til stamceller [9]. Et mykt substrat retning og differensiering av stamceller (MSC) til nevrogen avstamning, mens et substrat med middels og høy stivhet fører til differensiering av MSC til myogeniske og osteogene linjene, henholdsvis [10]. Substrat stivhet påvirker også skjebnen av maligne celler [11] som stivheten av hyperplastisk ErbB2-overuttrykkende MCF10AT humane bryst epitelceller øket i respons til økt stivhet i kollagenmatriksen [12]. Rollen til 3D matrise stivhet på vekst og markør uttrykk for CSC sub-populasjon av kreftceller fra ulike cellelinjer er ikke undersøkt og forholdet mellom matrise stivhet, CSC vekst, og epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er ikke kjent.
Siden prosessen av kreft initiering kan ta lang tid, og det er vanskelig å studere in vivo, in vitro kultursystemer har blitt utviklet for å studere cscs. Cscs dyrket i suspensjon i et ikke-klebende underlag er morfologisk forskjellige i forhold til de i tumorvevet [13]. Naturlige ECM komponenter er mye brukt som en 3D-matrise for å fremme in vivo som morfogenese av cscs [14], men biologiske matriser er iboende variabel sammensetning og variasjoner i matrise-blandingen kan forandre ligand /reseptor tetthet [11]. Videre ligand-reseptor-interaksjoner og kjemiske stimuli i biologiske matriser ofte maskere virkningen av mekaniske stimuli på celler [15]. Vi har tidligere vist at bryst cscs selektivt vokse i ikke-klebende polyetylenglykol diakrylat (PEGDA) gels og skjema tumorspheres når kreftcellene er innkapslet i gelen [16,17]. På grunn av fravær av ligand-reseptor-interaksjon, har den ikke-stamcelle populasjon av de innkapslede celler som ikke vokser i gelen som førte til selektiv anrikning av cscs. Vi har tidligere observert en bifasisk forbindelse mellom ekspresjonen av CSC markører og matrise stivhet for brystkreftceller [16]. Endringen i vev stivhet med kreft progresjon kan være en iboende respons fra CSC sub-befolkningen til å optimalisere vekst og uttrykk for stamcellemarkører. Menneske HCT8 kolorektal carcinoma celler viste en metastatisk fenotype i 20-50 kPa stivhet området [18] mens osteosarkom cellene samhandlet optimalt med substrater på 55 kPa stivhet [19]. Vi antok at den optimale matrise stivhet for vekst og ekspresjon av CSC markører avhengig av kreftcellenes vev opprinnelse. Derfor er målet med dette arbeidet var å undersøke effekten av gel stivhet på vekst og markør uttrykk for CSC sub-populasjon av kreftceller avledet fra ulike vev. De testede cancerceller ble MCF7 og MDA-MB-231 bryst adenokarsinom, HCT116 kolorektal karsinom, AGS gastrisk adenokarsinom, og U2OS osteosarcom-humane cellelinjer med ikke-tumorigen MCF10A epitelial cellelinje anvendt som kontroll. Micropatterning ble brukt til å styre den gjennomsnittlige størrelsen av de CSC koloniene dannet av kreftceller i PEGDA gel.
Materialer og metoder
Material
Lineær polyetylenglykol (PEG) med molekylvekt (MW) på 3,4 kDa ble kjøpt fra Acros (Pittsburg, PA). 4- (2-hydroksyetoksy) fenyl- (2-hydroksy-2-propyl) keton (Irgacure-2959) ble fotoinitiator fra Ciba (Tarrytown, New York). Akryloylklorid (Ac) og kalsiumhydrid var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). De beskyttede aminosyrer og Rink amid NovaGel harpiks ble mottatt fra EMD Biosciences (San Diego, California). Piperidin, tetrahydrofuran (THF), trimetylsilan (TMS), trietylamin (TEA), akrylsyre, dimetylsulfoksyd (DMSO), og etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt (EDTA) var fra Sigma-Aldrich. N, N-dimetylformamid (DMF), acetonitril (MeCN), N, N-diisopropyletylamin (DIEA), N, N»-diisopropylkarbodiimid (DIC), triisopropylsilan (TIPS), N, N-dimetylaminopyridin (DMAP), hydroksybenzotriazol (HOBt ), diklormetan (DCM), og trifluoreddiksyre (TFA) ble mottatt fra Acros. Spectro /Por dialyserør (molekylvekt cutoff 3,5 kDa) var fra Spectrum Laboratories (Rancho Dominquez, CA).
MCF7 (HTB-22) bryst adenokarsinom, MDA-MB-231 (HTB-26, heretter betegnet med MDA231) bryst adenokarsinom, HCT116 (CCL-247) tykktarmskreft, AGS (CRL-1739) adenokarsinom i ventrikkel, U2OS (HTB-96) osteosarkom cellelinjer, og MCF10A (CRL-10317) non-tumorigene epitelceller ble kjøpt fra ATCC ( Manassas, VA). Fosfat-buffer saltoppløsning (PBS) og Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) ble mottatt fra GIBCO BRL (Grand Island, NY). Hesteserum og DMEM-F12-medium var fra PAA Laboratories (Etobicoke, Ontario) og Mediatech (Manassas, VA), respektivt. Trypsin-EDTA, RPMI-160 cellekulturmedium, føtalt bovint serum (FBS), Alexa Fluor 594 Phalloidin, og Quant-det PicoGreen dsDNA reagenssett var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og epidermal vekstfaktor (EGF) var fra Lonza (Allendale, NJ). Bovint serumalbumin (BSA) var fra Jackson Immunoresearch (West Grove, PA). Alexa Fluor Phalloidin, CellTracker rød CMTPX fargestoff, og Live /Død celleviabilitet kit var fra Molecular Probes (Life Technologies, Grand Island, New York). Paraformaldehyde, 4,6-diamidino-to-phenylindole (DAPI), insulin, hydrokortison, koleratoksin, penicillin og streptomycin ble mottatt fra Sigma-Aldrich. Monoklonalt antistoff mot kanin YAP /TAZ transkripsjonsfaktorer ble mottatt fra Cell Signaling (Danvers, MA).
makromer og peptidsyntese
hydroksyl-endegrupper PEG makromeren ble omsatt med akryloylklorid for å fremstille PEG-diakrylat (PEGDA), som vi tidligere beskrevet [16,17]. Produktet ble renset ved utfelling i kald etyleter to ganger, dialysert mot deionisert (DI) vann fra DMSO, og frysetørket. Den kjemiske struktur av den funksjonaliserte makromeren ble karakterisert ved
1H-NMR som vi tidligere beskrevet [16]. Den akrylamid-termin CD44 bindende peptid Ac-RLVSYNGIIFFLK ble syntetisert manuelt på Rink Amid resin i den faste fase ved hjelp av en tidligere beskrevet prosedyre [20]. Etter spalting fra resinet, ble Ac-terminerte peptidet renset ved preparativ HPLC, frysetørket, og produktet ble karakterisert med en elektrospray ionisering (ESI) spektrometer som vi tidligere beskrevet [20]. En lignende prosedyre ble benyttet for å syntetisere det omkastede (mutant) Ac-VLFGFLKIYSRIN peptid.
Dyrking av tumorceller
Den følgende fremgangsmåte ble anvendt for innkapsling av tumorceller i PEGDA gelen [16]. MDA231, MCF7, HCT116 og AGS tumorceller ble dyrket på adherente vevskulturplater i RMPI-1640 medium med 10% FBS under 5% CO
2, mens U2OS-celler ble dyrket i DMEM-medium i henhold til leverandørens anvisninger. MCF10A-celler ble dyrket i DMEM-F12-medium supplert med 0,5 mg /ml hydrokortison, 10 ug /ml insulin, 100 ng /mL koleratoksin, 20 ng /ml EGF og 5% hesteserum i henhold til leverandørens anvisninger. 2D-cellekulturer ble trypsinert etter å ha nådd 70% sammenflyting og re-suspendert i PBS ved en densitet på 1×10
7 celler /ml. Gelen forløper oppløsning ble fremstilt ved å oppløse 100 mg PEGDA makromer i fotoinitiator-oppløsning (10 mg Irgacure-2959 i 1 ml PBS), og oppløsningen ble sterilisert ved filtrering. Deretter ble en spesifisert volum av tumorcellene ble jevnt suspendert i gelen forløper oppløsningen ved forsiktig blanding til en endelig densitet på 0.3-2.0×10
6 celler /ml. Den cellesuspen gelutgangsmaterialet Løsningen ble tverrbundet ved UV-bestråling med UV-lampe (svart-Ray, UVP, Upland, CA) på topp bølgelengde på 365 nm som vi beskrev tidligere [16]. Kompresjonsmodulen av celle-innkapslet geler ble målt ved hjelp av et reometer (TA Instruments, New Castle, DE) under en uniaksial kompresjonskraft som vi tidligere beskrevet [16]. Forløper-løsninger med 5, 10, 15, 20, og 25 vekt% PEGDA makromer produsert celle-innkapslet geler med 2, 5, 25, 50, og 70 kPa kompresjonsmoduler, henholdsvis [16]. Etter tverrbindingen, ble gelene skåret til skiver og inkubert i stamcelle-medium under dannelse av tumorspheres. Stamcelle medium besto av DMEM-F12 supplert med 0,4% BSA, 5 mg /ml insulin, 40 ng /ml bFGF, 20 ng /ml EGF, 5% hesteserum, 100 U /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin [21].
Micropatterning
følgende fremgangsmåte ble brukt til å kapsle kreftceller i et micropatterned gel. Til fysisk å separere celle-innkapslet gelsjiktet fra det stive glass-substrat, ble 40 ul av gel-forløper-løsning (25 vekt% PEGDA uten celler) overført til et objektglass med kantene er dekket med et biomedisinsk grad av klebebånd for å kontrollere gel tykkelse til innenfor 100 mikrometer. Deretter ble montasjen dekket med et glass dekkglass og UV-bestrålt i 8 min. For å generere et mønster, ble UV-masker utformet med en AutoCAD (AutoCAD 2010, Autodesk, San Rafael, CA) og skrives ut på en transparent ark som beskrevet [22]. Glass kantene var dekket med et andre lag av klebebånd og 40 mL av cellesuspen gel-forløper-løsning ble overført til gelen dekket glassplate, ble det UV masken plasseres over oppløsningen og presses mot klebebåndet med et glass lysbilde, og UV bestrålt i 5 min. Etter gele masken ble fjernet, ble celle-innkapslet gelen vasket med PBS og UV-bestråles i ytterligere 3 minutter for å fullføre gelering. Deretter ble det mønstrede celle-innkapslet gelen vasket med PBS, skrellet av fra glass-slide, og dyrket i stammecellekulturmedium. For levende celle sporing, ble svulstcellene inkubert med CellTracker fargestoff (1: 1000 fortynning) før innkapsling og farget levende celler ble fotografert med en invertert fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse Ti-ε, Melville, New York)
Tumorsphere bildebehandling og bestemmelse av celletallet
Livskraftig av de innkapslede celler ble bestemt to dager etter innkapsling med Levende /Døde analysen som vi tidligere beskrevet [16]. For å måle størrelse og antall av de innkapslede tumorspheres ble cellekjerner og cytoskjelettet visualisert ved farging med DAPI og phalloidin, henholdsvis, og avbildes med et Nikon fluorescerende mikroskop, som beskrevet tidligere [16,17]. Antall og størrelse fordelingen av tumorspheres ble kvantifisert ved å dele bilder til mindre firkanter og telling av antallet av kuler og måling av deres størrelse. Dobbelttrådet DNA innhold av gelene, som et mål på celleantall, ble målt med en Quant-det PicoGreen assay som tidligere beskrevet [23].
Sanntids PCR analyse
I hvert tidspunkt ble prøver manuelt, homogenisert og sonikert for å revne membranen av innkapslede celler. Totalt cellulært RNA i prøvene ble isolert ved anvendelse av TRIzol som tidligere beskrevet [23]. Etter revers transkripsjon (Promega, Madison, WI), ble omdannet cDNA kvantifisert ved RT-qPCR med SYBR grønn RealMasterMix (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved hjelp av Bio-Rad CXF96 PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) og det aktuelle genet spesifikke primere. Primere ble utformet og valgt å bruke Primer3 web-basert programvare som tidligere beskrevet [24] og syntetisert av Integrated DNA-teknologi (Coral, IA). Listen med forover og revers primer sekvenser er gitt i tabell 1. De designede Primersekvensene matchet med de rapporterte sekvenser for human CD44, ABCG2, CD133, OCT4, TGF-β, EGFR, og GAPDH [25-28]. PCR-data ble analysert ved bruk ΔΔct Sanntid analysemetode som tidligere er beskrevet [29]. mRNA uttrykk ble normalisert mot GAPDH referanse genet og brett endringer i forhold til de i samme gruppe ved tid null.
Flow cytometri
Celle-innkapslet gels ble fiksert med 4% para-formaldehyd, vasket med PBS, og inkubert i oksidativ degradering oppløsning (0,1M CoCl
2 i 20% hydrogenperoksid) i 2 timer [30]. Etter gel-degradering, ble suspensjonen sentrifugert og cellene ble vasket med kald PBS inneholdende 5% BSA. Deretter ble cellene inkubert med fykoerytrin (PE) muse-anti-human CD24 og fluorescein-isotiocyanat (FITC) muse-anti-human CD44 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i PBS med 5% BSA i 45 minutter på is i mørket. Deretter ble cellene vasket med kald PBS med 5% BSA og analysert ved hjelp av et strømningscytometer (FC500, Beckman Coulter, Brea, CA).
Immunoblotting og proteinanalyser
Prøvene ble homogenisert i RIPA buffer og homogeniserte prøvene ble sentrifugert i 5 min for å isolere de totale proteiner. Deretter ble proteinene separert ved standard SDS-PAGE ved anvendelse av den mini-gel-system (Bio-Rad) og overført til en nitrocellulosemembran ved den halvtørre overføringsapparat (Bio-Rad). Membranene ble inkubert i blokkeringsbuffer ved omgivelsesbetingelser i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med primære antistoffer (1: 1000) over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble membranene inkubert med pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1: 5000) i 1 time ved omgivelsesbetingelser. Etter omfattende vasking med en blanding av tris-bufret saltvann og Tween-20 (TBST), ble membranen inkubert med ECL påvisningsreagenser og eksponert for en røntgenfilm. Intensiteten av bandene ble kvantifisert med Image-J programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og kvantitative data uttrykt som middel ± standardavvik. Signifikante forskjeller mellom grupper ble evaluert ved anvendelse av en to-veis ANOVA med replikering test, etterfulgt av en to-halede studenter t-test. For å ta høyde for flere par sammenligninger, ble p-verdier fra t-tester korrigeres ved hjelp av falske Discovery Rate (FDR) metoden [31]. En verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Avhengighet av tumorsphere vekst på første celle seeding tetthet
Effekt av første celle seeding tetthet på tumorsphere formasjonen ble undersøkt med MDA231 celler på optimal gel modul på 5 kPa (figur 1). Gelen modulus for MDA213 celler er optimalisert med hensyn til tumorsphere formasjonen i neste avsnitt om «Avhengighet av optimal matrise stivhet for cscs på vev opprinnelse.» DAPI og Phalloidin farget bilde av de innkapslede celler som funksjon av første celletetthet fra 0.3×10
6 til 2×10
6 celler /ml er vist på figur 1A på dag null (venstre kolonne) og etter 9 dagers inkubering (høyre kolonne). CD44 cellemembran-glykoprotein blir brukt som en markør for karakterisering av bryst, tarm, mage, hode og nakke, lever, ovarie, bukspyttkjertelen og prostata cancer i kombinasjon med andre CSC markører [5]. ABCG2 av ABC transportproteinene er et godt studert markør for brystkreft cscs [32] og dens uttrykk er oppregulert i MDA231 CSC sub-befolkningen [33]. EGFR uttrykk er oppregulert i MDA231 celler [34]. MDA231 celler innkapslet i gelen ved en forholdsvis lav densitet såing av 0.3×10
6 celler /ml forble som enkeltceller etter 9 dager uten en betydelig økning i celletall (figur 1B) eller CSC markør ekspresjon (Fig 1C-1E) . De innkapslede celler ved høye tettheter på 1.5×10
6 og 2×10
6 celler /ml viste celle aggregering (fjerde og femte rader i figur 1A) og en betydelig økning i celleantall etter 9 dager (figur 1B), men innkapslede celler ikke danner tumorspheres som uttrykk for CSC markører ikke øke (figur 1C-1E). Omvendt, de innkapslede cellene ved moderate tettheter på 0.6×10
6 og 1×10
6 celler /mL dannet tumorspheres (andre og tredje rader i figur 1A) med en betydelig økning i celletall (figur 1B) og ekspresjon av CSC markører (fig 1C-1E, statistisk høyere enn grupper med initial celletetthet på 0.3×10
6, 1.5×10
6, og 2.0×10
6 celler /ml, Bord AC i S1 fil). Som den første celle seeding Tettheten ble øket fra 0.3×10
6-celle /ml til 0,6, 1,0, 1,5 og 2×10
6 celler /ml, celleantall etter 9 dager økte fra 0,12 ± 0,04 celler /ml til 2,1 ± 0,2, 4,8 ± 0,3, 4,5 ± 0,4 og 5,8 ± 0,4 celler /ml, henholdsvis, mens CD44 markøren uttrykket endret fra 0,6 ± 0,1 til 25,0 ± 1,6, 29,0 ± 1,7, 3,3 ± 0,9 og 3,2 ± 0,8. Videre er ekspresjon av CD44, ABCG2, og EGFR-markører etter 9 dager var betydelig høyere enn dag 6 (Figur 1C-1E).
(A) DAPI (blå) og phalloidin (rød) fargede bilder av innkapslede MDA231 celler (5 kPa gel) på dag null (venstre kolonne) og etter 9 dagers inkubering (høyre kolonne) versus opprinnelige antall celler; (B) Antall innkapslede celler etter 9 dagers inkubasjon som en funksjon av opprinnelig celleantall; mRNA-ekspresjon av CD44 (C), ABCG2 (D), og EGFR (E) markører for de innkapslede celler etter 6 og 9 dager med inkubasjon som en funksjon av opprinnelig celleantall; (F) E-cadherin mRNA-ekspresjon av de innkapslede celler etter 2, 4 og 6 dagers inkubasjon som en funksjon av den innledende celletallet. Skalaen stolpene i (A) er 200 um. En stjerne i (CE) indikerer en statistisk høyere (p 0,05) mRNA-ekspresjon i testgruppen sammenlignet med de grupper med utgangscelletetthet på 0.3×10
6, 1.5×10
6, og 2.0×10
6 celler /ml ved det samme tidspunkt. En stjerne i (F) indikerer en statistisk høyere E-cad ekspresjon i testgruppen sammenlignet med de grupper med utgangscelletetthet på 0.3×10
6, 0.6×10
6, og 1.0×10
6 celler /ml ved samme tidspunkt. P-verdier for stjernene i (C-F) er oppført i tabell A-D i S1 fil. Feilfelt tilsvarer middel ± 1 SD for n = 3.
E-cadherin mRNA uttrykk av de innkapslede celler (figur 1F) økte ikke med inkubasjonstid for første celle tettheter av 0.3×10
6, 0.6×10
6, og 1×10
6 celler /mL, men uttrykket økte signifikant ved høyere celletettheter på 1.5×10
6 og 2×10
6 celler /ml (figur 1F, betydelig høyere enn de grupper med utgangscelletetthet på 0.3×10
6, 0.6×10
6, og 1.0×10
6 celler /ml, Tabell D i S1-fil). E-cadherin mRNA uttrykk for den initielle celle såing tetthet på 1.5×10
6 celler /ml øket fra 1,9 ± 0,7 til 6,6 ± 1,7 og 24,2 ± 2,7 etter 2, 4 og 6 dagers inkubasjon, henholdsvis, mens uttrykket øket fra 3,7 ± 0,9 til 21,4 ± 1,8 og 40,3 ± 3,2 i den høyere seeding tetthet av 2×10
6 celler /ml. De innkapslede MDA231 celler med initial celle poding tetthet på 0.6×10
6 celler /ml dannes noe lavere antall sfærer i forhold til tettheten av 1.0×10
6 celler /ml. Derfor for å redusere celle-aggregering, ble alle etterfølgende eksperimenter gjort med den initielle celle såing tetthet på 0.6×10
6 celler /ml.
Avhengighet av tumorsphere vekst på kulturmedium i 2D og 3D
grupper inkludert MDA231 celler på 2D heft plater og kultivert i RPMI-1640 medium (2D-RPMI), celler på 2D-plater og dyrket i CSC medium (2D-CSC), og celler innkapslet i 5 kPa PEGDA gel og dyrket i CSC medium (3D-CSC). Celle tall økte for alle grupper med inkubasjonstid, men økningen var høyere for 2D-gruppene (figur 2A og 3D-CSC gruppe statistisk lavere celletall enn 2D grupper, Tabell E i S1 File). For hvilket som helst tidspunkt, celletallet for 2D-CSC gruppe var noe høyere enn 2D-RPMI men forskjellene var ikke statistisk signifikant. For hvilket som helst tidspunkt, celletallet for 3D-CSC var signifikant lavere enn 2D-grupper fordi cellevekst i den ikke-klebende PEGDA gel ble begrenset til stamcelle sub-populasjon. Uttrykket av CD44, ABCG2, og EGFR CSC markører i 2D grupper (blå og grønne kurver) økte ikke med inkubasjonstid og forskjellen i markør uttrykk mellom 2D-1640 og 2D-CSC gruppene var ikke signifikant (figur 2B-D ). Ekspresjonen av CSC markører for cellene i 3D-CSC-gruppen var mye høyere enn de i 2D-grupper (rød kurve Fig 2B-D, statistisk høyere enn 2D-gruppene, Tabeller F-H in S1 fil). Resultatene i figur 2 viser at jo høyere ekspresjon av CSC markører for celler i 3D-CSC gruppe var relatert til innkapsling av kreftceller i PEGDA gel, ikke endringen i dyrkningsmediet.
Antall tetthet (A) og mRNA-ekspresjon av CD44 (B), ABCG2 (C), og EGFR (D) markører for MDA231 celler som en funksjon av inkubasjonstid. Grupper inkludert celler på 2D-heftende plater og kultivert i RPMI-1640 medium (2D-RPMI), celler på 2D-plater og dyrket i CSC medium (2D-CSC) og celler innkapslet i 5 kPa PEGDA gel og dyrket i CSC medium ( 3D-CSC). En stjerne i (A) indikerer en statistisk lavere (p 0,05) celle nummer i testgruppen sammenlignet med 2D-grupper på samme tidspunkt. En stjerne i (B-D) indikerer en statistisk høyere (p 0,05) mRNA-ekspresjon i testgruppen sammenlignet med 2D-grupper på samme tidspunkt. P-verdier for stjernene i (A-D) er oppført i tabell E-H i S1 fil. Feilfelt tilsvarer middel ± 1 SD for n = 3.
(A) Prosedyre for celle innkapsling i micropatterned gel. CellTracker farget bilder av MDA231 celler innkapslet i den 5 kPa gel med sirkulære mønstre med diameter på 50 (B), 75 (C), 100 (D), 150 (E), og 250 (F) mikrometer etter 2 dagers inkubering ( skala barer i BF er 200 mikrometer). DAPI (blå) og phalloidin (rød) fargede bilder av 7 representative tumorspheres dannes av de innkapslede celler i (BF) fra forskjellige deler av mønstrede gelene etter 14 dagers inkubering med 50 (G), 75 (H), 100 (I ), 150 (J), og 250 (K) mikrometer mønstre (skala barer i GK er 50 mikrometer). Merk at de 7 representative tumorspheres i (G-K) er fra flere mønstre i gelen prøven, ikke et enkelt mønster, for å vise størrelsesområde og form av tumorspheres for et gitt mønster størrelse. Celle nummer (L), gjennomsnittlig tumorsphere størrelse (M), CD44 ekspresjon (N), og ABCG2 uttrykket (O) av cellene i (BF) med inkubasjonstid for 50 (rosa), 75 (blå), 100 (rød) , 150 (grønn), 250 (brun) um mønstre, og un-mønstrede gel (lilla). Feilfelt i (LO) tilsvarer gjennomsnitt ± 1 SD for n = 3.
Avhengighet av tumorsphere vekst på nisje størrelse
Micropatterning ble brukt til å kontrollere gjennomsnittlig tumorsphere størrelse i gelen (fig 3A). Fluorescerende bilder av cellTracker-fargede MDA231 celler i 5 kPa sirkulær gel mønstre med diameter på 50 til 250 pm viste ensartet celle poding 2 dager etter innkapsling (figur 3B-3F). DAPI og phalloidin-farget bilder av tumorspheres dyrket i mønstrene med en diameter på 50 til 250 pm er vist i figur 3G-3K. Det bør bemerkes at de syv tumorspheres er vist i hvert bilde (G-K) er fra flere mønstre i gelen prøven, ikke et enkelt mønster, for å vise størrelsesområde og formen på tumorspheres for et gitt mønster størrelse. Celle nummer (Fig 3L) og gjennomsnittlig tumorsphere størrelse (Fig 3M) økte jevnt med inkubasjonstid og mønster størrelse. For måling av celletettheten i de mønstrede gelene (figur 3L), ble prøvestørrelsen normalisert til den initielle celle seeding tetthet i gelene. Vi spekulerer i at etter celle seeding CSC under befolkningen vokste mens differensierte celler som baserte seg på celle-matrix samhandling ikke vokse i den ikke-heft PEGDA gel. Som et resultat av redusert celletettheten litt etter to dagers inkubering (Fig 3L). Når de innkapslede cscs vokste og dannet tumorspheres i gelen, økte den målte celletettheten til verdier som er større enn den opprinnelige tetthet av seeding 0.6×10
6 celler /ml. CD44 (Fig 3N) og ABCG2 (Fig 3O) markør uttrykk for tumorspheres dannet i FN-mønstrede gel og disse geler med 75-250 mikrometer mønstre i utgangspunktet økt med inkubasjonstid, toppet seg på dag 9, og deretter redusert. På den annen side, men da ekspresjon av disse tumorspheres dannet i det 50 um mønstrede gel stadig økt med inkubasjonstid på 14 dager (rosa linje i figur 3N og 3O). CD44 markør ekspresjon av tumorspheres på 150 um mønstrede gel ble endret fra 3,7 ± 0,5 til 21 ± 2, 67 ± 3 og 49 ± 2 etter 2, 6, 9 og 14 dager, henholdsvis, mens CD44 ekspresjon av disse tumorspheres i 50 um mønstret gel ble endret fra 2,1 ± 0,7 til 15 ± 1, 34 ± 2, og 43 ± 2. Basert på micropatterning resultater, uttrykk for CSC markører for MDA231 celler var avhengig av tumorsphere størrelse og 50 mikrometer størrelse kuler hadde høyeste uttrykk for CSC markører. Derfor, i alle etterfølgende eksperimenter kreft celler ble innkapslet i ikke-mønstrede geler men inkubasjonstiden var begrenset til 9 dager for å styre den gjennomsnittlige tumorsphere størrelse.
Strømningscytometri ble anvendt for å kvantifisere CSC fraksjonen (CD44
+ /CD24
-) for MDA231 tumorspheres dyrket i 5 kPa PEGDA gel [35]. Gelen modulus for MDA213 celler er optimalisert med hensyn til tumorsphere formasjonen i neste avsnitt om «Avhengighet av optimal matrise stivhet for cscs på vev opprinnelse.» Så bare MDA231 celler ble brukt, alle PEGDA-innkapslede tumorspheres (un-mønstrede og mønstrede) for flowcytometri eksperimenter ble dyrket i 5 kPa gel. Grupper innbefattet celler dyrket på adherent vevskulturplate (TCP, figur 4A), cellene på ikke-klebende TCP (suspensjonskultur, figur 4B), celler innkapslet i Matrigel med 500 Pa stivhet [36] (figur 4C), celler innkapslet i un-mønstrede 5 kPa PEGDA gel (figur 4D), og i den 50 um mønstrede gel (figur 4E). Alle gruppene ble dyrket i 8 dager. CSC fraksjon av MDA231 celler dyrket på adherente platene var 8,3% i nærheten av den tidligere rapporterte CSC brøkdel [37], som økte svakt til 11% av suspensjonskultur og 9,3% ved innkapsling i Matrigel. Innkapsling av MDA231 celler i 5 kPa un-mønstret og 50 um mønstrede geler markert øket CSC fraksjon til 48% og 70%, respektivt.
MDA231 celler dyrket på adherent vevskulturplate (TCP, A), ikke-klebende vevskulturplate (suspensjon B), ved innkapsling i Matrigel (C), innkapsling i un-mønstrede 5 kPa PEGDA gel (D), og innkapsling i 50 um mønstrede 5 kPa PEGDA gel; (F) CSC brøkdel av de MDA231 celler i (AE) som under populasjon av celler i fjerde kvadrant (CD44
+ /CD24
-)
Avhengighet av optimal. matrise stivhet for cscs på vev opprinnelse
effekten av vev opprinnelse på optimal matrise stivhet for vekst og uttrykk for CSC markører ble undersøkt med MCF7 og MDA231 bryst, HCT116 tykktarms, AGS mage, og U2OS osteosarkom celler innkapslet i PEGDA geler med kompresjonsmodul i området 2-70 kPa. Ikke-tumorigene MCF10A-celler ble ikke dannet tumorsphere (første kolonne på figur 5A), mens alle kreftceller dannet tumorspheres etter 9 dager etter innkapsling i gelen (fig 5A). Økningen i celletall, sfære antall og størrelse sfære med inkubasjonstiden var avhengig av kreftcelletype (figur 5B-5D). 20% av MCF7 tumorspheres hadde 60-80 um størrelsesområde sammenlignet med 75% for MDA231 i 5 kPa gel (figur 5E). 10% av dårlig-invasive AGS tumorspheres hadde 40-60 pm størrelseområde sammenlignet med 70% for den moderat-invasiv HCT116 på 25 kPa gel (figur 5E). 70% av de moderat-invasive U2OS tumorspheres i 50 kPa gel hadde størrelser 40 mikrometer (Fig 5E). Cellen antall trippel-negativ (claudin-lav) MDA231 og luminal-A MCF7- brystkreft celler [38] etter ni dager innkapsling i 5 kPa gel var 1,6 ± 0.1×10
6 og 1,0 ± 0.1×10
6 celler /ml, henholdsvis;
