Abstract
hyaluronan (HA) er et karbohydrat av den ekstracellulære matrise med tumor fremme effekter i en rekke kreftformer. Denne studien adressert rollen HA matrise for progresjon og prognose for human blærekreft ved å studere uttrykk og funksjon av HA-relaterte gener.
Metoder
Vevsprøver av 120 pasienter med ulike stadier av overgangsordning celle blærekreft, som gjennomgikk kirurgisk behandling for blærekreft ved Universitetssykehuset i Essen ble analysert. mRNA-uttrykk nivåer av HA synthases (HAS1-3) og HA-reseptorer (RHAMM og CD44) ble evaluert av real time RT-PCR i forhold til sunn blæren vev som kontroll. I uni- og multivariate cox proporsjonal hazard overlevelse regresjonsanalyse, ble virkningen av genuttrykk nivåer på overlevelse vurderes.
I
vitro
knock-down av RHAMM, CD44 og har isoenzymer ble oppnådd ved siRNA og lentiviral shRNA i J82 blæren kreftceller. Transfekterte celler ble analysert
i
vitro
med hensyn til spredning, cellesyklus og apoptose. J82 celler etter knock-down av RHAMM ble xenopodet inn i mannlige nu /nu atymiske mus til å overvåke tumorprogresjon
i
vivo
.
Resultater
I invasive kreft stadier RHAMM-, has1 og has2 mRNA-uttrykk nivåer ble hevet mens HAS3v1 ble redusert sammenlignet med ikke-invasive svulster. Deretter Kaplan-Meier analyse avdekket redusert blærekreft spesifikk overlevelse hos pasienter med høyt RHAMM mRNA og lav HAS3v1 uttrykk. Forhøyet RHAMM i invasive svulster ble bekreftet av RHAMM immunhistokjemi. Videre multivariat analyse viste at bare RHAMM uttrykk var assosiert med dårlig prognose uavhengig av andre overlevelsesfaktorer (HR = 2,389, 95% KI 1,227 til 4,651, p = 0,01). Lentiviral RHAMM knock-down avslørte redusert J82 celleproliferasjon
i
vitro Hotell og redusert xenograft tumorvekst
i
vivo
.
Konklusjon
dataene tyder på at RHAMM spiller en avgjørende rolle som formidler utviklingen av muskel-invasiv blærekreft og anbefaler RHAMM for videre evaluering som en prognostisk markør eller terapeutisk mål i blærekreft terapi.
Citation : Niedworok C, Kretschmer jeg, Rock K, vom Dorp F, Szarvas T Hess J et al. (2013) Virkningen av Receptor av hyaluronan-mediert motilitet (RHAMM) on Human urothelial Transitional Cell Kreft i blæren. PLoS ONE 8 (9): e75681. doi: 10,1371 /journal.pone.0075681
Redaktør: Nikos K Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 14 november 2012; Akseptert: 21. august 2013, Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Niedworok et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av DFG Fi682 /4-1 og IFORES Program ved University of Essen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transitional karsinom (TCC) av blæren er den niende mest vanlige ondartede sykdommen med en global 5-års prevalens av 860,299 hanner og 249,966 kvinner [1]. I ikke-muskel-invasiv tumorer (Ta) progresjon til muskel-invasiv sykdom (T2-T4) er sjeldne og forekommer hos 3-5% av alle tilfeller [2]. Mens pasienter med genetisk stabil nonmuscle invasive lave svulster grad viser en utmerket fem års overlevelse på 96%, pasienter med dyp muskel infiltrere svulster høy klasse har den verste prognosen med en fem års overlevelse på ca 20% [2,3]. I exophytic, nonmuscle invasive lav karakter svulster transurethral reseksjon (TUR) er den lokale, blære bevare, behandling av valget. I muskel infiltrere svulster radikal cystektomi med utvidet bekken lymfeknute disseksjon er generelt akseptert behandling med kurativ hensikt. Hos pasienter med alvorlig komorbiditet behandlingsalternativ er den kombinerte kjemo- og stråleterapi. Likevel muskel infiltrere overgangscellekreft i blæren representerer en heterogen gruppe svulster med hensyn til klinisk utfall. Hos pasienter med pt3 /4 svulster ca 50% er i faresonen for å utvikle metastaser til tross for utvidet kirurgi. Derfor er det av stor betydning for å belyse patofysiologien til BC, og for å utvikle mer presise diagnostiske markører for progresjon av denne undergruppe av muskel-invasive karsinomer der det gis høy risiko for kreft spesifikk dødelighet.
Hyaluronan (HA) er en polymer av alternerende N-acetylglukosamin og glukuronsyre-rester, og er en av hovedkarbohydratkomponenter i den ekstracellulære matriks (ECM). HA er syntetisert av tre HA-syntase (HAS) isoenzymene (has1, has2, HAS3) og er enten beholdt nær celleoverflaten hvor den danner en pericellulær HA-rike mikromiljøet eller frigjøres fra celleoverflaten og avsatt i den ekstracellulære matriks. HA i seg selv ikke forandrer men har vist seg å støtte mange viktige aspekter i forbindelse med malign cellefenotype, for eksempel proliferasjon, migrering og resistens mot apoptose [4]. Selv betennelse kan fremmes ved HA forming supramolekylære strukturer, HA-kabler, som binder monocytter og lymfocytter, og er derfor tenkt å forbedre betennelse [5].
Ulike kreftformer er assosiert med økt tumorcelle eller stroma celle tilknyttet HA og med differensial uttrykk for HAS-isoenzymer [6]. Så langt er det ikke klart hvorvidt den spesifikke assosiasjon av HAS-isoenzymer med spesifikke kreft entiteter reflekterer forskjellige biologiske rollene til de HAS isoenzymer, eller er et resultat av (i) nærværet av forskjellige autokrine og parakrine faktorer og /eller (ii) den spesifikke celle typer som er involvert i hver kreft enhet. Det er imidlertid sannsynlig at HAS-isoenzymer er forskjellige med hensyn til størrelsen av det utskilte HA-polymer som fortløpende kan fremkalle forskjellige biologiske funksjoner [7]. Den mest effektive mekanisme for å endre lengden på HA polymerer er hyaluronidases (Hyal) som har vist seg å sterkt støtte tumorprogresjon etter, genererer HA fragmenter (SHA) som er aktivatorer av HA signaliserer gjennom enten CD44 eller toll-like reseptorer. Videre er sha involvert i tumor angiogenese som bidrar til tumor støtte virkningen av HA [8,9]. Generelt, induserer HA cellulær signalisering gjennom HA-reseptorer så som CD44 og reseptoren av hyaluronan-mediert motilitet (RHAMM). Begge HA reseptorer har vært innblandet i utviklingen av kreft sannsynlig ved å fremme ondartede kreftcelle fenotyper [4,10]. Spesielt, aktivering av ERK1 /2-signalveien og den PI3K sti kunne bidra til tumoren å fremme effekten av begge reseptorer. RHAMM ble identifisert som reseptoren er involvert i celle motilitet under fysiologiske og ondartede prosesser [11,12]. RHAMM kan være assosiert med celleoverflaten eller funksjon intracellulært. RHAMM er involvert i ECM indusert cellesignalisering gjennom å regulere stabiliteten fokale vedheft komplekser [13,14] og aktiverer Ras-, src-, Erk-kinase og protein-kinase-C [15]. I tillegg er den intracellulære form av RHAMM binder seg til mitosetråder [16] og regulerer mitose [17]. I denne forbindelse både overekspresjon og tap av RHAMM, forårsaker perturbasjon av den mitotiske spindel og deretter genetisk ustabilitet [17]. Mens HA er prinsippet ligand av RHAMM, CD44 bindes også forskjellige andre ligander slik som osteopontin, fibronektin eller kollagen [18]. Interessant, i noen tilfeller RHAMM og CD44 synes til og med å samarbeide med hensyn til signalisering [19]. I tillegg har HA blitt tilskrevet en rolle i mediering chemoresistance enten ved å kontrollere diffusjonen av anti-kreftlegemidler [20] og /eller ved å påvirke multimedikamentresistens transportører som medierer effluks av xenobiotika [20,21].
BC har blitt studert tidligere med hensyn til HA og HA-assosierte gener. Tidligere studier viser at spesielt has1 isoenzymet er assosiert med BC progresjon [22,23]. Videre ble urinutskillelse av HA etablert som en indikator på dårlig prognose i BC [24]. Nylig ble igjen has1 mRNA-ekspresjonen forbundet med BC metastase [25]. Et annet viktig funn er at Hyal1 har en ødeleggende rolle i menneskelig BC og at Hyal1 er forbundet med høy grad av BC [26-28]. Dessuten har høy uttrykk for Hyal1 nylig blitt foreslått å forutsi progressiv muskel-invasiv og tilbakevendende BC og å assosiere med spredning og redusert sykdomsspesifikk overlevelse [29]. Alle sammen, de tilgjengelige data om HA i BC punkt til økt syntese av HA hovedsakelig av has1 og degradering til tumor fremme SHA ved Hyal 1. I sin tur, effekter av HA og Sha sannsynligvis omformet gjennom aktivering av HA-reseptorer. I BC viss spleisevarianter av CD44, som CD44V8-10, ble oppregulert og assosiert med dårlig prognose [30,31]. I tillegg har det blitt vist at CD44 kan være involvert i den angiogene respons på HA i BC [22]. Men en fersk analyse viste at CD44v ble oppregulert og CD44s ble nedregulert uten diagnostisk eller prognostisk verdi [30]. RHAMM har blitt beskrevet å være oppregulert, men også uten klar sammenheng med kliniske parametre [25,32]. Fordi det synes sannsynlig at mengden av HA-reseptorer spiller en viktig rolle i transduksjon av HA signalisering og derved i progresjonen av human BC, er målet med denne studien var å undersøke ekspresjon av HA-reseptorer, og har isoenzymer og til oppnå mekanistisk informasjon i en pasient kollektiv preget av . 50% muskel-invasiv BC
Materialer og metoder
tumorprøver
Gene uttrykk ble utført analyse i vevsprøver av 120 pasienter med ulike stadier av overgangsordning celle BC (31xTa, 24xT1, 21xT2, 25xT3, 19xT4), som gjennomgikk kirurgisk behandling for BC på universitetsklinikker i Essen mellom 1990 og 2004. Alle frosne vevsprøver ble kuttet og farget med H E å bekrefte sin svulst innhold. Bare prøver som inneholder ≥70% tumorceller ble utsatt for videre analyse. I tillegg ble 20 tilfeller av parafin innebygd blære karsinom (fire av hver etappe, PTA-pT4) vurdert ved hjelp av immunhistokjemi. Studien protokoll med prosjektnummer 07-3537 ble godkjent av etikkomiteen ved University of DuisburgEssen, Tyskland. Hver pasient gitt et skriftlig informert samtykke til oppbevaring av ferske frosne og Vokstumormateriale og relevante kliniske data.
Det primære endepunktet i studien var kreft-spesi fi c døden. Dødsårsak ble innhentet fra døden serti fi kater. Forsøkspersonene ble fulgt opp fra baseline (dato for operasjon) undersøkelse frem til juli 2009. Normal blæren vev ble tatt fra pasienter som lider av ikke-ondartet sykdom (pyelouretral striktur, nevrogen blæredysfunksjon).
Immunohistochemistry
Immunohistokjemi ble utført på parafin innebygd BC prøver. For farging RHAMM antigenet gjenfinning i citrat-buffer (pH 6,2, inneholdende 0,05% Tween20®) ble utført ved å koke objektglassene ved 95 ° C i 25 minutter. Vevssnitt ble inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer, fortynnet i 2% BSA i PBS (kanin-anti-RHAMM IgG, 1: 100, Amsbio®, Lake Forest, USA); kanin-anti-IgG Ki67, 01:25, (Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, UK). Etter inkubasjon med det primære antistoff ble objektglassene skylt, blokkert i 3% H
2o
2-oppløsning i 5 minutter og inkubert med sekundært antistoff (konjugert med pepperrot-peroksidase) i 1 time ved romtemperatur og skylles igjen tre ganger i 5 minutter. For hver flekker negative kontroll seksjoner med utelatelse av det primære antistoff ble inkludert. Deteksjon ble utført ved anvendelse av 3,3′-diaminobenzidin (DAB). Minst tre representative områder ble fotografert med et Leica® DM2000 system og kvantitativ analyse av fargeintensitet ble utført ved hjelp av ImageJ bildebehandling (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) som tidligere beskrevet [33].
real-time-RT-PCR
mRNA ble isolert fra flash-frossen svulstvev hjelp RNeasy total RNA sett (Qiagen, Hilden, Tyskland). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved fotometrisk måling ved 260/280 nm. 1 pg RNA ble anvendt for cDNA-syntese ved hjelp av QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av Platinum® SYBR® Grønn qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) i 7300 real-time PCR system (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Primer sekvenser av gener av interesse ble anvendt som tidligere beskrevet [14]. Expression nivåer var normalisert til GAPDH uttrykk og beregnes med ΔΔC
) metode.
Cell kultur og knock-down av HA relaterte gener
J82 BC cellene er karakterisert som lav grad celler av høy malignitet [34] og ble oppnådd fra ATCC
® (Manassas, VA, USA) og dyrket i henhold til rutinemessige betingelser i RPMI-medium inneholdende 10% føtalt bovint serum. Å banke ned RHAMM i humane J82 BC celler, kort hårnål RNA (shRNA) sekvens målretting RHAMM (5′-CCGGCGTCTCCTCTATGAAGAACTACTCGAGTAGTTCTTCATAGAGGAGACGTTTTTG-3 «) ble klonet inn i pLKO.1 vektoren ved hjelp av Mission
TM lentiviral shRNA knock-down system (Sigma-Aldrich
®). Egge shRNA ble brukt som kontroll. Fremstilling av vektor, kultur av humane embryoniske nyreceller (HEK-293T), høsting av rekombinante partikler og lentiviral transduksjon av humane J82 urothelial kreftceller ble utført som beskrevet tidligere for knock-down av RHAMM [14]. Syv dager etter lentiviral transduksjon av J82-celler med shRHAMM mRNA-ekspresjonen av RHAMM ble redusert til mindre enn 40% i forhold til J82-celler transdusert med egge kontroller. Deretter ble cellene anvendt for xenograft eksperimenter. Proliferasjon ble deretter bestemt som tidligere beskrevet [14]. I tillegg
in vitro
eksperimenter J82 celler ble behandlet med siRNA til knock-down RHAMM, CD44, has1, has2 og HAS3. For disse eksperimentene følgende siRNA sekvenser (Qiagen, Tyskland) ble benyttet: siRHAMM (Hs_HMMR_9); siHAS1 (Hs_HAS1_4); siHAS2 (Hs_HAS2_4); siHAS3 (Hs-HAS3_7); siCD44 (Hs_CD44_5); kontroll (Ctrl_AllStars_1).
For å hindre HA-syntese i J82 celler 4-metylumbelliferon (4-MU) oppløst i DMSO ble brukt (300 mm). Videre, i enkelte eksperimenter eksogen HA (Healon 5, Abbott) ble anvendt ved en konsentrasjon på 100 ug /ml.
cellesyklusanalyse og apoptose
cellesyklusprogresjon ble analysert etter knock-down av RHAMM og uttrykt som prosentandelen av celler i G0 /G1 og G2-fasen. Kort oppsummering kjerner av J82 celler ble merket med Guava Cell Cycle Reagens (Millipore) i henhold til produsentens protokoll og prøvene ble analysert ved hjelp av en Guava easyCyte Flowcytometer. Apoptose ble bestemt ved prosentandelen av celler i under G1 fase [35]. For PARP immunoblotting polyklonalt PARP-antistoff (1: 1000, Cell Signaling, # 9542) ble brukt som et primært antistoff, og påvisning ble visualisert ved geit-anti-kanin-sekundært antistoff konjugert til IR-Dye 800 (1: 10 000, LI-COR Biosciences) med bruk av Odyssey nær-infrarødt bildebehandlingssystem (LI-COR Biosciences).
Xenotransplantat dyremodell
Mann nu /nu athymiske mus (8-12 uker gamle) ble anvendt for xenografting av J82 celler. 100 ul PBS con-holdende 1×10
6 tumorceller ble applisert subkutant i begge flanker av dyrene. Tumorvekst ble overvåket i 45 uker. I løpet av denne tiden dyrene ble overvåket for overdreven tumorvekst ( 15 mm diameter), sår, merket vekttap ( 20%) eller kliniske tegn på smerte og ubehag, noe som ville vært grunner til å ofre berørte personer. Seks dyr pr gruppe (knock-down og kontroll) mottok cellene 7 dager etter lentiviral knock-down som beskrevet ovenfor. Tumorveksten ble målt med en skyvelære to ganger per uke i 45 dager. Deretter ble dyrene avlivet (cervikal dislokasjon), tumorer ble høstet og fiksert i immunhistokjemi farging. Prøver av lever og lunge ble oppnådd for å søke etter metastatisk tumorvekst ved farging. Musene ble utført i samsvar med de regler og standarder for LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) og Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Den LANUV godkjent forsøkene og bekreftet overholdelse av kvalitetsstandarder. Prosjektet er identifisert med nummer 87-51.04.2010.A149.
Statistisk analyse
genuttrykk data ble analysert enten ved variansanalyse og Bonferroni post-hoc test eller ved Students
t
test som passer. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk signifikans ble tildelt på nivå med
p
0,05. Data som gjelder kliniske resultater fra pasientparametre ble mangler normalfordeling, og ble derfor analysert ved hjelp av den ikke-parametrisk to-halet Wilkoxon rank sum test (Mann-Whitney) for parede gruppesammenligninger. Stage-avhengige korrelasjoner ble beregnet ved hjelp av Pearsons korrelasjon testing. Analyse av total overlevelse og sykdomsspesifikk overlevelse ble utført ved hjelp av både epidemiologiske uni- og multivariate Cox proporsjonal hazard overlevelse regresjonsanalyse og Kaplan-Meier overlevelsessannsynlighet test, IBM SPSS® statistisk analyse programvare (versjon 18.0, Chicago, IL, USA) .
Resultater
Pasient Kjennetegn
i alt 55 pasienter led av overfladisk sykdom (PTA og PT1), ble 65 pasienter diagnostisert med muskel-invasiv sykdom (ujevnt fordelt i 21 pasienter med pT2-sykdom, 25 pT3 og 19 pt4). Svulster var av lav karakter (G1 /G2) i 63 eller høy klasse (G3) i 57 saker. Lymfeknute positivitet var til stede i 23/120 pasienter. 74 pasienter led av primær BC mens 46 pasienter opplevde en tilbakevendende sykdom. 55 pasienter ble behandlet av transurethral reseksjon av TCC, i 65 tilfeller radikal cystektomi ble utført. Røykestatus ble kjent i 83 pasienter, 49 var røykere og 34 var ikke-røykere. Median oppfølgingstid var 34 måneder, maksimal tid på oppfølging var 189 måneder. Median pasientens alder var 65 år (32-87 år). De kliniske data for pasientkarakteristika er vist som en del av tabell 1.
n
RHAMM
P
CD44p
P
HAR en
P
HAS 2
P
HAR 3v1
P
genet exp. valuesgene exp. valuesgene exp. valuesgene exp. valuesgene exp. valuesΣ = 120median (range) median (range) median (range) median (range) median (range) Age≤ 65572,400 (0.00-13.43) 0.7620.320 (0.00-1.92) 0.2530.08 (0.0-7.55) 0.6030.51 (0.01-7.96) 0.10210.62 (0.069-50.82) 0,065 65632.420 (0.06-14.76) 0,260 (0.00-1.24) 0,12 (0.0-103.04) 0,7 (0.0-13.68) 6,465 (0.0-35.65) GenderMale932.340 (0.00-14.76) 0.4940.305 (0.00-1.26) 0.1850.07 ( 0.0-103.04) 0.0720.52 (0.0-8.69) 0.0597.73 (0.0-34.59) 0.608Female272.570 (0.29-13.40) 0,260 (0.00-1.92) 0,235 (0.0-7.55) 1,02 (0.01-13.68) 6,18 (0,12 -50,82) Smokingyes492.265 (0.06-13.40) 0.0930.310 (0.02-1.65) 0.7270.08 (0.0-7.55) 0.4550.695 (0.0-13.68) 0.3158.74 (0.04-35.65) 0.777no342.860 (0.67- 14,76) 0,270 (0.00-1.92) 0,235 (0.0-103.04) 0,66 (0.02-8.69) 9,04 (0.02-50.82) Ta311.460 (0.04-7.01) 0.0270.300 (0.11-1.43) 0.20.02 (0.0-3.14) 0.0660.125 (0.01-4.43) 0.02911.43 (0.46-34.59) 0.392T1242.420 (0.19-10.12) 0.5440.205 (0.06-1.20) 0.9120.06 (0.0-0.99) 0.0520.685 (0.0-13.68) 0,78410 .62 (0.0-30.13) 0.021T2212.890 (0.00-11.86) 0.960.170 (0.02-1.03) 0.2150.21 (0.0-103.04) 0.1370.68 (0.16-8.69) 0.7974.98 (0.77-11.09) 0.613T3252 .710 (0.66-9.18) 0.4010.310 (0.00-1.92) 0.9560.64 (0.01-7.23) 0.0550.81 (0.01-7.96) 0.9395.73 (0.02-50.82) 0.529T4193.815 (0.06-14.76) 0,470 ( 0.02-1.65) 0,125 (0.0-7.55) 1,14 (0.0-2.92) 3,26 (0.12-20.61) Non-inv.551.685 (0.04-10.12) 0.0030.270 (0.06-1.43) 0.7440.02 (0.0-3.14) 0.0010.22 (0.0-13.68) 0.0067.675 (0.0-36.65) 0.001Invasive652.875 (0.00-14.76) 0,310 (0.00-1.92) 0,26 (0.0-103.04) 0,805 (0.0-8.69) 1,98 (0.04-50.82 ) GradeG1201.250 (0.16-3.89) 0.0210.260 (0.16-1.20) 0.3030.02 (0.0-3.14) 0.3570.155 (0.02-13.68) 0.48112.5 (0.28-29.38) 0.279G2432.445 (0,04 til 10,12) 0.1790.250 (0.02-1.43) 0.2240.03 (0.0-103.04) 0.0010.36 (0.01-8.69) 0.0268.875 (0.77-34.59) 0.001G3572.810 (0.00-14.76) 0,330 (0.00-1.92) 0,27 (0.02-7.55) 0,83 (0.0-7.96) 3,925 (0.0-50.82 ) Low grade631.770 (0.04-10.12) 0.0060.260 (0.28-0.46) 0.2430.03 (0.0-103.04) 0.0010.29 (0.01-13.68) 0.01411.09 (0.28-34.59) 0.001High-grade572.850 (0.00-14.76) 0,325 (0.00-1.92) 0,265 (0.0-7.55) 0,82 (0.0-7.96) 4,25 (0,0 -50,82) lymph nodeN0 /Nx972.240 (0.00-14.76) 0.0050.270 (0.00-1.65) 0.5140.07 (0.0-103.04) 0.0150.61 (0.0-13.68) 0.3027.675 (0.0-35.65) 0.046N 233,970 (0.06-11.86) 0,430 (0.00-1.92) 0,405 (0.0-5.62) 0,93 (0.11-7.96) 1,98 (0.04-5.82) Primary742.225 (0.17-11.86) 0.0290.305 (0.00-1.92) 0.9570.125 (0,0 -7,55) 0.5750.645 (0.0-7.96) 0.4648.21 (0.0-50.82) 0.902Recurrent462.760 (0.00-14.76) 0,310 (0.00-1.31) 0,115 (0.0-103.04) 0,55 (0.0-13.68) 6,95 (0.02- 35.65) Tabell 1. RHAMM mRNA uttrykk nivåer er forhøyet i muskel-invasiv tumor etapper, høy grad av svulster, positiv lymfeknute status og tumorresidiv.
mRNA genuttrykk nivåer av HA-assosierte gener (RHAMM, CD44, has1, – 2 og – 3v1) i tumorprøver av 120 pasienter med BC sykdom. Karakterisering er stratifisert i henhold til (A) alder, kjønn og røykestatus og (B) tumor stadium, tumor gradering, lymfeknute status og primære svulster versus tilbakevendende svulst sykdom. Data ble analysert ved hjelp av univariat Cox proporsjonal hazard overlevelse regresjonsanalyse, total n = 120. CSV Last ned CSV
mRNA uttrykk
For å vurdere deres tilknytning til tumorinfiltrasjon og dedifferentiation, has1, has2, HAS3v1, RHAMM og CD44 mRNA uttrykk nivåer ble bestemt i BC vev av 120 pasienter som fold av kontroll vev, ved hjelp av kvantitativ real-time-RT-PCR (tabell 1, figur 1). Som et resultat RHAMM uttrykk nivåer ble forhøyet i infiltrere svulster sammenlignet med ikke-invasive tumorer (RHAMM: ikke-invasive svulster 1,69 fold (Ta + T1), invasive svulster 2,88 ganger (T2-4), p = 0,003). Videre mRNA uttrykk for has1 og has2 var signifikant oppregulert i muskel-invasiv tumor etapper (pT2, pt3 og pt4). I kontrast, ble HAS3v1 forhøyet i alle kreft stadier i forhold til sunn blæren vev, men redusert med økt svulst staging (ikke-invasive svulster 11,26 ganger (Ta + T1) og invasive svulster 4,72 ganger (T2-4), p 0,001; data beregnes som median). Videre CD44 ble ikke oppregulert sammenlignet med kontroller og ikke regulert med hensyn til muskel-invasivitet.
RHAMM, CD44, has1, has2 og HAS3v1 mRNA uttrykk i menneskelig BC vev, vist som boxplot-diagrammer i 25% til 75% intervaller med minimum til maksimum værhår. Real-time-RT-PCR (totalt antall pasienter n = 120, ikke-invasive svulster n = 55, invasive svulster n = 65; Ta n = 31, T1 n = 22, T2 n = 21, T3 n = 25, T4 n = 19;. lavgradig n = 63, høy klasse n = 57)
Lignende resultater ble oppnådd med hensyn til tumorcelle gradering. RHAMM, has1 og has2 mRNA uttrykk nivåer ble signifikant økt i høyere kreft gradings (G1 versus G2-3, RHAMM, 1,77 ganger i lav karakter, 2,81 fold i høy klasse svulster, p = 0,006; has1, 0,02 ganger i lav karakter og 0,26 fold i høy klasse prøver, p 0,001; has2, 0,29 fold i lav karakter og 0,82 fold i høy klasse svulster, p = 0,014). Igjen HAS3v1 mRNA uttrykk nivåer ble sterkt oppregulert i G1 sammenlignet med kontroll men redusert med stor tumor gradering (HAS3, 10,91 fold av kontroll i lav karakter versus 3,93 fold i høy klasse funn, p 0,001). I tillegg viste CD44 ingen forskjeller også med hensyn til tumorceller gradering.
lymfeknutestatus ble også forbundet med betydelige forskjeller i uttrykk nivåer av flere gener. Svulstvev av lymfeknutepositive pasienter viste høyere RHAMM og has1 mRNA uttrykk nivåer sammenlignet med dem med negativ lymfeknutestatus. HAS3v1 ekspresjonsnivåer ble redusert hos pasienter med positiv lymfeknute status (tabell 1 B) sammenlignet med lymfeknute negative prøver. Interessant, RHAMM mRNA uttrykk var den eneste HA-assosierte gen som øker betydelig hos vendende svulster i forhold til primære svulster.
Protein Expression i humane tumorprøver
For ytterligere å karakterisere uttrykk for RHAMM i menneskelig BC immunhistokjemisk farging ble utført i 20 representative tilfeller (4 hver i PTA-pT4). RHAMM farging viste sjelden farget celler i papillær ikke-invasive tumorer (figur 2 A). Normal blærevevet morfologi ble ikke påvirket i disse papillære overfladiske tumorer og RHAMM ble hovedsakelig lokalisert i urothelium. Med voksende muskel invasjon, RHAMM positive fargede tumorceller begynner å danne isolerte cellegrupper i muskelvevet i blæreveggen (figur 2 B) og total fargeintensitet og innhold av RHAMM positive celler vev økes. I dedifferensierte dype invasive og ikke-organ trange svulster i histopatologiske scenen pT4 er RHAMM positive tumorceller overalt fordelt i humane tumorprøver. Overveiende tumorceller, men også i mindre utvide stromale celler uttrykt RHAMM (figur 2C). RHAMM positiv område brøkdel var 3,3% i ikke-invasive svulster (PTA-1) sammenlignet med 21,6% i muskel-invasiv funn (pT2-4, p = 0,03, Figur 2 D). Økningen av RHAMM også korrelert med økende tumorstadium (p = 0,0129, figur 2 E).
(A-C) representant immunhistokjemi farging av RHAMM i parafin-innleiret human BC vev. (A) i nonmuscle-invasive kreft etapper T1 blæren strukturen er fortsatt bevart. (B) i vev med høy stadium svulster de ondartede cellene begynner å proliferere og danne uavhengige cellegruppene som er omgitt av stromale celler (PT2). (C) i ikke-organ begrenset tumorstadier (pT4), blir blæren struktur alvorlig forstyrret ved infiltrering av tumorceller. (D) i området fraksjon av RHAMM positive celler er forhøyet i høyt muskel-invasiv tumorstadier som bestemt ved billedanalyse (ikke-invasiv, n = 8; invasiv n = 12, * p = 0,03, t-test). (E) korrelasjon av RHAMM positive område fraksjon med høyere tumor trinn (n = 4; * p = 0,0129, Pearson-korrelasjon); gjennomsnitt ± SEM.
Sammenheng mellom sykdomsspesifikke overlevelse og Gene Expression
Pasienter med høyt og lavt uttrykk av de respektive genene ble delt i to grupper med medianverdien som kutt av. Resultater av univariate cox analyse er opplistet i tabell 2. Alder, kjønn og røykestatus viste ingen effekt på overlevelse. Som forventet, høy tumorstadium, høy klasse og positiv lymfeknute status viste signifikant negativ korrelasjon med sykdomsspesifikke og total overlevelse. Av notatet, er høye RHAMM og has2 mRNA uttrykk nivåer signifikant assosiert med dårlig sykdomsspesifikke og total overlevelse. I kontrast, høy HAS3v1 mRNA uttrykk korrelert med gunstig total overlevelse og kreftspesifikk overlevelse
tabell 2A.
Variabler
Total overlevelse
sykdomsspesifikk overlevelse
n
HR
95% KI
P
HR
95% KI
P
Age
≤ 65
57
dommeren
dommeren
65
63
1.111
0,715 til 1,726
0,64
1,171
0,701 til 0,959
0,546
Sex Female27ref.ref. Male930.6770.411-1.1150.1260.6430.362-1.1420.132Smoking no49ref.ref. yes340.8970.535-1.5050.6810.6040.322-1.1000.099Table 2B:
Stage
Non-inv. (Ta-T1) 55ref.ref. Invasiv (T2-T4) 653.4162.110-5.529 0.0015.7663.039-10.940 0.001Grade Low-grade63ref.ref. Høy grade573.1241.964-4.969 0.0013.8342.189-6.713 0.001Lymph node status N- /Nx97ref.ref. N + 233.7062.198-6.250 0.0015.0662.871-8.938 0.001Prior Gjentakelse Primer74ref.ref. Recurrent461.3410.848-2.1200.211.2060.705-2.0650.494Table 2C:
RHAMMlow56ref.refhigh562.4991.556-4.013 0,001. 3.3551.887-5.965 0.001CD44plow55ref.ref.high550.8480.533-1.3470.8480.8770.511-1.5040.633HAS 1low49ref.ref.high461.6260.983-2.6880.0581.7310.970-3.0890.063HAS 2low53ref.ref.high531.741.080- 2.8030.0231.7941.033-3.1180.038HAS 3v1low55ref.ref.high540.5650.352-0.9060.0180.5860.340-1.0110.055Table 2. Hos pasienter med muskel-invasiv tumorer dårlig sykdomsspesifikk overlevelse er forbundet med høy RHAMM og høy has2 mRNA uttrykk . nivåer
Overall og sykdomsspesifikk overlevelse hos pasienter med urothelial TCC stratifisert i henhold til (A) pasientens egenskaper: alder, kjønn og røykestatus (B) sykdomsspesifikke kliniske parametere: tumor stadium, tumor gradering, lymfeknute status og primære svulster versus tilbakevendende svulst sykdom (C) HA-assosierte gener (RHAMM, CD44, has1, – to og – 3v1). Univariate Cox proporsjonal fare overlevelse regresjonsanalyse ble benyttet for dataanalyse, total n = 120. Forkortelser: HR – fareforhold, CI – konfidensintervall, ref. – Referent. CSV Last ned CSV
For Kaplan-Meier overlevelsesanalyse pasientpopulasjonen ble delt inn i tre grupper, som består av 40 pasienter hver. Spesielt betydelig økt kreftrelatert dødelighet var assosiert med middels og høy RHAMM mRNA uttrykk (figur 3A). Uttrykk for lave HAS3v1 mRNA nivåer ble også assosiert med dårlig kreftspesifikk overlevelse (Figur 3E). I motsetning til dette høye nivåer av HAS-1, og HAS-2 ekspresjon viste bare en tendens til redusert overlevelse og CD44 var ikke forbundet med forskjeller i sykdomsspesifikke overlevelseskurver (figur 3B-D). For å vurdere om de analyserte genuttrykk nivåer gir uavhengig prognostisk informasjon, ble Cox multivariate fare regresjonsmodeller benyttes. Parametere, påvirker overlevelse i univariate analyser, ble inkludert i multivariate modeller. Viktigere var høye RHAMM mRNA uttrykk nivåer og lymfeknute positivitet funnet å være uavhengig assosiert med økt kreftspesifikk dødelighet risiko (Tabell 3, HR = 2,179, 95% KI 1,182 til 4,017, p = 0,013, og HR = 2,389, 95% KI 1,227 til 4,651, p = 0,010).
pasienten kohorten ble delt inn i tre undergrupper som består av høy, middels og lav uttrykk for enten RHAMM, CD44, has1, -2 eller -3 mRNA (AE). Kaplan-Meier overlevelsessannsynlighet testen ble utført viser betydelig økning i risikoen for kreft-relaterte dødsfall for undergrupper av høy og middels RHAMM mRNA uttrykk nivåer sammenlignet med lav RHAMM mRNA uttrykk (A). Transkripsjonsnivåer av CD44 (B), ble has1 (C) og has2 (D) forbundet med betydelige endringer i sykdomsspesifikk overlevelse. Spesielt, høy HAS3v1 mRNA-ekspresjon var signifikant assosiert med lavere risiko for cancer-spesifikk død sammenlignet med undergruppene med lav og mellomliggende HAS3v1 mRNA ekspresjon (E). Data fra en total på n = 120 pasienter; Analysen ble utført i tre grupper (n = 40 hver) av høy, middels og lav mRNA uttrykk for de respektive genene.
sykdomsspesifikk overlevelse
metastaser overlevelse
variabler <
