Abstract
Den plasma jet er foreslått som en roman terapeutisk metode for kreft. Anticancer aktivitet av plasma er blitt rapportert å involvere mitokondriell dysfunksjon. Men hva bestanddeler som genereres av plasma er knyttet til denne kreft prosessen og virkningsmekanismen fortsatt uklare. Her rapporterer vi at den terapeutiske effekten av luft plasma resultat fra generasjon av reaktive oksygen /nitrogenforbindelser (ROS /RNS) inkludert H
2o
2, Ox, OH
-, • O
2 , NOx, som fører til depolarisering av mitokondriemembranpotensialet og mitokondrielle ROS akkumulering. Samtidig ROS /RNS aktivere c-Jun NH
2-terminal kinase (JNK) og p38 kinase. Som en følge av behandling med luft plasmastråler induserer apoptotisk død i humane cervikale kreft HeLa-celler. Forbehandling av cellene med antioksidanter, JNK og p38-inhibitorer, eller JNK og p38 siRNA opphever den depolarisering av mitokondriemembranpotensialet og svekker den luft plasma-indusert apoptotisk celledød, noe som tyder på at ROS /RNS som genereres ved hjelp av plasma triggersignalveier som involverer JNK og p38 og fremme mitokondrie perturbasjon, som fører til apoptose. Derfor kan bruk av luft plasma være en mulig strategi for å eliminere kreftceller
Citation. Ahn HJ, Kim KI, Hoan NN, Kim CH, Moon E, Choi KS, et al. (2014) målretting kreft celler med reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser som genereres av Atmosfærisk trykk luft Plasma. PLoS ONE 9 (1): e86173. doi: 10,1371 /journal.pone.0086173
Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA
mottatt: 27 september 2013; Godkjent: 06.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Ahn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation i Korea tilskudd finansiert av Korea regjeringen (MSIP) (2012M3A9B2052871, 2010-0018546, 2011-0030043). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Plasma blir ofte referert til som den fjerde tilstand av materie i tillegg til fast, flytende og gass. Plasma er ganske lik den gass der en andel av partiklene er ionisert og ladet, noen partikler er elektrisk nøytralt, og noen er kjemisk aktivert radikaler. Plasma kan kategoriseres som enten «termisk (eller varme) plasma» eller «ikke-termisk (eller kald) plasma.» Mange teknikker ved hjelp av plasma har blitt undersøkt og implementert i enkelte industrielle anvendelser. Nylig har plasma-programmer vært ansatt i biologiske og medisinske fag, inkludert blod koagulasjon [1], kreftbehandling [2], sterilisering overflaten [3], og dental hulrom behandling [4]. Spesielt kan øke plasma translasjonell forskning i kreftbehandling løfte nye terapeutiske effekter. Dessuten er det interessant at kald plasma som genereres ved atmosfæretrykk øker muligheten for medisinske anvendelser.
Selv om det biologisk effektive materiale (r) som er generert fra plasma og dets cellulære mål forblir ukjent, flere bevislinjer kobling reaktivt oksygen /nitrogenforbindelser (ROS /RNS) til dens biologiske effekter. Behandling med plasma forårsaket depolarisering av mitokondriemembranpotensialet og generering av ROS i humane celler [2]. I tillegg, antioksydanter bedres plasmaindusert mitokondriell dysfunksjon, støtter ideen om at oksiderende arter som ROS kan mediere plasma-induserte virkninger på pattedyrceller [2]. Et bredt spekter av tilsynelatende urelaterte og komplekse årsaker til mitokondriell dysfunksjon har felles underliggende patofysiologiske mekanismer: ROS produksjon og opphopning av mitokondrieskade, som fører til økt oksidativt stress, tap av ATP, mitophagy for kvalitetskontroll og eliminering av skadede mitokondrier, og til slutt celledød [5].
Det er nå klart at ROS har en cellesignale rolle i mange biologiske systemer fra bakterier til pattedyrceller [6]. ROS kan aktivere cellesignaleringskaskader, slik som de som involverer mange forskjellige mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) kaskader [7], [8]. Disse inkluderer stress kinase, c-Jun N-terminale kinaser (JNK) og stress-aktivert protein kinase (SAPK). JNKs ble identifisert som en kinase som binder og fosforylerer c-Jun på Ser-63 og Ser-73 innenfor sitt transcriptional aktivering domene. JNK aktiveres ved behandling av celler med cytokiner (for eksempel tumor nekrose faktor (TNF) og interleukin (IL) -1) og ved eksponering av celler til mange former for miljøstress (som osmotisk stress, redox-stress, og stråling ) [9]. Det har vært godt etablert at ROS er potente indusere av JNK. De fleste rapporter om ROS-indusert JNK-aktivering resultat fra eksogene ROS, for det meste H
2o
2. I tillegg kan ROS opphopning indusert av apoptotiske stimuli aktivere SAPK-p38 [10]. JNK og p38 MAPK trasé dele flere oppstrøms regulatorer, og følgelig det er flere stimuli som samtidig aktiverer begge veier.
Koblinger mellom ROS alarm og apoptose er foreslått å være mediert av mitokondrier. Foreløpig mange studier har antydet at mitokondriene er det viktigste stedet for handling for JNK i apoptose. Både JNK1- og JNK-slettet primære murine embryonale fibroblaster har vist motstand mot UV-indusert apoptose på grunn av en defekt i mitokondrie død signalveien, herunder unnlatelse av å frigjøre cytokrom c [11]. Mitokondrie trans av JNK oppstår i forhold til stress som eksponering for UV, ioniserende stråling, ROS og RNS, og dermed mitokondrie-lokaliserte JNK gir nærhet til mitokondriene generert ROS [12], [13]. I tillegg apoptotiske stimuli noen ganger føre til p38a aktivering av en sekundær rute, for eksempel produksjon av ROS [13]
Vi, og flere andre grupper har rapportert at atmosfærisk trykk plasma [2], [14]. – [19] og nitrogen plasmastråler fra en mikro dysegruppe [20] indusere apoptose i kreftceller. Nylig har plasma blitt vist å fremme apoptose av kreftceller ved generering av ROS, forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial, og aktiveringen av caspase familieproteiner [2]. Imidlertid, hva komponenten (e) som genereres av luft plasma produserer sin anticancer-effekter og den molekylære mekanismen som plasma induserer apoptose uklare. For denne rapporten, forsøkte vi å finne effektor komponenten (e) som ble generert fra luft plasma og dens mål og for å klargjøre den molekylære mekanismen og biokjemiske veien ved hvilken det induserer kreft terapeutiske fordeler. Vi identifiserte ROS /RNS som viktige effektorer av luft plasma, som er rettet mot mitokondrier og fører til aktivering av JNK og p38 signalveier.
Resultater
Air mikro plasma jet kan generere reaktivt oksygen og nitrogenforbindelser
mikroplasmastråle system opereres ved atmosfæretrykk kan produsere kjemisk aktive arter, særlig oksygen- og nitrogenatomer [21]. I denne studien vi først anvendes optisk emisjonsspekteranalyse for å identifisere partikler og radikaler som genereres av luftplasmasystemet (figur 1a-b), som kan mediere virkningene av luft plasma hos kreftceller [2], [22]. Optisk emisjonsspektroskopi (OES) ble utført over et bredt område av bølgelengder fra 280 nm til 920 nm med en optisk emisjonsspektroskopi (SV 2100, K-MAC) (figur 1c). De dominerende emisjonslinjer illustrere nærvær av glade oksygen ioner (O
2
+) på 500-600 nm og atom oksygen (O I) ved 777 og 844 nm (Figur 1c). I tillegg er oppdaget reaktive arter knyttet til nitrogen er eksiterte nitrogenmolekyler (N
2 andre positive system og N
2 første positive system) i de områder av 300-390 og 610-710 nm og ioniserte nitrogenmolekylene (N
2
+ første negativ-system) i området 390-480 nm, og atom nitrogen (NI) ved 747, 822, og 868 nm (figur 1c). Disse OES resultatene indikerer at luftmikroplasmastråle kan spille en viktig rolle i produksjon av forskjellige reaktive oksygen- og nitrogenforbindelser (ROS og RNS, henholdsvis).
(a) Foto på fabrikkerte Mikro jet-system. Det innfelte er en skjematisk fremstilling av mikroplasmastrålemunnstykket. (B) Fotografi av luft mikroplasmastråle som genereres ved atmosfæretrykk. (C) Optisk utslipp spekteret av luft mikro plasmastråle under utladning.
ekstracellulær og intracellulær ROS og RNS ble generert av luft plasma eksponering
Et hint om at ROS og RNS kan megle kreft effekter av luft plasma ble foreslått av vår tidligere studie rapporterer at luften plasma indusert apoptose, ledsaget av den generasjonen av ROS og RNS og minkende mitokondriemembranen potensial (MMP) i livmorhalskreftceller [2]. Videre er produksjonen av ROS og RNS ved hjelp av plasmastråle nylig blitt observert [23], og er i samsvar med emisjonsspektra som induseres av luft plasma (figur 1c). Derfor har vi analysert biokjemisk produksjon av ROS og RNS, deres levering inn i den flytende fase av cellekulturmediet, og den sekvensielle migrasjon av ROS og RNS inn i celler (figur 2).
(a) Nivåer ekstracellulære H
2o
2 ble bestemt i kultur eller ikke-kultur (Medium bare) supernatanter, med (AP) eller uten (non-behandlet) luft plasma behandling. Kultursupernatanten ble høstet ved de indikerte tidspunkter etter luft plasmabehandling (AP). AP 0 (min) indikerer supernatanten innhøstet umiddelbart etter plasmabehandling. Konsentrasjonen av H
2o
2 i kultursupernatanten ble bestemt ved sammenligning med en H
2o
2 standard kalibreringskurve, etter inkubasjon med Amplex UltraRed reagens (
n =
5). (B) Generasjon og /eller penetrasjon over plasmamembranen av ROS inkludert H
2o
2, OH
– og • O
2 i den intracellulære matrisen følgende luft plasma jet (AP) var bestemmes ved hjelp av ROS-sensitive sonde H
2DCFDA (
n
= 5). Fluorescensen av ubehandlede celler (ikke-behandlet) ble vilkårlig satt til 1. (c) Nivåer av ekstracellulære NO ble bestemt i ikke-kultur (i fravær av HeLa-celler, øvre) og kultur (i nærvær av HeLa-celler, bunn ) supernatanter ved de angitte tidene etter luft plasmastråle eksponering av Griess-analysen (
n
= 10). (d) Nivåer av intracellulær NO ble evaluert ved hjelp av DAF-FM. Data er vist som gjennomsnitt ± S.E.M. (
n
= 10).
Vi først undersøkt om behandling med luft plasma ville indusere dannelsen av H
2o
2 i kultursupernatanten (figur 2a ). Kultursupernatanten ble høstet ved de indikerte tidspunkter etter luft plasmabehandling, og konsentrasjonen av H
2o
2 i kultursupernatanten ble analysert ved sammenligning med H
2o
2 standard kalibreringskurve. H
2o
2 ble generert ved ca. 26,93 uM umiddelbart etter behandlingen med luft plasmadyser og konsentrasjonen i kultursupernatanten raskt ble redusert i løpet av 1 time. Men H
2o
2 i ikke-kulturmedium alene redusert saktere inntil 1t følgende plasma behandling, sammenlignet med nivået i kultur supernatanten. I 3 h, nivåene av H
2o
2 var lik i supernatanter fra HeLa cellekultur og i medium bare. H
2o
2 var knapt detektert i kultursupernatanten, i 3 timer etter plasmabehandling (figur 2a). Disse resultatene tyder på at luft plasma kan generere og levere sekvensielt H
2o
2 i mediet. I tillegg, er årsaken til den første rask nedgang i H
2o
2 generert av luft plasma i kultursupernatanten sammenlignet med den i ikke-kulturmedium kan være at cellene fremme fang av H
2O
2. For å teste denne muligheten, overvåket vi nivåene av H
2o
2 i kultur supernatant og ikke-kulturmedium alene følgende H
2o
2 behandling (Figur S1 A). Når HeLa celler ble behandlet med 2 mm H
2o
2, H
2o
2 ble likeledes påvist i både kultur supernatant og ikke-kultur medium umiddelbart etter behandling. Men i 3 timer etter H
2o
2 behandling, H
2o
2 knapt ble påvist (ca. 100 pM) i kultursupernatanten, men nivået holdt seg på ca 670 pM i ikke- dyrkingsmedium (figur S1 A). Basert på dette resultatet, er det spekulert i at cellene kan skattekart H
2o
2 generert av luft plasma, som fører til en akselerert nedgang i H
2o
2 i kultursupernatanten.
Vi overvåkes neste generasjon av intracellulære ROS inkludert H
2o
2, hydroksylradikaler (OH
-), og singlet oksygen (• O
2), etter plasma behandling, ved hjelp av H
2DCFDA (figur 2b). Etter luft plasma behandling, intracellulære ROS-nivåer økt med ca 2,7 ganger (2,73 ± 0,13). Denne forhøyede nivået ble redusert til 3 timer etter plasmabehandling og gjenvinnes nesten til den ikke-behandlede basalnivået i løpet av 24 timer (figur 2b). Disse dataene tyder på at plasmabehandling induserer dannelsen av intracellulære ROS.
Deretter evalueres vi hvorvidt luft plasma kan resultere i genereringen av ekstracellulære og intracellulære RNS (figur 2c og d, henholdsvis). Umiddelbart etter plasma behandling, ble ekstracellulære ingen nivåer forhøyet til ca 13.28 mm i både ikke-kultur og kulturmedier (figur 2c). Ved 3 time etter plasma behandling, ekstracellulære NO nivåene i ikke-kultur og kulturmedier raskt redusert til ca 8,26 eller 5,8 mm, henholdsvis (figur 2c). Ved tidspunkter senere enn 3 timer ble det ekstracellulære NO nivå i ikke-kulturmedium opprettholdes, mens det ekstracellulære NO nivå i kulturmedium ble kontinuerlig redusert til omtrent 1,28 mm i 24 timer etter plasmabehandling (figur 2c), noe som indikerer at celler kan opptak eller fjerne ekstracellulære NO generert av plasma.
på samme måte ble intracellulære NO-nivåer i plasma-behandlede celler økt med ca 1,8 ganger (1,75 ± 0,20) eller 2,3 ganger (2,28 ± 0,07) i 1 time og i 18 timer etter luft plasma behandling, henholdsvis, sammenlignet med de i ikke-behandlede celler. Den forhøyede intracellulære NO nivå ble opprettholdt inntil 24 timer (data ikke vist) etter plasmabehandling og gjenvinnes nesten til den ubehandlede basalnivået i løpet av 48 timer (figur 2d og fig S1b), tilsvarende til ROS-nivåer etter plasmabehandling (figur 2b). Air plasma indusert en større og mer varig økning i NO enn det indusert av H
2o
2 (figur 2d og Figur S1b-c). Samlet utgjør disse data tyder på at plasma behandling induserer generering av ekstracellulære og intracellulære NO.
For å støtte at luft plasma genereres ROS og RNS nivåer i pattedyrceller, vi undersøkt om antioksidanter dempe plasma-indusert ROS /RNS generasjon ved å måle ROS og RNS-nivåer i HeLa-celler etter behandling med plasma i nærvær av antioksidanter. Først ble det undersøkt hvorvidt den kjente tiol antioksydant NAC [24] kan påvirke konsentrasjonen av H
2o
2 i kultursupernatantene etter luft plasma-behandling (figur 3a). I kombinasjon med plasmastråle, HeLa cellekulturmedium eller bare var forbehandlet med NAC. NAC indusert rask reduksjon av H
2o
2 til ca. mindre enn 4,13 ± 1,67 mikrometer i 15 min etter plasma behandling, i likhet med nivåene observert i to timer etter at plasma behandling uten NAC (figur 3a), noe som tyder på at NAC kan lindre luft plasma-indusert H
2o
2 generasjon. Vi neste undersøkt om antioksidanter kan redusere luft plasma-indusert generasjon av intracellulær ROS (figur 3b). For å gjøre dette, vi evaluert ROS-nivåer etter forbehandling med antioksidant NAC eller cPTIO og eksponering til luft plasma. Både NAC og cPTIO kunne dempe dannelsen av intracellulære ROS indusert av luft plasma (figur 3b). Interessant, den klare dempningen av intracellulær ROS generering av cPTIO, en effektiv antioksidant av RNS som nitrogenoksid (NO
•), har ført til spekulasjoner om at luft plasma kan generere RNS samt ROS og den intracellulære generering av ROS kan være knyttet til generering av RNS.
(a) Nivåer av ekstracellulære H
2o
2 ble bestemt i kultur eller ikke-kultur (Medium bare) supernatanter med luft plasma behandling i nærvær (AP + NAC) eller fravær (AP) av antioksidant NAC (
n
= 5). NAC ble lagt 1t før plasma behandling. Kultursupernatanten ble høstet ved de indikerte tidspunkter etter luft plasma-behandling. AP 0 (min) indikerer supernatanten innhøstet umiddelbart etter plasmabehandling. (B) Generering av ROS inkludert H
2o
2, OH
– og • O
2 i den intracellulære matrisen følgende luft plasma jet (AP) ble bestemt ved hjelp av ROS-sensitive sonde H
2DCFDA (
n
= 5). Cellene ble forbehandlet med antioksidanter NAC eller cPTIO i 1 time og deretter eksponert for luft plasma (AP + NAC eller AP + cPTIO) eller H
2o
2 (H
2o
2 + NAC eller H
2o
2 + cPTIO). På indikert ganger etter luft plasma behandling, ble cellene høstet. Fluorescensen av ubehandlede celler (ikke-behandlet) ble vilkårlig satt til 1. (c) Nivåer av ekstracellulære NO ble bestemt i ikke-kultur (i fravær av HeLa-celler, øvre) og kultur (i nærvær av HeLa-celler, bunn ) supernatanter ved de angitte tidene etter luft plasmastråle eksponering av Griess-analysen (
n
= 10). Medium i nærvær eller fravær av HeLa-celler ble forbehandlet med NAC eller cPTIO i 1 time før eksponering for plasma eller H
2o
2. (d) Nivåer av intracellulær NO ble evaluert ved hjelp av DAF-FM. Data er vist som gjennomsnitt ± S.E.M. (
n
= 10).
Vi videre undersøkt om antioksidanter kan redusere luft plasma-indusert generasjon av RNS. Vi har funnet at NO antioksidant cPTIO fremmet avtar i det ekstracellulære NO nivået indusert av plasma i både kultur supernatant og ikke-kulturmedium (figur 3c). I motsetning til NAC hadde liten effekt på plasma-indusert ekstracellulære INGEN nivåer i både kultur og ikke-kulturmedium (figur 3c). I samsvar med ekstracellulære ingen resultater, kan c-ptio men ikke NAC vesentlig forringe generering av intracellulære RNS med fly plasma (Figur 3d og Figur S1b). Den spesifikke demping av luft plasma-indusert RNS av cPTIO (den effektive RNS antioksidant) og demping av H
2o
2-indusert RNS av både NAC (den effektive ROS antioksidant) og cPTIO (figur 3d) foreslår at luft plasma kan generere RNS direkte, men H
2o
2-indusert RNS generasjon kan være mediert via sti (er) med ROS mellomprodukter. Tatt sammen med ROS og RNS generasjons data (figur 2-3), våre funn tyder på at luft plasma kan generere ekstracellulære og intracellulære ROS og RNS i kultursupernatanter og mobil miljø.
Air plasma aktiverer JNK og p38 MAPK-mediert signalveien
for å avgjøre om ROS og RNS generert av luft plasma kan fungere som signalmolekyler og hva signalveier er involvert i denne transduksjon, vi søkte på MAPK kaskader som er kjent for å være innblandet i signalveier som svar på oksidativt stress som ROS, RNS, UV, og ioniserende stråling. For å gjøre dette, testet vi om ROS /RNS generert av luft plasma induserer JNK, p38, og /eller ERK-aktivering. Immunfluorescens og immunoblotting analyser ble utført for å evaluere fosforylering av disse kinaser indusert av H
2o
2 og dens aktivering i respons til luft plasma-behandling (Figur 4 og Figur S2). Eksponering for luft plasma høyt indusert aktivering av JNK, sammenlignet med sin beskjedne aktivering av H
2o
2 (figur 4a og figur S2A), noe som tyder på at signale kan fremkalt av luft plasma og kan derfor aktivere en JNK-mediert signaltransduksjonsbane. Når cellene ble behandlet med plasma eller H
2o
2 i nærvær av en inhibitor av JNK (SP600125), JNK-aktivering ble opphevet som forventet, i 1 time etter behandling med plasma eller H
2o
2 (figur 4a og figur S2A). Også NAC var i stand til å redusere JNK aktivering av plasma eller H
2o
2 (figur 4a, lav panel), noe som indikerer at noen form for oksidativt stress signal kan fremkalt av plasma.
(a) Fosforylering av JNK etter behandling med luft plasma jet eller H
2o
2 ble analysert via immunfluorescens farging og immunblotting ved hjelp av anti-fosfor-JNK antistoff. Den tilsvarende mengde av totale JNK-proteiner er vist som en kvantitativ lastekontroll for JNK fosforylering. (B) Fosforylering av p38-indusert av luft plasma ble visualisert ved immunoblotting ved anvendelse av anti-fosfo-p38-antistoff. Tilsvar totale p38-proteiner er vist som en lasting kontroll for p38 fosforylering. (C) Variasjon av fosforylering status av ERK ble ikke oppdaget etter behandling med luft plasma eller H
2o
2.
Deretter undersøkte vi aktivering av p38 av plasma og om NAC kunne påvirke p38-aktivering indusert av plasma. På en måte som er analog med JNK, luft plasma fremkalt fosforylering av p38 og denne plasma-induserte fosforylering ble delvis forbedres ved NAC, noe som indikerer at den luft plasma-indusert signal kan aktivere p38-medierte signalveien, og kan være en form for oksiderende signal (Figur 4b og figur S2B). I motsetning til dette plasma hadde liten effekt på fosforyleringen av ERK1 /2 (figur 4c). Disse dataene, sammen, tyder på at luft plasma kan fremkalle intracellulære signaler og sekvensielt aktivere intracellulære signaloverføringsveier formidlet via JNK eller p38.
Air plasma induserer mitokondrie ROS akkumulering og mitokondriell dysfunksjon
Mitokondrier er en viktig kilde til mobilnettet ROS generasjon [25] og oksidativt stress inkludert H
2o
2 kan initiere kollaps av mitokondrie transmembrane potensial (Δψm) [26]. I en tidligere rapport, fant vi at sammenbruddet av mitokondrie transmembrane potensial (Δψm) blir indusert av N
2 eller luft plasma [2]. For å se om plasma kan indusere mitokondrielle ROS akkumulering, målte vi mitokondrie superoxide følgende plasma behandling ved hjelp MitoSox, et fluorogent fargestoff for selektiv deteksjon av superoksid i mitokondriene i levende celler (figur 5a). Mitokondrie superoxide i cellene økt ved behandling med luft plasma eller H
2o
2. Videre nivået av mitokondrie superoxide i celler behandlet med luft plasma (4,32 ± 0,05) var ca. 2 ganger høyere enn i H
2o
2-behandlede celler (2,36 ± 0,23) på 6 timer etter behandling med plasma (figur 5a). Etter denne tid (dvs. 6 timer etter behandling), den akkumulerte mitokondrie superoksid i plasma-behandlede celler ble redusert, mens den akkumulerte superoksid i mitokondriene i H
2o
2-behandlede celler vedvarte inntil 24 timer (2,45 ± 0,39) (figur 5a). Disse resultatene tyder på at luft plasma kan indusere akkumulering av ROS inkludert superoksyd i mitokondriene.
(a) Mitokondriell ROS-produksjon ble evaluert ved bruk av mitokondriene-spesifikk probe Mitosox følgende H
2o
2 eller luft plasma behandling. Den mitokondrielle ROS i ubehandlede celler (ikke-behandlet) ble vilkårlig satt til 1. Cellene ble høstet ved de indikerte tidspunkter etter luft plasmabehandling og analysert ved strømningscytometri. (B) Celler ble forbehandlet med antioksidanter (NAC eller cPTIO) eller kinaseinhibitorer (SP600125 eller SB203580) i 1 time og deretter eksponert for luft plasma (AP + NAC, AP + cPTIO, AP + SP eller AP + SB) eller H
2o
2 (H
2o
2 + NAC, H
2o
2 + cPTIO, H
2o
2 + SP eller H
2o
2 + SB). Cellene ble høstet ved indikerte tidspunkter etter plasmabehandling, og nivåene av mitokondrienes ROS ble målt (
n
= 5). Fluorescensen av ubehandlede celler (ikke-behandlet) ble vilkårlig satt til 1. (c) mitokondriemembranpotensialet ble evaluert ved bruk av mitokondriene-spesifikk probe JC-1, med eller uten luft eller plasma H
2o
2, (
n
= 5). Den fluorescens i ubehandlede HeLa-celler ble vilkårlig satt til 1.
I tillegg undersøkte vi om antioksidanter kan svekke den mitokondrielle superoksid opphopning indusert av luft plasma. NAC eller cPTIO var i stand til å minske produksjonen av mitokondriell superoksid (figur 5b). Ettersom luft plasma aktiverer JNK og p38-medierte signalveier (figur 4a-b og fig S2), ble muligheten for at plasmaaktiverte signaloverføringsprosessene er involvert i den mitokondrielle ROS opphopning undersøkt. Vi fant ut at kinase hemmere SB203580 og SP600125 var i stand til å undergrave plasma-indusert mitokondrie superoxide generasjon (figur 5b), noe som tyder på at plasma kan indusere ROS produksjonen i mitokondriene i en JNK- og p38-avhengig måte.
Fordi luft plasma indusert generasjon mobil ROS /RNS (figur 2) og mitokondrielle ROS (figur 5a) og sammenbruddet av mitokondrie transmembrane potensial (Δψm) [2], vi undersøkt om ROS /RNS kan være knyttet til luft plasma- mitokondriell dysfunksjon indusert ved behandling av HeLa-celler med luft plasma i nærvær av antioksidanter NAC eller cPTIO. Vi overvåket mitokondrielle transmembranpotensialet (Δψm) etter plasmabehandling i fravær eller nærvær av NAC eller cPTIO, ved hjelp av mitokondriene-spesifikk probe JC-1. Air plasma eller H
2o
2 behandling indusert økende intensitet av grønn /rød fluorescens (ca. 3,3 ganger eller 2,1 ganger på 12 timer og 2,9 ganger eller 3,6 ganger på henholdsvis 24 timer,), som bekrefter at både plasma og H
2o
2 kan indusere en reduksjon i Δψm (figur 5c). NAC eller cPTIO viste delvis forbedrende effekt på reduksjon i Δψm indusert av plasma eller H
2o
2 behandling (figur 5c), noe som tyder på at luft plasma-indusert ROS /RNS kan spille en rolle i mitokondriell dysfunksjon. Fordi signaltransduksjon prosessene som ligger bak plasma-indusert reduksjon i Δψm er ukjent, bestemt vi enten hemmere av JNK og p38 kan redusere plasma-indusert mitokondrieskade. På lignende måte, inhibitorer av JNK og p38 (SP600125 eller SB203580) var i stand til å dempe virkningene av plasma og H
2o
2 på Δψm reduksjon, selv om det ikke er noe som resulterer i normal Δψm (figur 5c). Disse resultatene tyder på at luft plasma produserer ROS /RNS, som fører til aktivering av signaltransduksjon via JNK og p38. Samtidig ROS /RNS synes å indusere sammenbruddet av Δψm, som er delvis mediert gjennom JNK og p38 signaltransduksjon
ROS /RNS generasjon induserer plasma-indusert celledød ved apoptose via aktivering av mobilnettet JNK og p38-mediert signal transductions og mitokondriell dysfunksjon
for å finne ut luft plasma-indusert celledød, vi først testet muligheten for at ROS /RNS var ansvarlige for luft plasma-indusert kreft celledød ved å behandle HeLa celler med luft plasma i nærvær av antioksidanter NAC eller cPTIO. Forbehandling med NAC og cPTIO dempes plasma-indusert celledød (49,5% ± 2,2% og 38,86% ± 4,2%, henholdsvis figur 6a og figur S3), som bekrefter at ROS /RNS er innblandet i plasma-indusert celledød. Fordi det er ingen god kontroll for RNS lik bruk av H
2o
2 som en kanonisk kontroll for ROS, vi også testet om Nano
3 kan indusere apoptose, plausibly involverer NO og RNS generert fra Nano
3. Nano
3 fremmet celledød ved høyere konsentrasjoner enn gjorde H
2o
2 (Figur S3-S4). Ifølge dette resultatet, grunnen NANO
3 induserer ikke effektiv celledød er at den ikke klarer å generere effektive RNS /ROS motsetning til luft plasma eller H
2o
2 (figur S4).
(a) Antioxdizing midler (NAC og cPTIO) eller kinaseinhibitorer (SP600125 og SB203580) delvis reddet plasma-indusert celledød. Data er vist som gjennomsnitt ± S.E.M. (
n
= 10). (B) Plasma-indusert celledød ble delvis opphevet i JNK1 /2 (siJNK1 /2) eller p38 (sip38) knockdown-celler. For å overvåke plasma-indusert celledød, ble ATP-baserte cellelevedyktighet assay utføres i nærvær av kontroll, JNK1 /2, eller p38 siRNA. Data er vist som gjennomsnitt ± S.E.M. i tre eksemplarer fra tre uavhengige forsøk (
n
= 3). Celleviabilitet av ubehandlede HeLa-cellepopulasjonen ble vilkårlig satt til 100%. Immunblotting med anti-JNK og p38-antistoffer ble gjort for å bekrefte knockdown. * P 0,01, ** p 0,05. (C) – (d) Air plasma indusert Bax trans til mitokondriene. Den plasma- eller H
2o
2-behandlede celler ble videre inkubert i 6-24 timer. Etter 6-24 timers inkubering ble cellene fiksert med 3,7% formaldehyd. Bax (grønn) var farget anti-Bax antistoff og MitoTracker ble brukt til farging av mitokondrier (rød). Bax (grønn) og mitokondrielle (rød, MitoTracker) fluorescens ble vurdert, 6 timer, (d) og 24 timer ((c) og (d)) etter eksponering for luft plasma i 5 min ved fluorescens konfokal mikroskopi. Bax ble diffust fordelt i ubehandlede celler (ikke-behandlet). Imidlertid, etter behandling med plasma, ble Bax lokalisert til mitokondriene, basert på overlappingen av de Bax og MitoTracker fluorescens bilder (Merge, gul). DAPI ble brukt for nukleær farging (blå). Hvit bar var gjennomsnittlig forstørrelse av bildet (10 mm). (E) Bud dannet proapoptotiske kompleks med BCL-xL følgende plasma behandling. (F) Luft plasma indusert differensial celledød i human lunge adenokarsinom A549 og normale lunge fibroblast MRC5 cellelinjer. A549 og MRC5-celler ble behandlet med luft plasmastråler og deretter inkubert i ytterligere 24 timer. Etter høsting og å merke celler med anti-annexin V-FITC og PI, ble celledød evaluert ved flow cytometri. Verdiene representerer gjennomsnittet (s.e.m) fra tre uavhengige eksperimenter. (G) En foreslått modell for luft plasma jet-indusert apoptose i HeLa celler gjennom ROS /RNS produksjon, adgang forbudt på celler, aktivering av signaloverføringsveier, og mitokondriell skade.
For å undersøke rollen til JNK og p38 MAPK trasé i luft plasma-indusert celledød ved apoptose, ansatt vi deres spesifikke hemmere, SP600125 (hemmer av JNK) og SB203580 (hemmer av p38 MAPK). Når celler ble forbehandlet med SP600125 eller SB203580 før luft plasmastråleeksponering ble apoptotisk celledød populasjon redusert til 59,3% ± 2,3% og 52,0% ± 9,7%, sammenlignet med celledød indusert av plasmastråle alene (85,4 ± 3,4%) (Figur 6a og figur S3), noe som tyder på at signaloverføring via JNK og p38 er delvis involvert i plasma-indusert celledød. For å få mer innsikt i rollene som JNK og p38 under plasma-indusert celledød ble cellelevedyktigheten til JNK- eller p38-utarmet celler analysert følgende plasma behandling ved å måle ATP fra levende celler. Vi fant at plasma-indusert reduksjon i cellenes levedyktighet ble dempet ved JNK1 /2 siRNA eller p38 siRNA (figur 6b).
