Abstract
Identifisere enzymer som, en gang introdusert i kreftceller, føre til økt effektivitet i behandling utgjør en viktig målet for biomedisinske applikasjoner. Ved anvendelse av en original fremgangsmåte hvorved mutante genene er generert basert på bruk av betingede lentivector genomet mobilisering, vi nylig beskrevet, for første gang, identifisering av en human deoksycytidin kinase (dCK) mutant (G12) at sensitiviteten et panel av kreftcellelinjer behandling med dCK analoge gemcitabin. Her, fra G12 variant selv, vi generert et nytt bibliotek og identifisert en mutant (M36) som utløser enda større allergi å gemcitabin enn G12. Med hensyn til G12, presenterer M36 en ytterligere mutasjon lokalisert i regionen som utgjør grensesnittet av dCK dimer. Den enkle Tilstedeværelsen av denne mutasjon halvdeler både IC50 og andelen av gjenværende celler som er resistente mot behandling. Videre er bruk av vektorer med selv-inaktiverende LTR fører til en øket følsomhet for behandling, et resultat er kompatibel med en lettelse av den transkripsjonelle forstyrrelser som utøves av U3-promoteren på den indre promoter som driver ekspresjonen av M36. Viktigere er en bemerkelsesverdig effekt også observert ved behandling med anticancerforbindelse cytarabin (AraC), for hvilken en 10 000 gangers reduksjon i IC50 inntraff. Ved å utløse allergi av ulike kreftcelletyper med dårlig prognose til to brukte kreft forbindelser M36 er en lovende kandidat for selvmords genet tilnærminger
Citation. Coulibaly ST, Rossolillo P, Winter F, Kretzschmar FK, Braye M Martin DP, et al. (2015) Potent Sensibilisering av kreftceller til kreft narkotika av en Quadruple Mutant av Human deoksycytidinkinase. PLoS ONE 10 (10): e0140741. doi: 10,1371 /journal.pone.0140741
Redaktør: Jean-Luc EPH Darlix, Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, FRANCE
mottatt: 11 juni 2015; Godkjent: 30 september 2015; Publisert: 20 oktober 2015
Copyright: © 2015 Coulibaly et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Ligue Contre le Cancer (https://www.ligue-cancer.net), Appel d’offre konferanse de samordning InterRégionale du Grand Est 2012 til MN. S. Coulibaly er mottaker av et fellesskap fra den franske «Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche»
Konkurrerende interesser:. Den retrovolution metode og mutantene er beskrevet i dagens papir ble dekket av patenter, for mer informasjon om lisenser kan du kontakte den aktuelle forfatteren.
Innledning
Induksjon død av kreft celler gjennom genterapi er et hovedmål for biomedisinske applikasjoner. Den største hindringen til denne prestasjonen er muligheten for å levere spesifikt til kreftceller transgener som fører til celledød: en prosess oppnås med dårlig effektivitet
in vivo product: [1]. En ytterligere vanskelighet utgjøres av effektiviteten ved hvilken transgenet induserer død av den modifiserte celle. Celledød kan induseres enten konstitutivt eller som respons på eksponering for kjemiske forbindelser, for eksempel som en anticancer medikament [1]. Metoden med å bruke et gen med en induserbar toksisitet har fordelen av å være av interesse også i området sikkerhets gener som tillater negativ seleksjon av transplanterte celler i genterapi-metoder. I disse tilfellene, er tilstedeværelsen av en sikkerhets-genet viktig i tilfelle av en neoplastisk transformasjon etter innpoding av de modifiserte cellene eller, for adoptiv immunterapi, i tilfelle av utviklingen av en graft versus host reaksjon [2]. Den selvmordsgen hyppigst anvendt hittil for disse formål har vært tymidinkinasegenet fra herpes simplex-virus (hsTK) kombinert med behandling gancyclovir [3-5]. Imidlertid, på grunn av sin viral opprinnelse, presenterer den hsTK ulempen med å indusere en immunrespons i TK-avledede epitoper [6], som tyder på at det kan skiftes ut med mindre immunogene proteiner som potensielt vil kunne øke effektiviteten av denne metode. For disse grunner, ville et menneske enzym utgjør en ideell kandidat.
I denne forbindelse har menneskelig deoksycytidinkinase (dCK) tiltrakk seg mye interesse. I tillegg til å være involvert i bergingsveien som konverterer resirkulerte deoksyribonukleosider til dNTP [7], katalyserer dette enzymet den første hastighetsbegrensende, fosforylering trinn for aktivering av forskjellige deoksycytidin analoger (DCA) som brukes i kliniske behandling av forskjellige kreftformer. Gemcitabin er en av disse stoffene. Det er generelt anvendes for behandling av flere cancertyper slik som kreft i bukspyttkjertelen, metastatisk ikke-småcellet lunge- og brystkreft, samt eggstokk-kreft; som alle er assosiert med dårlig prognose [8-13]. Den dCK er også involvert i aktivering av andre forbindelser, som er strukturelt beslektet med deoksycytidin og brukes som anti-kreft eller anti-virale midler. En slike medikamenter er AraC (cytosin-arabinosid), som er mest brukt for behandling av leukemi, så som akutt myelogen leukemi (AML) [14].
I mange tilfeller er det dCK bestemmer graden av følsomhet av celler til behandling med gemcitabin eller AraC. En sammenheng mellom nivået av dCK uttrykk og følsomhet for behandling med DCA har faktisk blitt observert hos pasienter behandlet for hårete celle leukemi og kronisk lymfatisk leukemi [15] og i ulike brystkreft cellelinjer [16]. En kobling mellom uttrykk for dCK, akkumulering og oppbevaring av intracellulære gemcitabin basseng nivåer og gemcitabin inkorporering i DNA har også blitt rapportert [17-19], så vel som en forening mellom nivåene før behandling av intracellulære dCK og følsomhet for gemcitabin [ ,,,0],20]. En lignende korrelasjon er blitt rapportert for AraC [21]. Videre eksogene over uttrykk for dCK i glioma celler ved retrovirale eller adenovirus vektorer fører til økt følsomhet for den cytotoksiske virkningen av cytosinarabinosid
in vitro Hotell og
in vivo product: [22]. Omvendt, mangler i dCK aktivitet fører til motstandsdyktighet overfor behandling enten med gemcitabin [18, 23, 24] eller med AraC [25-27].
Derved tilnærminger muligheten for forutså genterapi basert på innsettingen av ekstra kopier av dCK genet i cancerceller synes lovende, og muligheten for å skape varianter av dCK med forbedret DCA fosforylering aktivitet er et viktig mål på marken. Rational forsøk på å utforme DCK mutanter med slike egenskaper er blitt gjort i det siste, enten basert på strukturell informasjon [28] eller på effekten av post-translasjonelle modifikasjoner av proteinet som er blitt observert å øke dets enzymatiske aktivitet
in vivo product: [29, 30]. Selv om disse studiene lyktes i å oppnå dCK varianter med en forbedret evne til å fosforylere og aktivere gemcitabin, var denne aktiviteten parallelt med en mye mer markert forbedring av fosforylering av det naturlige substratet dC [28, 30]. Siden konkurransen om dCK enzymet mellom naturlige substratet og innkommende legemiddelmolekyler er avgjørende for effektiviteten av celledød induksjon [31, 32], denne funksjonen antydet at slike mutanter gang introdusert i kreftceller ikke ville ha forårsaket en allergi til behandling. For ett av disse (trippel mutant A100V, R104M, D133A) [28], ble det faktisk rapportert at introduksjonen til Messa10K celler, livmor sarkom celler resistente mot gemcitabin [33], medførte ingen allergi til dette stoffet [34].
Vi har nylig utviklet en eksperimentell tilnærming (retrovolution) hvor et gen av interesse blir satt inn i betinget replikasjons-defekt VSV-pseudotyped HIV-1-avledede vektorer som brukes til å etterligne mange infeksjonssykluser, under hvilken sekvensen av interesse akkumulerer mutasjoner på grunn av feilutsatt natur av HIV-1-replikasjon maskineri [34]. Dette genererer et bibliotek av varianter av genet av interesse som allerede er satt inn i en biologisk vektor passende for en effektiv levering av transgenet til humane celler, som deretter kan direkte screenet for ønsket fenotype. Ved å bruke, som en sekvens av interesse, cDNA som koder for det humane dCK, det isolert en mutant, kalt G12, som induserer en 300-gangers sensibilisering til gemcitabin i celler som opprinnelig resistente mot dette stoffet (Messa 10K), en effekt som 60 ganger sterkere enn det som ble observert i kontroller celler hvor en ekstra kopi av den vekt- dCK hadde blitt satt inn [34]. Denne mutant er karakterisert ved tilstedeværelsen av tre mutasjoner, som ligger i posisjoner av proteinet fjernt fra det aktive sete, og som derfor er lite sannsynlig å ha blitt forutsagt på en rasjonell basis. En av disse mutasjonene, E171K, ligger i et område som er involvert i genereringen av grensesnittet av dCK dimer. De to andre mutasjoner (E247K og L249M) i stedet er plassert i «base-sensing loop» som modulerer folding av proteinet ved binding av fosfatdonor (ATP eller UTP), (S1 figur) [28]. Ingen endring av graden av dimerisering ble imidlertid observert
in vitro
for den muterte, noe som tyder på at grunnen til den økte følsomhet gemcitabin at det induserer ikke skyldes en endring i sin ekspresjon ekspresjonsnivået [34], men er muligens på grunn av en modifikasjon av den samlede strukturen av enzymet.
G12 ble isolert etter screening av biblioteket som følge av 17 suksessive sykluser av retrovolution [34]. På denne måten mutasjoner ble innført tilfeldig i genet uten ytre seleksjonstrykk påføres under den prosedyre som ville favorisere isolering av den ønskede fenotype. Spørsmålet om muligheten for å isolere en mutant med en enda større grad av gemcitabin allergi aktivitet enn G12 er utgangspunktet for denne studien.
Materialer og Metoder
Cellelinjer
HEK-293T-celler ble erholdt fra American Type Culture Collection og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (Gibco, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) supplert med 10% FBS og 100U /ml pennecilin-100 mg /ml streptomycin . Messa10K celler ble vennlig levert av LPJordheim (Lyon, Frankrike) og dyrket i RPMI medium supplert med 10% FBS og penicillin-streptomycin.
Retrovolution sykluser av lentivector partikler
For å starte forsøkene fører til generasjon av F27-RL (der RL står for tilfeldig bibliotek), åtte 10-cm plater som inneholder 5×10
6 celler fra befolkningen i HEK 293T celler som ble brukt til å identifisere G12 klone (F16, referanse [34 ]) ble transfektert ved hjelp av kalsiumfosfat-protokoll, med 10 ug av plasmid pCMVΔR8.91 [35] og 5 ug pHCMV-G plasmid [36], for å generere viral-lignende populasjon F17-RL. Den samme prosedyre ble brukt for å starte eksperimentene som fører til genereringen av den F11-DL, men i dette tilfellet den første transfeksjon med pCMVΔR8.91 og pHCMV-G plasmider ble utført på en HEK 293T cellelinje som tidligere er generert til å stabilt uttrykke den lentivector genomisk RNA koding G12 [34]. I dette tilfellet er den viruslignende populasjonen generert het F1-DL (hvor DL står for rettet bibliotek). Disse viruslignende populasjoner (F17-RL og F1-DL) ble deretter brukt til uavhengig å omsette friske HEK 293T-celler til å fortsette med den retrovolution prosedyren i parallell, slik det er beskrevet i referanse [34]. Vi utførte 11 ytterligere retrovolution sykluser, som fører til generering av F27-RL og av F11-DL cellepopulasjoner, henholdsvis. Transfections under sykluser av retrovolution ble oppnådd med 10 mikrogram pCMVΔR8.91 og 5 mikrogram pHCMV-G plasmid på 8 10 cm plater som inneholder 5×10
6 celler fra befolkningen i HEK 293T celler fra forrige retrovolution syklus . For transduksjon prosedyre under sykluser av retrovolution, ble lentivector holdige supernatanten oppsamlet 48 timer etter transfeksjon, ble filtrert gjennom et 0,45 um filter og konsentrert 40 ganger i Vivaspin 20 kolonner (MWCO 50 kDa, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, Frankrike). Overføringsbetingelser skilte seg når den ble utført for å generere genetiske diversitet (retrovolution sykluser), og når den ble utført for å isolere enkelte kloner for screening av biblioteket. For de retrovolution sykluser, 5×10
6 HEK-293T celler ble transduced med 1 ml konsentrert lentiviral vektorer (se ovenfor) og puromycin utvalg ble brukt 24 timer etter transduksjon. Under disse betingelser 90-100% av de transduserte celler som var resistente overfor puromycin, noe som indikerer at i det minste for de fleste av cellene, mangfoldet av transduksjon var høyere enn en. Transductions for isolering av enkelt kloner ble isteden utført ved varierende fortynninger av lentivirale vektorer basert på titrene estimert ved hjelp av ELISA rettet mot HIV-1 p24-kapsidprotein (Innotest HIV-antigen-mAb, Innogenetics, Gent, Belgia). Hundre-celler ble deretter sådd ut per brønn i 96-brønners plater i DMEM. Puromycin utvalg ble brukt 24 timer etter transduksjon ved å legge puromycin i konsentrasjoner på 0,6 mikrogram /ml for HEK-293T celler, 0,6 mikrogram /ml for HEK-293T-CD4
+ celler, 0,5 mikrogram /ml for Messa10K celler. Vi valgte tilstander der i gjennomsnitt 5 brønner per plate resulterte positiv til celle vekst i nærvær av puromycin. Under disse betingelser, det store antall transduksjon var fra 5×10
-4 per celle slik at i hver brønn cellepopulasjonen ble dannet ved transduksjon med en enkelt lentiviral vektor.
Amplifikasjon og sekvensering av dCK-kodende del av den provirale DNA
puromycin-resistente kloner fra den F27-F11 og RL-DL generasjoner ble isolert ved hjelp av begrensende fortynning og ekspandert i 6 brønner plater. Celler fra de enkelte kloner ble deretter gjenvunnet og lysert med 250 mL av Cell direkte PCR (Viagen Biotech, Los Angeles, CA, USA). Den dCK Transgenet ble amplifisert fra 1 pl av lysatet med oligonukleotider på vektoren, EF1 (5′-gatgtcgtgtactggctccg-3 «) og PGK (5-gatgtggaatgtgtgcgagg-3»), flankerende transgenet. Sekvensering av PCR-fragmentet ble utført av GATC sekvense tjeneste (GATC Biotech, Konstanz, Tyskland).
Beregning av hyppigheten av mutasjoner i bibliotekene
For F27-RL og F11- DL biblioteker antall mutasjoner funnet i dCK kodende sekvensen ble beregnet fra dataene gitt i tabell 1 som: (m /(783 xC)) /y, hvor m er antallet av muterte posisjoner, er 783 størrelsen av dCK kodende sekvens i-basepar, c er antallet kloner sekvensert og y er antall perioder av retrovolution utført. For F11-DL bibliotek startsekvensen for beregning av mutasjon priser var sekvensen av G12.
permutasjon tester for forekomsten av synonymt og ikke synonymt mutasjoner langs dCK protein
En permutasjon testen ble utført ved å simulere forekomsten av mutasjoner i de to halvdeler av den proteinkodende sekvens (dvs. på hver side av kodon 130) basert på det observerte frekvensen av forekomsten av tilfeldige mutasjoner og fortrinns mutasjoner i APOBEC3F konsensussekvenser (29,1 og 70,9%, henholdsvis, se tabell 1). Den relative forekomst av synonymt og ikke-synonyme mutasjoner som oppnås eksperimentelt ble sammenlignet med 10.000 simulerte datasett. Andelen simulerte datasett med ikke synonymt /synonyme (DN /DS) mutasjon forholdstall lavere enn eller lik de av den virkelige datasettet ble deretter tatt som sannsynligheten for at det var en signifikant tendens i regionen anses for forekomst av mer synonymt mutasjoner enn det som var forventet på en stokastisk grunnlag. Omvendt, andelen av simulerte datasett med dn /DS-forhold som er høyere enn eller lik de som er av den virkelige datasettet ble deretter tatt som sannsynligheten for at det var en betydelig tendens i regionen anses for forekomsten av flere ikke-synonyme mutasjoner enn det som var forventet på en stokastisk grunnlag.
tester av følsomhet for kreft narkotika
celler som integrerte lentiviral vektorgenomer (G12, M36, enkel eller dobbel mutanter) ble sådd på 5 000 celler per brønn i en 96 -godt plate og dyrket over natten ved 37 ° C. For hver populasjon forsøk ble utført i duplikat. Tolv timer etter såing, økende konsentrasjoner av gemcitabin (0-400 nM), eller AraC (0-10 mM) ble tilsatt til hver brønn og igjen i kulturen i ytterligere 72 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-test (CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Fitchburg, WI, USA) og antall levende celler i hver brønn ble bestemt ved måling av OD ved 570 nm. For hver populasjon, ble den fraksjon av levende celler beregnes som konsentrasjon OD570 X perle /OD570 konsentrasjon 0 perle, å beregne følsomheten av befolkningen til prodrogen.
Tester av følsomhet for antivirale medikamenter
lentivirale vektorer ble samlet ved transfeksjon ved anvendelse av kalsiumfosfat-protokollen, av HEK-293T-celler med 10 ug pCMV plasmidet ΔR8.91 [35], 5 ug pHCMV-G plasmid [36], og 10 pg av genomisk plasmid SDY-dCK (beskrevet i Rossolillo et al. [34]) i sin sIN versjon (se resultater) som koder enten for villtypesekvensen av det humane dCK eller M36 variant. Flere transductions, ved hjelp av forskjellige mengder av lentiviral vektor, ble utført på 1×10
6 HEK-293T-CD4 + celler [37] og transduserte celler ble utvalgt i nærvær av 0,6 ug /ml puromycin, tilsettes 24 timer etter transduksjon. Bare transduksjon betingelser som gir 50 til 200 enkelte puromycin-resistente kloner (hver klon avledet fra en celle transdusert av en enkelt lentiviral vektor) ble beholdt og alle kloner ble slått sammen og ekspanderes for å oppnå et polyklonalt HEK-293T-CD4 + cellepopulasjonen enten uttrykker ett ekstra kopi av vekt dCK enzym eller en kopi av M36 (HEK 293T /CD4
+ – SINvec-wtdCK eller HEK 293T /CD4
+ – SINvec-M36, henholdsvis). Vektorer for å overvåke effektiviteten av transduksjon i nærvær av antivirale medikamenter ble samlet ved transfeksjon av tolv 10 cm plater inneholdende 5×10
6 HEK-293T-celler med 10 ug pTopo plasmid hvori sekvensen som koder for HIV-1 konvolutt ADA [38] det er satt inn [39], og 10 ug pNL4.3-env
-Luc +, som koder ildflueluciferase, som tidligere beskrevet [40]. De resulterende lentivectors ble konsentrert som tidligere beskrevet [34]. Transduksjon av 2.5×10
5 HEK 293T /CD4
+ – SINvec-wtdCK celler og HEK 293T /CD4
+ – SINvec-M36-celler ble utført parallelt ved hjelp av en ml hver av konsentrert lentiviral vektor. Fem timer etter transduksjon celler ble sådd på 5×10
4 celler /brønn i en 6-brønners plate i nærvær av økende konsentrasjoner av den anti-virale forbindelser ddC eller 3TC. Effektiviteten av transduksjon ble deretter overvåket 48 timer etter transduksjon gjennom ekspresjon av luciferasegenet. For dette ble mediet fjernet, cellene ble vasket to ganger i PBS, lysert, sentrifugert og supernatanten ble deretter anvendt for å måle luciferase-aktivitet i henhold til produsentens protokoll (Promega, Fitchburg, WI, USA) med en Glomax luminometer (Promega, Fitchburg, WI, USA) som tidligere beskrevet [40].
Western blot-analyser
Messa10K cellelinjer som uttrykker enten M36, både i sammenheng med en lentiviral vektor-DNA med en funksjonell LTR eller med et inaktivert LTR ble lysert i 1 x RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksycholat, 150 mM NaCl, protease-inhibitor) og 30, 60 og 120 ug totalprotein (bedømt ved Bradford assay) for hver celletype ble applisert på en 12% bis-tricin gel (Invitrogen, Carlsbad, NM, USA). Etter overføring på PVDF membranen, ble DCK proteinene analysert ved hjelp av Western blot med 1: 4000 fortynning av et polyklonalt anti-dCK antistoff (kanin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 1: 3000 fortynning av et anti- kanin HRP-konjugert sekundært antistoff (BioRad, Hercules, CA, USA) med binding å bli oppdaget av chemiluminescence (Pierce ECL Western Blotting substrat, Thermo Scientific).
Produksjon og rensing av rekombinante DCK proteiner
WT-DCK og M36 sekvenser ble klonet i pET14b plasmid og uttrykkes i
E
.
coli
celler BL21 DE3 pLysE. Protein-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av 0,1 mM IPTG, og cellene ble samlet opp etter 4 timer med vekst ved 37 ° C. Hans-merkede proteiner ble eluert med 250 mM imidazol fra Hans-Trap TM FF Columns (GE Health Life Science, Little Chalfont, UK), den Histidine koden ble fjernet ved hjelp av S-Tag trombinrensing Kit (Novagen, Madison, WI, USA ), og dCK og M36 ble ytterligere renset ved gelfiltrering på S-200 Sephacryl kolonner (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, UK).
fosforylering tester
in vitro
effektiviteten av fosforylering av det naturlige substrat deoksycytidin og av prodroger gemcitabin og AraC ble målt for renset wt-dCK og M36 i en NADH-basert assay som tidligere beskrevet [41]. Alle reagenser ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) med unntak gemcitabin (Lilly, Indianapolis, IN, USA). Enzymer ble undersøkt ved romtemperatur ved en konsentrasjon på 0,9 uM for dC, og 0,3 uM for både gemcitabin og AraC. dC ble anvendt i konsentrasjoner mellom 5 og 50 uM, gemcitabin ved konsentrasjoner mellom 20 uM og 1 mM og AraC ved konsentrasjoner mellom 10 mM og 0,5 mM. ATP ble brukt i en konsentrasjon på 4 mm.
Statistiske analyser
For å vurdere om den gjennomsnittlige mengder celledød oppstår i Messa10K populasjoner som inneholder forskjellige DCK varianter var signifikant forskjellig fra verdien vist av Messa10K wt-dCK, en to utvalgs t-test ble benyttet for de ulike konsentrasjoner av gemcitabin.
Resultater
Bidrag av de enkelte mutasjoner av G12 til overfølsomhet til gemcitabin
ved hjelp av en ny fremgangsmåte for å rettet humant gen utviklingen som vi har utviklet i vårt laboratorium, som tidligere er beskrevet vi isolering og karakterisering av en dCK mutant, kalt G12, som induserer sensitivisering av kreftceller til behandling med anticancerforbindelse gemcitabin [34]. G12 er karakterisert ved tre mutasjoner i forhold til villtype dCK enzym. Imidlertid har det vært fastslått hvorvidt den sensibilisering aktivitet observert i G12 avhenger av tilstedeværelsen av alle tre mutasjoner og, hvis så, hva det relative bidraget av hver av disse mutasjonene til G12 fenotype er. For å løse disse problemene, bygget vi seks mutanter, tre som inneholder enten E171K, den E247K, eller L249M mutasjon alene, og tre inneholder to mutasjoner hver, som dekker alle mulige kombinasjoner av doble mutanter (E171K /E247K, E171K /L249M, og E247K /L249M). Mutantene ble innført i den tidligere beskrevne pSDY plasmidet [34], og benyttet for transfeksjon med transcomplementation plasmider som er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder, for å generere lentivirale vektorer. Med hensyn til pSDY plasmidene vi som tidligere er beskrevet [34], plasmidene vi brukte (pSDY-SIN) inneholdt et delvis slettet og derfor ikke-funksjonell versjon av 3′-U3-sekvensen (figur 1A). De resulterende lentivirale vektorer vil generere, etter revers transkripsjon, ikke-funksjonelle LTR-sekvenser og er derfor kalt selv-inaktiverende (SIN) vektorer (SDY-SIN i vårt tilfelle). Disse lentivectors ble valgt for denne test for deres relevans for biomedisinske anvendelser. Som kontroller ble det G12 og wt DCK sekvenser også satt inn i pSDY-SIN plasmid. For hver variant av dCK ble lentivectors brukt til å etablere en polyklonal populasjon av Messa 10K celler. Disse polyklonale populasjoner (SINvec-G12 befolkningen for G12, SINvec-vekt dCK for vekt dCK, SINvec-E171K for E171K mutanter, og så videre) ble generert ved transducing 10
6 HEK 293T celler med ulike mengder lentiviral vektor i for å kunne oppnå, etter valg puromycin, 50 til 200 individuelle kloner. På denne måten, hver klon ble nesten helt sikkert stammer fra en celle som inneholder en enkelt integrert kopi av proviralt DNA. Klonene ble deretter slått sammen slik at den resulterende populasjonen ble utgjøres av celler som bærer den samme transgenet, men med genet integrert på forskjellige steder i genomet, for derved å gjennomsnitt over mulige effekter som kan være knyttet til den integreringssete. Det faktum at cellene inneholdt en enkelt kopi av transgenet tillates utelukkelse, når man sammenligner populasjoner ene med den andre, mulige doseeffekter på grunn av antallet av transgenet integrert. Sensibilisering til gemcitabin behandling ble deretter evaluert ved MTT forsøk. For dette formål ble de forskjellige Messa 10K polyklonale populasjoner μded i 96-brønners plater, utsettes for varierende konsentrasjoner av gemcitabin, og celleoverlevelse ble målt for hver tilstand som tidligere beskrevet [34].
apparat A. Struktur av det genomiske RNA dannet ved transkripsjon etter transfeksjon av celler med pSDY-SIN plasmider. R, gjentatt sekvens fra HIV-1 genomet; U5, 5 «unik sekvens av HIV-1 LTR; Cis-virkende, sekvenser som er nødvendige for pakking og revers transkripsjon av det genomiske RNA; EF1-alfa, human forlengelse faktor 1-alfa arrangøren; hPGK, human fosfoglyceratkinase arrangøren; Puro, puromycin N-acetyl-transferase-genet; ΔU3, delvis slettet versjon av 3»-unik sekvens av HIV-1 LTR. Paneler B og C. Andelen av levende celler i løpet av det totale antall celler som funksjon av konsentrasjonen i gemcitabin er gitt som et forhold i forhold til de levende celler observert i fravær av medikament. Hvite symboler representerer referansepopulasjoner i begge paneler og. grå symboler representerer enkle og doble mutanter (som beskrevet i hovedteksten). Siden enkle og doble mutanter ble testet i parallell i det samme eksperiment. Dataene er gjennomsnittet av 3 uavhengige eksperimenter. Feilfelt blir ikke vist for oversiktens skyld.
tre enkelts mutanter (grå symboler figur 1B) ga responskurver i samme område som referanse vekt dCK befolknings (hvite firkanter). De samme resultatene ble oppnådd for de doble mutanter E171K /E247K, og E247K /L249M (grå trekanter og sirkler i figur 1C, henholdsvis). Alle tre av de enkle mutanter og to av de tre doble mutanter som ble testet ikke var i stand til å indusere gemcitabin sensibilisering mer effektivt enn det som var mulig med en ekstra kopi av den vekt- dCK genet. Den tredje doble mutant, E171K /L249M (grå firkanter i figur 1C), ga et resultat som ligner den som ble observert for wt Messa 10K celler (hvite trekanter i figur), noe som tyder på at en inaktivering av dCK aktivitet inntraff for denne mutant, forlater cellene fratatt dCK aktivitet (som er tilfellet med den opprinnelige Messa 10K linje). Som konklusjon, siden ingen av de enkle og doble mutanter viste en responskurve lik den til G12 (hvite sirkler i figur), den samtidige tilstedeværelse av de tre mutasjonene er tilsynelatende nødvendig for å oppnå sensibilisering fenotypen observert med G12.
Generering av biblioteker med «tilfeldig» versus «rettet» evolusjon
G12 mutant hadde blitt isolert, fra wt dCK sekvens, fra et bibliotek med dCK varianter oppnådd etter 17 generasjoner av retrovolution (kalt F16 , den første generasjonen som utgjøres av foreldre vektorer P [34]). Her undersøkte vi hvorvidt utfører retrovolution starte fra forbindelsen G12 sekvens i stedet for den vekt- dCK sekvens, vil gi mutanter med en ytterligere forbedret fenotype. For dette formål er det HEK 293T cellelinje som stabilt uttrykker G12 som vi tidligere genererte [34], ble brukt til å starte 11 sykluser av retrovolution, ved transfeksjon med de transcomplementation plasmidene pCMVΔR 8,91 og pHCMV-G [35, 36] som beskrevet i materialer og metoder og skissert i figur 2. Dette førte til generasjon av befolkningen i HEK 293T celle bibliotek vi kaller F11-DL (for F11 rettet bibliotek). I parallell, for å vurdere muligheten for å isolere mutanter med en forbedret fenotype med hensyn til G12 simpelthen ved å fortsette den retrovolution prosedyre som førte til isolering av G12, har vi også gjort ytterligere 11 sykluser av retrovolution på hele F16 populasjonen fra hvilken G12 ble isolert [34], for derved å komme til F27 generasjon (vi kaller F27-RL, for F27 tilfeldig bibliotek).
den generelle struktur for de genomiske RNA anvendt for retrovolution er gitt på toppen, videre venstre for F16 befolkningen og til høyre for befolkningen som bare inneholder G12 varianten. Fremgangsmåten er tidligere beskrevet [34], og består i den gjentatte transduksjon av HEK 293T-celler med lentivirale vektorer etterfulgt av seleksjon, med puromycin, en cellepopulasjon som har stabilt integrert det provirale DNA som har blitt produsert ved revers transkripsjon. Transfeksjon av denne populasjonen med transcomplementation plasmidene pHCMV-G og pCMVΔ8.91 (se hovedtekst) tillater fremstilling av de neste generasjon vektor som deretter anvendes for å transdusere friske HEK 293T-celler i løpet av gjentatte sykluser av seleksjon, transfeksjon og transduksjon. For screening-formål, er målet celler transdusert med mindre enn en lentivector partikkel pr celle, og individuelle kloner ble isolert i nærvær av puromycin. Screening for allergi til ulike forbindelser utføres som beskrevet i hovedteksten.
For å isolere individuelle kloner fra hvert bibliotek, for den siste syklus av retrovolution F10-DL og F26-RL viruslignende populasjoner ble brukt til uavhengig å omsette friske HEK 293T-celler ved et flertall av vektorpartikler per celle som var vesentlig lavere enn 1. transduserte celler ble sådd på 96-brønners plater, og seleksjon med puromycin ble påført som beskrevet i materialer og metoder, i slike en slik måte at hver klon inneholdt en enkelt kopi av transgenet. Individuelle kloner ble ekspandert og anvendt for sekvensanalyse. For den funksjonelle screening av bibliotekene ble HEK 293T klonene isolert ved denne metoden transfektert med transcomplementation plasmider, og de resulterende virus-lignende populasjoner ble anvendt til å transdusere Messa 10K-celler for å generere polyklonale populasjoner som beskrevet ovenfor. De resulterende populasjoner ble anvendt for testing av følsomheten overfor anticancer og antivirale forbindelser.
Sekvensering av bibliotekene
å evaluere kompleksiteten til biblioteket og karakterisere naturen av de mutasjoner som genereres under 11 sykluser av retrovolution som ble gjennomført i DL og i de RL biblioteker, 41 HEK 293T kloner fra den F27-RL og 43 fra F11-DL ble sekvensert i dCK-kodende region, etter PCR-amplifikasjon fra proviralt DNA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
