Abstract
I løpet av progresjon av ondartet peritoneal mesothelioma (MPeM), tumornoduler forplante diffust i magen og svulster er preget av distinkte fenotypiske sub-typer. Nyere studier i organ kreft har vist at kreftstamceller (cscs) spiller en sentral rolle i initiering og progresjon av svulster. Det er imidlertid ikke kjent hvorvidt tumorigene stamceller eksisterer, og om de fremmer tumorvekst i MPeM. I denne studien har vi utviklet og preget en CSC modell for MPeM hjelp stabilt utvid tumorigene stamceller hentet fra pasient svulster. Vi fant morfologisk distinkte populasjoner av cscs som deler asymmetrisk eller symmetrisk i MPeM
in vitro
cellekultur. De MPeM stamceller (MPeMSCs) uttrykte stamcellemarkører c-MYC, NES og VEGFR2 og i nærvær av matrisekomponenter cellene danner kolonier kuler. MPeMSCs er multipotent, differensiere i neuronal, vaskulær og adipose avkom på definerte induksjon og differensierende celler uttrykker avstamning-spesifikke markører som TUBB3, en tidlig neuronal markør; vWF, VEGFA, VEGFC og IL-8, endoteliale markører; og PPARy og FABP4, adipose markører. Xenotransplantasjon eksperimenter med MPeMSCs viste tidlig tumorvekst sammenlignet med foreldre celler. Begrensende fortynning eksperimenter ved hjelp av MPeMSCs og endotelceller avstamning-induserte celler avledet fra en enkelt MPeMSC resulterte i tidlig tumorvekst i den sistnevnte gruppen som indikerer at endotelial differensiering av MPeMSCs er viktig for MPeM startfasen. Vår observasjon at MPeM svulster inneholder stamceller med karsinogent potensial har viktige implikasjoner for forståelsen av cellene sted tumorprogresjon hos MPeM og dermed rettet mot cscs kan være en nyttig strategi for å hemme ondartet progresjon
Citation. Varghese S , Whipple R, Martin SS, Alexander HR (2012) multipotente kreftstamceller avledet fra humant Ondartet Peritoneal Mesothelioma fremme tumorigenesis. PLoS ONE 7 (12): e52825. doi: 10,1371 /journal.pone.0052825
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 13 august 2012; Godkjent: 23 november 2012; Publisert: 28.12.2012
Copyright: © 2012 Varghese et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft stem- (som)-cellene med selv -renewal og svulst initiere potensialet er blitt identifisert i forskjellige krefttyper [1] – [3] og nyere bevis tyder på at disse cellene spiller en sentral rolle i utviklingen av ondartede svulster. CSC Modellen beskriver at det foreligger en liten subpopulasjon av plastlegemer med transdifferensiering potensial i tumorer. Men nyere studier tyder på at en hovedandel av celler i tumorer opprettholde stamcelle egenskaper, og enda mer differensierte celler kan transformeres til stilk-lignende celler [4], [5]. Hvis dette er tilfelle, kan eliminering av cscs ikke være en nyttig strategi for reduksjon av tumorvekst. Derfor er det viktig å utvikle modeller for å forstå CSC biologi og identifisere nye strategier for å forhindre ondartet tumorprogresjon. Mekanismene som regulerer selvfornyelse av både cscs og normale stamceller er antatt å være lik [6]. For tiden, identifisering og isolering av cscs har i stor grad vært avhengig av spesifikke celleoverflatemarkører [7], [8], selv om ekspresjon av slike markører er avhengig av forskjellige faktorer slik som differensieringstilstanden til cellene og nisje faktorer. CD133 har vært brukt som en antatt stamcelle markør i glioblastom [9] og tykktarmskreft [10], CD34 uttrykkende tumor epitelceller som cscs i kutan kreft [11], CD44 uttrykkende celler i brystcancer [12], CD26-positive celler er som er involvert i prosessen med metastaser, invasivitet og chemoresistance i tykktarmskreft [13], CD271-positive celler initiere melanomutvikling og metastasering [14] og egenskapene til cscs ble identifisert i CD24 positive pleural mesothelioma celler [15]. Imidlertid har det ikke vært noe bevis for eksistensen av stilk-lignende celler som initierer tumorvekst i MPeM. Derfor har vi undersøkt tilstedeværelse av tumorigene mesothelioma celler med egenskaper cscs i stabile cellelinjer avledet fra MPeM pasientsvulster
Ondartet peritoneal mesothelioma stammer diffust i serøse foring av bukhule.; det er en aggressiv kreft med en markert tendens til regionale metastaser. Ved diagnose, er dette kreft generelt funnet på et stadium av diffus ondartet progresjon med et stort antall variabelt størrelse tumorknuter. Vanligvis svulster har en dårlig vaskularisert tykk indre kjerne omgitt av et ytre neovaskulær område. Behandlingstilbud som kirurgisk cytoreduksjon og systemisk kjemoterapi kan kontrollere tumorprogresjon hos noen pasienter, men pasienten døde er hovedsakelig på grunn av progressiv svulst tilbakefall. Vi har nylig rapportert at aktivering av phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og mammalian target of rapamycin signalisering i MPeM er forbundet med kortere pasientoverlevelse [16]; disse banene er involvert i stilk celleaktivering og proliferasjon [17], [18]. PI3K signalering er også viktig for opprettholdelse av celle polaritet i kreftceller [19].
Selv om de utledede MPeM cellelinjene overleve på ubestemt tid under aging, i denne studien, vi brukte tidlig passasje celler avledet fra pasientens tumor til unngå valg av en spesiell undergruppe av aggressive kreftceller initiere bevart under forlenget aging. Her identifiserte vi at en stor andel av prospektivt generert stabile MPeM celler i kultur generere flytende celler med egenskapene til embryonale stamceller som asymmetrisk celledeling, selvfornyelse og multipotency. De tilfeldig utvalgte enkelt MPeMSCs viste klonal progresjon, fenotypiske mangfoldet under definerte forhold og transdifferensiering potensialer. Derfor kan den betydelige plastisitet MPeMSCs bidra til dannelsen av den utviklings diverse cellepopulasjon som finnes i svulster og aggressivitet av tumorer i løpet av patologisk progresjon. Samlet vår studie viser at MPeM havn cscs og tumorprogresjon er grunn til selvfornyelse og differensiering av cscs.
Resultater
morfologisk forskjellige Bestander av MPeMSCs som deler asymmetrisk eller Symmetrisk og Express Stem Cell Markers
Blant de stabile MPeM cellelinjer generert, Meso-CL1 var PTEN negativ
(neg), mens Meso-CL2 og Meso-CL3 var PTEN uttrykker cellelinjer (fig. S1). Selv om alle tre MPeM cellelinjer ble generert stamceller med selvfornyelse som løsner og flyter i kulturen før vedheftende vekst, har Meso-CL1 tilbøyelighet til å generere tumorxenografter ved subkutan eller intraperitoneal implantering hos immunkompromitterte mus, og ble brukt til å generere et MPeM CSC modell . Vanligvis pattedyr cscs danne flere aggregater av sfæroide kolonier i kultur [20]; kolonidannelse ble begrenset når MPeMSCs ble dyrket under standard tilhenger celledyrkningsforhold. Imidlertid klonal sfære dannelse ble aktivert når cellene ble dyrket i et Matrigel plate. Lysmikroskopi studier har identifisert to morfologisk distinkte populasjoner av cscs i MPeM kultur; celler med eller uten et ytre innkapslende dekker, som begge viste asymmetrisk eller symmetrisk divisjon. For å demonstrere at de isolerte cellene opprettholde stamceller egenskaper, må vi først utført time-lapse studier på levende celler i kultur og immunfluorescens studier i formaldehyd-fikserte celler og funnet ut at cellene deles både asymmetrisk og symmetrisk (Fig. 1A, B). I en asymmetrisk divisjon, celler fordelt ulikt generere et stort stamcelle og en liten celle generelt betegnes som stamcelle. Puls-chase eksperimenter ved bruk av tymidinanalog BrdU har vist at i løpet av asymmetrisk celledeling templat-DNA merket med BrdU, etter en lang puls, utelukkende adskilt innenfor den nye stamcelle, mens den nylig syntetiserte DNA kondensert i differensierings cellen. I tillegg fant vi også at i løpet symmetrisk celledeling begge dattercellene delte malen DNA (Fig. 1C). En annen morfologisk distinkt populasjon av cscs ble identifisert i MPeM kultur med en innkapsle ytre dekker som dannes fra foreldrecellene som mørke boble-lignende fremspring. De nydannede celler løsrevet fra foreldrenes cellen og fløt i kultur og celler «hatched» ut fra ytre dekker å initiere vekst. På grunn av den flytende karakter av disse cellene, time-lapse studiene var mislykket; imidlertid, lys og fluorescerende mikroskopi bevis tyder på at cellene også delt asymmetrisk eller symmetrisk (fig. 2A). Som finnes i andre kreftcellelinjer, har vi også identifisert store multikjerneholdige heftende celler i cellekultur som genererer en eller flere stamceller vanligvis stammer fra kjernen uten fullstendig cytokinese av foreldrecellen (Fig. 2B).
(A) Time-lapse bilder av asymmetrisk og symmetrisk celledeling i MPeMSCs. Asymmetrisk celledeling (piler) genererer to ulike celler (øvre panel); symmetrisk celledeling (piler) genererer to identiske celler (nedre panel). Cellestørrelse vist i mikrometer. Tid (Time: minutt) notert på nedre venstre hjørne. Skala barer: 20 pm. (B) Fluorescent bilder av asymmetrisk (øvre panel) og symmetrisk (nedre panel) celledeling i MPeMSCs. Hoechst nukleær farging viser asymmetrisk og symmetrisk fordeling av celler. (C) DNA er segregert asymmetrisk under celledeling (øvre panel). Celler blir dyrket i BrdU i flere passasjer (pulsperiode), og etter en lang puls BrdU fjernes fra cellekultur (chase); BrdU oppbevaring i dele celler ble undersøkt ved hjelp av anti-BrdU antistoff. I en asymmetrisk celledeling, templat-DNA merket med BrdU segregert i den nye datter stamcelle mens den nylig syntetiserte DNA uten BrdU etikett kondenseres i differensierings cellen. Under symmetrisk celledeling BrdU merket DNA segregert tilfeldig innenfor dattercellene (nedre panel).
(A) Dannelse av MPeMSCs med kapsel dekker og mulig asymmetrisk og symmetrisk stamcelle divisjon. a, b, cscs stammer fra foreldrecellene som mørke boble-lignende fremspring (piler). Celler løsne og flyte i kulturen og MPeMSCs «luke ut» av kapselen (piler). c, Asymmetrisk celledeling i kapsel stamceller. Asymmetrisk delende celler som stammer fra kapselen (øvre panel, piler) eller celler deler seg ujevnt sammen med kapselen generering av to ikke-identiske celler (lavere panel). d, Symmetric celledeling av en kapsel-stamcelle. Skala barer: 100 px. e, f, Fluorescerende bilder av asymmetrisk (e) og symmetriske (f) celledeling av innkapslede celler. Piler indikerer den ytre kapselbelegget av cellen (B) en, MPeMSCs stammer fra kjernen av en flerkjernede celle; den nydannede cellen beveger seg gjennom cytoplasma og frigjøres fra foreldrecellen. b, Origin av flere cscs fra en multinucleated celle. c, Fluorescent bilder av en multinucleated celle.
Neste vi fastslått om de isolerte MPeMSCs ble virkelig stammer fra foreldre ondartede mesothelial celler. Vi vurderte ekspresjon av et kjent mesothelioma markør, MSLN, og fant en sterk ekspresjon av genet i både MPeMSCs og paren MPeM-celler (fig. 3A). Stamcelleegenskaper av de isolerte MPeMSCs ble ytterligere bestemt ved ekspresjon av kjente stamcelle markører inkludert Nanog, SOX2, OCT4, c-MYC og KLF4 (Fig. 3B). Interessant, mønsteret av ekspresjon av tidlige stamcellemarkører var lik i begge parentale celler og MPeMSCs, mens c-myc ekspresjonen var signifikant høyere i MPeMSCs sammenlignet med foreldreceller. Derimot er pluripotent stamcelle markør, CD133 og endotel-stamcellemarkører, CD31 og CD144, ble ikke påvises i MPeMSCs (Fig. 3C).
(A) Relative mRNA-ekspresjon av mesothelin (MSLN) og (B) stamcellemarkørgener i foreldre MPeM celler og i MPeMSCs. c-MYC uttrykk var betydelig høyere (*
p
0,05) i MPeMSCs mens andre stamcellemarkører viste relativt lignende mønster av uttrykk i begge gruppene. (C) Strømningscytometri evaluering av human CD133, CD31 og CD144 viste at proteinene ikke blir uttrykt i MPeMSCs. Bar diagrammer er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Multiple Lineage Induksjon i MPeMSCs
multipotency er kjennemerket på stamceller. Men det har ikke vært entydig vist at cscs kan oppnå flere skjebner ved avstamning induksjon. For å demonstrere evne MPeMSCs å oppnå flere skjebner, cscs ble dyrket i de nevrale, vaskulære og adipose differensiering forhold. Når sub-konfluente adherente MPeMSCs ble behandlet med trans-retinsyre, etterfulgt av tilsetning av nevrale differensieringsmedium, cellene differensiert til neuron-liknende celler med typisk neuronal morfologi. Fluorescent bildebehandling og qPCR studier av mRNA uttrykk viste at de nevrale avstamning-indusert cellene uttrykte nevrale stamcelle markør NES og en tidlig neuronal markør TUBB3; imidlertid, BEX1 viste ingen signifikant forskjell mellom MPeMSCs og nevrale differensierte celler (fig. 4A). De flytende neurale stamceller avledet fra neuronale differensierte cellene ble oppsamlet og dyrket i flere generasjoner for å demonstrere selvfornyelse, og mange av disse cellene viste typiske neuronal morfologi.
(A) Differensiering av MPeMSCs inn i neuron-lignende celler i det neurale differensieringsmedium (pil). Immunfluorescens og relative mRNA uttrykk studier viser at differensierte nerveceller uttrykker nevrale stamcelle markør nestin og en tidlig nevronale markør SIII-tubulin (*
p
0,01). (B) endotel differensiering av MPeMSCs på en Matrigel overflaten danner rørformede nettverk (piler). Fluorescerende avbildning viser at celler uttrykker endothelial stamcellemarkør, VEGFR2, og opptak av Dil-AcLDL av differensierte endotelceller. Relative mRNA uttrykk studier viser at i løpet av endothelial differensiering redusert VEGFR2 og VEGFR3 uttrykk signifikant (*
p
0,05), mens de uttrykk for endotelcelle markører, vWF, VEGFA, VEGFC og IL-8 betydelig økt (*
p
0,001). (C) En enkelt MPeMSC danne en koloni sfære på en Matrigel overflate, etterfulgt av omfattende proliferasjon av MPeMSCs. Scale barer 100 px. (D) MPeMSCs differensiert i adipocytter (Oil rød) og (F) uttrykker adipocyte markører PPARy og FABP4 (*
p
0,01) i adipose differensierte celler sammenlignet med kontroller. Søylediagrammene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; ND, ikke oppdages.
Vi neste vurdert muligheten for MPeMSCs å danne endotelceller. MPeMSCs uttrykke VEGFR2, en endothelial stamcelle markør. Embryonale stamceller positive for VEGFR2 danne vaskulære stamfedre og forvandle seg til modne blodårene [21]. For å studere differensiering av MPeMSCs til endotelial avstamning, ble celler dyrket i kulturskåler belagt med kjeller-membran matrikskomponenter (Matrigel). På Matrigel, celler indusert endotelial celledifferensiering og dannet rørformede nettverk. Genuttrykkstudier i endotelceller avstamning-indusert celler sammenlignet med MPeMSCs avslørt at VEGFR2 og VEGFR3 uttrykk ble betydelig redusert i celler under endothelial differensiering mens uttrykk for vWF, VEGFA og VEGFC ble oppregulert i differensierende celler. Tilsvarende er det pro-angiogene faktor, IL-8 viste en ti gangers økning i løpet av endotel-celle-differensiering sammenlignet med MPeMSCs. For ytterligere å validere endotel-differensiering, ble celler inkubert med low-density lipoprotein, Dil-AcLDL, og fant opptak av lipoproteiner ved endoteliale differensierte celler (Fig. 4B). I Matrigel MPeMSCs danner også koloni kuler, etterfulgt av omfattende proliferasjon av celler (Fig. 4C). De prolifererende celler generere flere klonale kuler i
in vitro
cellekultur rette for rask spredning av endoteliale progenitorceller.
For å avgjøre om de MPeMSCs differensiere i adipocytter, ble cellene eksponert for trans-retinsyre etterfulgt av adipose differensieringsmedium og testet for intracellulær akkumulering nøytralt lipid. Lipidavleiringer ble identifisert i adipose differensierte celler. Kontroll og differensierte celler ble videre analysert for kjente adipocyte markører ved hjelp av qPCR og fant en signifikant oppregulering av PPARy og FABP4 (fig. 4D, F).
svulstdannelse fra én celle MPeMSCs
Vår første studier med MPeM foreldre celler har vist at injeksjoner av 3 × 10
6 Meso-CL1 cellene var i stand til å generere både subkutan og intraperitoneal svulster i immunsupprimerte mus mens Meso-CL2 og Meso-CL3 var ikke-tumorigen. I de subkutant injisert mus, Meso-CL1 celler konsekvent generert første håndgripelig svulst på dag 30 etter tumorcelletransplantasjon mens tilsvarende injeksjoner av MPeMSCs tok bare 15 dager til å utvikle den første håndgripelig svulst. Motsatt, transplantasjon av nevrale avstamning-indusert celler viste svulst palpasjon på dag 35 viser at både foreldreceller og nerve differensierte celler hadde lignende karsinogent potensial. Studier har vist at injeksjon av tumorceller suspendert i Matrigel ha høyere hyppighet av tumordannelse [22]. Vår
in vitro
studier viste at Matrigel fremmet endothelial differensiering og aktivering av angiogene faktorer i endotelceller differensierte celler. Derfor er det mulig at et lite antall MPeMSCs kan generere tumorer i løpet av en endothelial nisje. For å teste betydningen av endotelceller differensiering av MPeMSCs på tumorvekst, utførte vi begrensende fortynning eksperimenter. Fem hundre celler avledet fra en enkelt uselektert MPeMSC injisert med Matrigel genererte palpable tumorer i mus på dag 59 etter tumorcelletransplantasjon, mens mus mottok et likt antall celler suspendert i PBS vokste ikke tumorer i løpet av en to måneders periode (fig. 5A) indikerer at endothelial differensiering av cscs er sentralt for tumorvekst. For å teste
in vivo
transdifferensiering av endoteliale celler avledet fra MPeMSCs, ble tidlige tumorer avledet fra endotelceller avstamning styrt celler ko-injisert med Matrigel analysert for ekspresjon av NES og TUBB3 og fant at celler som uttrykker både nerveproteiner ( fig. 5B).
(A) parentale celler som MPeMSCs stammer ble injisert subkutant (n = 8) inn i den høyre flanken til atymiske nakne mus (nu /nu). Først håndgripelig svulst dukket opp på dag 30 etter tumorcelle injeksjon. Lignende injeksjoner av MPeMSCs (n = 8) generert håndgripelig svulster på dag 15 (end-stage svulster blir vist). I begrensende fortynning eksperimenter ble celler avledet fra en enkelt MPeMSC oppdelt og dyrkes enten i en Matrigel plate for å indusere endotelisk differensiering eller i en vanlig cellekulturplate med LIF inneholdende medium. Fem hundre celler dissosiert fra den første gruppen ble resuspendert i Matrigel og injisert subkutant (n = 8). Svulster ble først funnet ved palpasjon på dag 59 (mus med 60 dager tumorvekst etter svulst palpasjon vises), mens tilsvarende injeksjoner av MPeMSCs (n = 10) resuspendert i PBS genererte ikke svulster. (B) Hematoxylin og eosin (H E) flekker og immunfluorescens av tumorvev. Tidlig svulster generert fra endotelceller avstamning-indusert celler uttrykker nevrale markører; NES og TUBB3.
Diskusjoner
Det viktige funn fra denne studien er identifisering av cscs med karakteristisk asymmetrisk stamcelle divisjon og tumorigenicity i menneskelige MPeM svulster. Hittil CSC markører har vært mye brukt til å identifisere og isolere stamceller fra svulster. Imidlertid har ingen stamcelle markør vist seg å være en universell markør for cscs. Definert kultur MPeMSCs avledet fra pasient svulster fremmet selvfornyelse, kolonidannelse og multilineage differensiering bekrefter en stamcelle fenotype. Den karakteristiske trekk ved MPeMSCs enn andre cscs er at celler sjelden danne klonale kuler i vanlig tilhenger cellekultur og derfor den enkelte celledelingen mønsteret kan visualiseres ved hjelp av mikroskopi, som bidrar til å identifisere og isolere cscs. Asymmetrisk celledeling er karakteristisk for embryonale stamceller og våre time-lapse studier viste at MPeMSCs dele asymmetrisk og dattercellene arver ulike cytoplasmatiske komponenter [23] for å danne stamceller og differensierende celler. Denne observasjonen ble også støttet ved puls-chase BrdU merkningsmetode, og fant at templat-DNA beholder inne i datter stamcelle. Videre fant vi symmetrisk celledeling i MPeMSCs generere celler med omtrent samme størrelse. Bortsett fra disse karakteristiske stamcelle divisjoner, MPeMSCs viser en annen mekanisme for stamcelle spredning ved å generere celler innkapslet i en membran ytre dekker. Disse cellene vanligvis flyte i kultur, og vise både asymmetrisk og symmetrisk divisjon. Betydningen av kapselstamcelledannelse må undersøkes nærmere. Det er mulig at dannelsen av slike innkapslede celler er nisje homeostase avhengig, og som gjør det mulig cscs til å spre seg raskt og overleve i ugunstige nisje forhold. De unike morfologiske egenskapene til disse celler kan også benyttes til å identifisere cscs
in vitro
. De avledede MPeMSCs vise betydelig uttrykk for MSLN, en fremtredende markør for mesothelioma [24] indikerer at cscs stammer fra foreldre mesothelioma celler. De stilk cellemarkører som ble testet i både parentale celler og MPeMSCs viser likhetene i deres ekspresjon, bortsett fra MYC onkogen, og denne konsistens i gen-ekspresjon tyder på at parentale celler har også potensiale for dedifferentiation [5]. Den MYC oncoprotein som er aktivert i flere tumortyper [25] er signifikant oppregulert i MPeMSCs; MYC-genet er viktig for stamcelleproliferasjon og for opprettholdelse av pluripotent egenskaper av stamceller [26], [27].
Tidligere rapporter om stilk-liknende celler avledet fra glioblastom tyder på at cscs differensiere til endotelceller i løpet tumorvekst [28], [29]. For ytterligere å bekrefte tilstedeværelse av stamcelle fenotype i MPeM, testet vi multipotency av MPeMSCs ved å dyrke dem i flere differensierings forhold. Celler ble først dyrket i serum-minimert neuronal differensiering betingelser og funnet at MPeMSCs differensiert i celler med typiske neural morfologi og uttrykt neuronal markører. Vi identifiserte NES som en viktig neuronal stamcelle-markør i MPeMSCs og dens ekspresjon ble også funnet i xenograft tumorer indikerer at neuronal differensiering av endoteliale celler er mulig i løpet av tumorvekst. Tilsvarende endothelial stamcelle markør VEGFR2 uttrykk var også markert høy i MPeMSCs; i en matrise nisje celler differensiert i endotelceller [9] med typiske rørformede nettverk tyder MPeMSCs er egentlig programmert for endothelial differensiering. Denne direkte bidrag MPeMSCs til tumorvaskulatur kan være viktig for den hurtige og diffuse tumorvekst funnet i MPeM pasienter. Neuralstamceller er ectodermal opprinnelse, mens endotelceller stammer fra mesoderm. Imidlertid kan endotel-lignende celler være avledet fra neuralstamceller [30]. I våre studier (upubliserte data) når neurale differensierte celler ble sådd i en Matrigel plate, celler differensiert i endotelceller med typiske rørformede nett som viser transdifferensiering av avstamning-engasjerte celler. Det har blitt rapportert at endotelcellene transdifferentiate inn i mesenchymale celler for å indusere stamceller-lignende egenskaper [31]. Kliniske studier har vist at fordelene fra antiangiogene terapi mot kreft er begrenset, og i mange tilfeller anti-angiogene terapier resultere i en første reaksjon, etterfulgt av tumor tilbakefall [32]. I denne sammenheng vaskulær differensiering av cscs som befinner seg innenfor de svulster kan ha en sentral rolle i hurtig påfylling av endotelceller.
Nei studie hittil har adressert at en bestemt celletype initierer tumorvekst hos pasienter. Vår første xenotransplantasjon studier med leukemi hemmende faktor (LIF) behandlet udifferensierte MPeMSCs viste tidlig svulst induksjon i mus beviser at MPeMSCs er tumorigent. Selv om MPeMSCs ikke danner kolonier kuler i tilhenger cellekultur, enkeltcellekultur i en matriseplate som genereres koloni kuler som viser stamcelle-fenotypen av de avledede celler. I denne studien genererte vi et CSC tumormodell ved hjelp av et begrenset antall celler prolifererte fra en enkelt MPeMSC. Data fra denne studien, sett sammen med
in vitro
bevisene støtter en modell der MPeMSCs resuspendert i Matrigel fremme aggressiv tumorvekst i hovedsak på grunn av endothelial differensiering av cscs fordi alle injiseres musene håndgripelig svulster ca 60 dager med svulst celle injeksjon. Omvendt, tumor palpering var ikke tydelig i mus injisert med udifferensierte MPeMSCs resuspendert i PBS. Selv om celler med karsinogent potensial er likt fordelt i to grupper, de matrikskomponenter fremmet kolonidannelse og rask induksjon av endotel avstamning. I svulster endotelceller dedifferentiate eller transdifferentiate å danne mer stilk-lignende celler eller andre distinkte celletyper som kan bidra til en tidlig tumorvekst. Det har vist seg at mikromiljøet som omgir neovaskulatur av tumorer er svært proliferative og cscs har blitt funnet i umiddelbar nærhet til endotele celler [33]. Sammen våre data tyder på at multipotency og plastisitet MPeMSCs kan være en medvirkende faktor for MPeM tumorvekst hos pasienter. Videre undersøkelse av faktorer assosiert med CSC spredning og avstamning differensiering kan gi viktig innsikt i utviklingen av MPeM og kan gi grunnlag for utvikling av mer effektive terapeutiske intervensjoner.
Materialer og metoder
Cell Lines, cellekultur og Isolering av MPeMSCs
MPeM cellelinjer (Meso-CL1, Meso-CL2 og Meso-CL3) ble avledet fra humane MPeM svulster samlet på institusjon review board godkjente protokoller fra National Cancer Institute og informert samtykke ble oppnådd fra alle pasienter ved bruk av tumorprøver, inkludert dannelsen av cellelinjer [15]. Celler ble dyrket i RPMI-1640 (RPMI; Gibco) supplementert med 10% volum /volum FBS (Atlanta Biologicals) under standard cellekulturbetingelser i en fuktig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Celler ble bekreftet som mesothelioma ved immunhistokjemi for kjente mesothelioma markører og ved elektronmikroskopi og ble preget for
in vitro
vekstegenskaper og
in vivo
xenograft vekst. Selv om alle tre MPeM cellelinjer ble generert flytende stamceller, Meso-CL1, PTEN
(neg) cellelinje med potensiale til å generere både subkutane og intraperitoneale tumorer i atymiske nakne (nu /nu) mus ble brukt for undersøkelsen. Vi aktivert stamcelle generasjon i MPeM celler ved såing av dem ved sub-konfluent tetthet for å redusere celle-til-celle forankring i 5% volum /volum FBS-RPMI (serum-redusert medium). Under disse betingelser de MPeMSCs til stede i den parentale cellepopulasjonen genererer flytende stamceller som så ble samlet inn og dyrket i nærvær av LIF til å opprettholde dem i en udifferensiert tilstand. De flytende MPeMSCs oppsamlet fra LIF behandlede cellekultur ble brukt for etterfølgende eksperimenter. For alle eksperimenter MPeMSCs ble dyrket i fravær av LIF med mindre annet er angitt.
Short-Time Live-Cell Imaging og immunfluorescens
For å finne ut at de isolerte flytende cellene cscs, vi først studert stamcelle divisjon i levende celler ved time-lapse studier med mikroskopi (Olympus IX71); Bildene ble tatt med CellSens programvare. For immunofluorescens ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur, og deretter behandlet med 0,2% Triton X-100 (Sigma) i PBS i 10 minutter, bortsett fra for påvisning av celleoverflateproteiner. Cellene ble vasket med PBS og blokkert med 5% BSA i PBS inneholdende 0,25% NP-40 i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble deretter inkubert med noen av følgende primære antistoffer: Alexa Fluor konjugert monoklonalt anti-α-tubulin (1:1000 Millipore), Alexa Fluor konjugerte Phalloidin (1:1000, Invitrogen), Hoechst 33342 (1:5000; Sigma) , anti-nestin (anti-NES, 1:250; Millipore), anti-SIII-tubulin (anti-TUBB3; 1:1000, Covance), anti-vaskulær endotel vekstfaktor-reseptor (anti-VEGFR) 2 (1:200 ; Cell Signaling), anti-CD133 /1-allofykocyanin (APC, 1:100; Miltenyi Biotech). De følgende sekundære antistoffer fra Molecular Probes (Invitrogen) ble anvendt: Alexa Fluor konjugert mus eller kanin-anti-IgG (1:1000). Sekundære antistoffer alene eller mus IgG1 fungerte som kontroll for uspesifikk binding. Bilder ble tatt med enten Olympus CKX41 fluorescerende mikroskop utstyrt med F-View II CCD digitalt kamera eller ved hjelp av Olympus 1 × 81 mikroskop med en Fluoview-1000 confocal laserskanner.
BrdU Merking og Chase
for ytterligere å bestemme det asymmetriske celledeling i MPeMSCs, søkte vi å teste segregering av templat-DNA i løpet av mitotisk celledeling ved anvendelse av 5-brom-2-deoksyuridin (BrdU) puls-chase [34]. I korthet MPeMSCs ble behandlet med 1 mM BrdU (Sigma) for flere passasjer for å sikre at DNA-trådene ble merket med BrdU i store flertall av celler. Etter en lang puls BrdU ble fjernet fra cellekultur og ble undersøkt for BrdU-merking mønsteret under celledeling. Celler ble fiksert i 70% etanol og inkubert i 2 N HCl inneholdende 0,5% Triton X-100 i 1 time. og blokkert med 5% BSA inneholdende 0,25% NP-40. Cellene ble vasket og inkubert med anti-BrdU-FITC-antistoff (BD Biosciences) over natten ved 4 ° C, vasket og motfarget med DAPI. BrdU merking mønster i celler ble sett ved hjelp av Olympus 1 × 81 mikroskop med en Fluoview-1000 confocal laserskanner.
RNA Forberedelse, Real-time kvantitativ PCR og Western blotting
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp Trizol (Invitrogen) og forbehandles med DNase. Totalt 1 mikrogram RNA ble revers transkribert til cDNA med revers transkriptase III (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
