Abstract
Homeostase i eukaryote vev er strengt regulert av et intrikat balansen i prosurvival og antisurvival signaler. Svulsten suppressor PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10), en dual-spesifisitet fosfatase, spiller en funksjonell rolle i cellesyklus og apoptose. NF-kB og nedstrøms regulatorer (som VEGF) spiller en sentral rolle i forebygging av apoptose, fremme betennelse og tumorvekst. Derfor tenkte vi å estimere ekspresjon av PTEN, poly-ADP-ribose polymerase (PARP), NF-κBp50, NF-κBp65 og VEGF til å evaluere effekten av tilskudd av fiskeolje på apoptotisk og inflammatorisk signalering i colon carcinoma. Wistar hannrotter i gruppe jeg fikk renset diett mens gruppe II og III mottatt endret kosthold supplert med FO:CO (01:01) FO:CO (2.5:1) hhv. Disse ble ytterligere oppdelt i kontroller som mottar etylendiamin-tetra-eddiksyre-syre og behandlede grupper mottok dimetylhydrazin-dihydroklorid (DMH) /uke i 4 uker. Dyr ofret 48 timer etter siste injeksjon konstituert initieringsfasen og som ofret etter 16 uker utgjorde etter initieringsfasen. Vi har analysert uttrykk for PTEN, NF-κBp50, NF-κBp65 av flowcytometer og kjernefysisk lokalisering av NF-kB ved immunfluorescens. PARP og VEGF ble vurdert ved immunhistokjemi. I initieringsfasen, har dyrene som fikk DMH vist økt% av apoptotiske celler, PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 og VEGF imidlertid i post-initieringsfasen ingen signifikant endring i apoptose med redusert PTEN og økt PARP, NF-κBp50 , NF-κBp65 og VEGF ble observert sammenlignet med kontrolldyrene. På behandling med både prosenter av fiskeolje i begge faser, styrking i% av apoptotiske celler, redusert PTEN, PARP, NF-κBp50, NF-κBp65 og VEGF ble dokumentert med hensyn til DMH behandlet dyr med effekten blir mer utøves med høyere rasjon i post-initieringsfasen. Derfor aktiveres fiskeolje apoptose, reduserer DNA-skade og hemmer inflammatoriske signalering i et dose- og tidsavhengig måte, slik som å inhibere progresjon av kreft i tykktarmen
relasjon:. Kansal S, Bhatnagar A, Agnihotri N (2014) Fish olje Undertrykker cellevekst og metastatisk potensial ved å regulere PTEN og NF-kB signale i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (1): e84627. doi: 10,1371 /journal.pone.0084627
Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA
mottatt: 30 september 2013; Godkjent: 25 november 2013; Publisert: 08.01.2014
Copyright: © 2014 Kansal et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra det indiske rådet for medisinsk forskning (Immuno /18/11/27/2008-ECD-i). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidemiologiske rapporter har vist at forekomsten av kreft er økende over hele verden [1]. Kreft er en sykdom hvor det er en deregulering av celleproliferasjon og celledød. I kreftceller, endogene signaltransduksjonsveier få forstyrret å omdirigere de cellulære avgjørelser fra differensiering og apoptose til spredning, og senere invasjonen [2]. Fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalveien har en avgjørende rolle i å fremme celleoverlevelse ved å hemme apoptose. PI3K omdanner plasmamembranen lipid fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP
2), fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfat (PIP
3), som deretter rekrutterer proteiner som inneholder en pleckstrin homologi (PH) domene til cellemembraner [3] som phosphoinositol avhengig kinase-1 (PDK1) og Akt. Aktivert Akt er den dominerende og viktig mediator for regulering av apoptose og proliferasjon ved å målrette forskjellige nedstrøms substrater: IkB-kinase, Bcl-2, cytokrom c og andre [4], [5]. Aktiviteten av PI3K /Akt veien er negativt regulert av fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN). PTEN dephosphorylates den 3’OH gruppen og omdanner PIP
3 inn i PIP
2, som fører til aktivering av apoptose og dermed fungerer som en tumor suppressor [6]. har vist rapportene som uttrykk for
PTEN
har blitt transcriptionally trykt gjennom aktivering av NF-kB. NF-kB består av transaktivering subenhet Rela /p65 og DNA-bindende subenheter P50 og P52, som er bearbeidet fra forløper-s p105 og p100 henholdsvis [7]. NF-kB er sekvestrert i cytoplasma av inhibitoren IkB for å hindre at den transkripsjonelle aktivering i ikke-stimulerte betingelser. De inflammatoriske cytokiner føre til fosforylering av IkB, som i sin tur frigjør NF-kB, som senere translocates inn i kjernen og påvirke ekspresjonen av målgener som har en nøkkelrolle i hemming av apoptose, fremming av tumorvekst, og aktivering av inflammatoriske responser hvilken ytterligere fremmer metastase ved å øke ekspresjonen av vasucular endotelial vekstfaktor (VEGF) [8]. Den kovalent modifisering av proteiner ved Poly (ADP-ribosyl) asjon er en øyeblikkelig og dramatisk biokjemisk respons til DNA-skade. Det er en allestedsnærværende proteinmodifisering som finnes i pattedyrceller som modulerer mange cellulære responser, inkludert DNA-reparasjon. Poly-ADP-ribose polymerase (PARP) katalyserer polymeriseringen av ADP-ribose-enheter fra donor NAD
+ molekyler på target-proteiner, hvilket resulterer i festing av lineære eller forgrenede polymerer [9]. PARP oppviser pleiotropiske cellulære funksjoner som strekker seg fra vedlikehold av genomisk stabilitet og kromatin ombygging til regulering av celledød, for derved å utføre de nevnte PARP-homologe som et lovende mål i kreftterapi [10].
Epidemiologiske rapporter har vist at kolorektal kreft ( CRC) er den tredje vanligste kreftformen hos menn (etter prostatakreft og lungekreft) og kvinner (etter brystkreft og lungekreft) [1]. Eksperimentelle undersøkelser har vist at en rekke faktorer er forbundet med utvikling av CRC [11]. De tidligere forsøk utført i vårt laboratorium har vist at administreringen av fiskeolje (n-3 PUFA) /maisolje (n-6 PUFA) i 2,5 /1-forhold har en bedre effekt sammenlignet med 1/1 for kjemoprevensjon av eksperimentelt indusert tykktarmskreft [12]. En annen studie har vist at Kjemopreventivt handling av forskjellige forhold av fiskeolje og maisolje kan bli formidlet gjennom Ras-signalreaksjonsveien [13]. En av en annen studie fra vårt laboratorium har vist at fiskeolje (FO) og maisolje (CO) i 2.5:1 forholdet forandret mitokondriemembranparametre, ROS, og Ca
2+ på en slik måte for derved å øke apoptose i begge faser, mens FO:CO i forholdet 01:01 forbedret apoptose bare i post-initieringsfasen [14]. Det har tidligere blitt vist at EPA og DHA økt nivå av PTEN som i sin tur inhiberer transkripsjon av anti-apoptotiske gener, derav demonstrerte de gunstige effektene av fiskeolje på brysttumorcellevekst [15]. Derfor denne studien ble gjennomført for å forstå hvilken rolle ulike prosenter av fiskeolje og maisolje på apoptotiske trasé og metastatisk potensial mediert av PTEN og NF-kB i eksperimentelt indusert tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Kjemi
N, N «
-Dimethylhydrazine dihydroklorid (DMH), paraformaledhyde (PFA), propidiumjodid (PI), Hoechst 33342 (H342) og bovint serumalbumin (BSA ) ble oppnådd fra Sigma Chemical Company, St. Louis, USA. Den monoklonalt antistoff mot PTEN ble anskaffet fra genescript, Piscataway, NJ, USA. De monoklonale antistoffer mot PARP, VEGF, NF-kB p50 og NF-kB p65 ble kjøpt fra henholdsvis Santacruz, CA, USA og BD Biosciences, MD, USA. Fluorescein (FITC) -konjugert geit anti-mus IgG
1 ble kjøpt fra Bangalore Genei, Bangalore, India. Maxepa fiskeolje [inneholdende 180 mg Eikosapentaensyre (EPA) og 120 mg dokosaheksaensyre (DHA) /ml] ble erholdt fra Merck Chemicals Limited, Goa, India og maisolje som inneholdt 58,8% linolsyre 26,4% oljesyre, 1.3% linolensyre og 12,8% mettet fettsyre ble anskaffet fra Sigma Chemical Company, St. Louis, USA. Mineralet blanding (Agrimin) ble hentet fra Virbac Dyrehelse India Pvt. Ltd., Mumbai, India. Alle andre kjemikalier som brukes i studien var av analytisk kvalitet.
Dyr og kosthold
Wistar hannrotter som veide 100-200 g ble hentet fra og ligger i Central Animal House, Panjab University, Chandigarh . De eksperimentelle protokollene ble godkjent av «Institutional Animal Ethics Committee, Panjab University, Chandigarh» (Ref. Nr. 1-12 /IAEC 3/9/2009) og gjennomført i henhold til retningslinjene for «Indian National Science Academy» for bruk og behandling av forsøksdyr. Dyrene ble holdt i bur polypropylen i dyrehuset og ble akklimatisert før de blir brukt i den eksperimentelle undersøkelsen. Vann ble gitt
ad libitum
. Etter en uke med akklimatisering, ble dyrene tilfeldig delt inn i forskjellige grupper og ble matet eksperimentell diett i fire uker. Sammensetningen av eksperimentelle kosthold har blitt gitt i tabell 1. dietter ble utarbeidet på grunnlag av American Institute of Nutrition standard referanse diett AIN-76A [16]. Sammensetningen av alle eksperimentelle dietter ble justert slik at dyr i alle gruppene skulle forbruke like mye kalorier [12].
Experimental Design
Den eksperimentelle design er representert i figur . 1. Mann Wistar rotter (N = 96) ble likt fordelt i følgende eksperimentelle grupper:
De isolerte colonocytes ble inkubert med Hoechst 342 (H342) fargestoff og PI. Photomicrographs ble anskaffet ved hjelp fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80
i
) A- kontrollgruppe, B- DMH behandlet, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. Mørk blå farge representerer de normale levende celler, svak blå eller rosa representerer apoptotiske celler (Forstørrelse 400 ×). E) Grafisk fremstilling av% av levende og apoptotiske celler i ulike grupper. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. for n = 4 (
** p 0,01 wrt kontroll,
### p 0,001 wrt DMH).
kontrollgruppen) Z – Disse dyrene mottok renset diett og et ukentlig intraperitoneal injeksjon av 1 mM etylendiamintetra-eddiksyre (EDTA), pH 6,5, i en periode på 4 uker
DMH behandles.
– dyrene i denne gruppen fikk renset diett sammen med en ukentlig intraperitoneal injeksjon av DMH (20 mg /kg kroppsvekt) i 4 uker.
FO + CO (01:01) + EDTA
dyrene mottok en modifisert diett supplert med 01:01 forhold av FO og CO. en ukentlig intraperitoneal injeksjon av EDTA ble også gitt for en periode på 4 uker.
FO + CO (01:01) + DMH
en modifisert diett supplert med 01:01 forhold av FO og CO ble gitt til dyrene i denne gruppen og et ukentlig intraperitoneal injeksjon av DMH i en periode på 4 uker.
FO + CO (2,5 :1) + EDTA
dyrene i denne gruppen ble gitt modifisert diett supplert med FO + CO i forholdet 2.5:1 og mottok en ukentlig intraperitoneal injeksjon av EDTA i en periode på 4 uker.
FO + CO (2.5:1) + DMH, en modifisert diett supplert med FO + CO i et forhold på 2.5:1 ble gitt til dyrene i denne gruppen og et ukentlig intraperitoneal injeksjon av DMH i en periode på 4 uker.
Hver gruppe ble videre inndelt etter studier om oppstart og etter initieringsfasen og dyrene ble likt fordelt mellom de to fasene. Dyrene som ble avlivet 48 timer etter den siste EDTA /DMH injeksjoner utgjøres initieringsfasen [17], og dyrene holdes i 12 uker etter behandlingsregimet utgjorde den etter initieringsfasen studien. Alle dyrene ble avlivet ved cervikal dislokasjon.
Isolering av colonocytes
colonocytes ble isolert ved fremgangsmåten i Sanders [18]. Hele kolon ble kuttet i lengderetningen for å eksponere hulrommet og anbringes i varm Ca
2 + og Mg
2+ fri-Hanks bufret saltoppløsning (HBSS), 30 mmol /l EDTA, 5 mmol /l ditiotreitol (DTT) , 0,1% BSA (bovint serumalbumin). Etter en 15 min inkubering risting ved 37 ° C, ble det mukosale side forsiktig skrapet for å fjerne de intakte krypter. De isolerte celler ble deretter sentrifugert ved 2200 opm og vasket to ganger i varm HBSS inneholdende 1,3 mM CaCl
2, 1 mM MgSO
4 og 0,1% BSA. Cellene ble telt ved hjelp av en hemocytometer og deres levedyktighet ble sjekket av trypanblått eksklusjon metoden [19].
Estimering av levende og apoptotiske celler
Prosentandelen av levende og apoptotiske celler ble vurdert ved immunfluorescens . Isolerte colonocytes (1-2 x 10
6) ble resuspendert i 1 ml PBS og inkubert med 10 ul av Hoechst 342 (H342) fargestoff (1 mM) ved 37 ° C i 1 time. Cellene ble vasket to ganger og resuspendert i PBS. Deretter ble cellene inkubert med 10 ul av PI (1 mg /ml) ved 37 ° C i 10 min. Cellene ble igjen vasket og resuspendert i PBS. Photomicrographs ble anskaffet ved hjelp av fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80
i
) og analysert ved hjelp av Northern Eclipse bilde Elements-D (NIS-D) programvare. Photomicrographs av celler med H342 og PI ble slått sammen. I sammenslåtte photomicrographs, celler med rosa farge celler og celler med mørk blå farge på periferien representerer apoptotiske celler som har kondensert /fragmentert DNA mens besvimte blå over hele ble ansett for å være de normale cellene.
Analyse av PTEN, NF- kB-p50 og NF-kB p65 ved flowcytometer
De intracellulære proteiner ble anslått av flowcytometer. De colonocytes ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur. Etter vasking to ganger med PBS, ble colonocytes permeabilisert med 100% iskald metanol (dråpevis tilsatt) og etterlatt i 15 minutter ved -20 ° C. Cellene ble vasket en gang i kald PBS to ganger. Omtrent 1 x 10
6-celler ble tilsatt til en FACS rør, resuspendert i saponin-buffer (PBS inneholdende 0,1% saponin og 2% BSA) og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C. De forskjellige porsjoner av colonocytes ble så inkubert med fortynnet PTEN, NF-kB p50 og NF-kB p65 (1:100) monoklonale antistoffer i 30 minutter ved romtemperatur og deretter vasket en gang med saponin buffer. De colonocytes ble deretter inkubert med fortynnet FITC-konjugert sekundært antistoff i 45 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket en gang med saponin buffer og deretter med PBS. Cellene ble resuspendert i PBS. Oppkjøpet fra hver prøve ble utført på FACS Canto (BD Biosciences, USA) og de innsamlede dataene ble analysert ved hjelp av BD FACS Diva programvare. De etterfølgende kontroller for PTEN, NF-kB p50 og NF-kB p65 ble også kjøre samtidig. Resultatene av PTEN, NF-kB p50 og NF-kB p65 var representert som gjennomsnittet av nettet MFI (MFI for celler behandlet med Ab – MFI for celler bare)
Lokalisering av NF-kB p50 og NF. -κB p65 ved immunfluorescens
De isolerte faste colonocytes ble vasket med iskald PBS to ganger. Cellene ble lufttørket på glassplater (VWR Scientific, Thane, Maharashtra, India) og lov til å følge i 10 minutter ved romtemperatur. Cellene ble permeabilisert med 0,5% Triton X-100 og ikke-spesifikk binding ble blokkert ved bruk av 2% (w /v) BSA i PBS i 30 minutter ved romtemperatur, før inkubering med fortynnet monoklonalt antistoff mot NF-kB P50 (1 :50) og NF-kB p65 (01:50) i 1 time ved romtemperatur. Prøvene ble vasket med PBS, inkubert med fortynnet FITC-konjugert anti-mus-IgG
1 i 2 timer ved værelsestemperatur og igjen vasket med PBS. Snittene ble motfarget med PI i 10 min ved romtemperatur og deretter vasket med PBS. Seksjonene ble montert og forseglet med en klar spiker maling. Bildene ble anskaffet ved hjelp av en fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80
i
) og analysert med Nord Eclipse bilde Elements-D (NIS-D) programvare. Photomicrographs av celler med NF-kB p50 /p65 og PI ble slått sammen. Etter sammenslåing av mikrofotografiene, indikerer grønn farge ekspresjonen av NF-kB P50 /p65 i cytoplasma av cellen, rød farge representerer nukleær farging med PI og gul farge angir lokalisering av NF-kB P50 /p65 i kjernen av cellen .
Immunhistokjemisk estimering av VEGF og PARP
seksjoner vev (2-3 mikrometer tykk) ble montert på poly-L-lysin belagt lysbilder. Glassene ble oppvarmet ved 65 ° C før deparaffinization i xylen. Glassene ble rehydrert med seriealkoholløsninger (100%, 90%, 70%, 50%, 30%). Endogen peroksidaseaktivitet ble stoppet ved inkubering av lysbildene med 3% H
2o
2 (i metanol) i 20 minutter ved 4 ° C. Seksjonene ble blokkert ved bruk av 2% BSA i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Antigen gjenfinning ble gjort med gjenfinning buffer (pH 6,0) ved hjelp av mikrobølge (varmes i mikrobølgeovn 5 min for VEGF og 5 min x 2 for PARP). Platene ble tillatt å avkjøle i 20 minutter. Etter antigen henting, ble delene inkubert med VEGF (1:100) og PARP (01:50) antistoffer for natten ved 4 ° C i et fuktighetskammer. Objektglassene ble vasket i PBS og etterfulgt av inkubasjon av 2 timer med HRP-konjugert antimus-antistoff (1:100) for VEGF og HRP-konjugert anti kanin-antistoff (1:100) for PARP ved 37 ° C i et fuktig kammer. Skinnene ble visualisert ved hjelp av DAB og H
2o
2. Seksjonene ble deretter kontra med hematoksylin i 2 min, etterfulgt av skylling i avionisert H
2o. Skinnene var dehydrert og montert med DPX for analyse. Bilder ble kjøpt og analysert ved hjelp av Nikon Eclipse 80
i
mikroskop (Japan) og Nord Eclipse bilde Elements-D (NIS-D) programvare.
Statistical Analysis
resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD Forskjellene mellom gruppene ble vurdert av ANOVA etter konstatere normalitet av Q-Q plot. Programvaren som brukes for statistisk analyse var SPSS 18.0 programvarepakke for Windows. Den statistiske signifikans ble bestemt ved enveis ANOVA med Bonferroni multippel sammenligning post hoc tester, og forskjellene ble betraktet som signifikant for p. 0,05
Resultater
Effekt av tilskudd av fiskeolje på apoptose /nekrose i den eksperimentelt indusert koloncancer
i den foreliggende undersøkelse, ble% av apoptotiske celler beregnes ved hjelp av immunfluorescens, og resultatene er gjengitt på fig. 1 og 2. I initieringsfasen, har dyrene som fikk DMH vist en betydelig økning i% av apoptotiske celler sammenlignet med kontrolldyrene (figur 1). Imidlertid, ved behandling med FO + CO (01:01) + DMH og FO + CO (2.5:1) + DMH, en betydelig reduksjon i% av levende celler, og en betydelig forsterkning i% av apoptotiske celler ble observert sammenlignet med DMH behandlede dyr. Det har blitt observert at i post-initieringsfasen, ved behandling med DMH, var det ingen signifikant endring i% av apoptotiske celler sammenlignet med kontrolldyrene (figur 2). På mottar begge prosenter, av fiskeolje og maisolje, har det blitt demonstrert at en betydelig nedgang i% av levende celler og en signifikant forbedring i% av apoptotiske celler sammenlignet med DMH-behandlede dyr.
Det isolerte colonocytes ble inkubert med Hoechst 342 (H342) fargestoff og PI. Photomicrographs ble anskaffet ved hjelp fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse 80
i
) A- kontrollgruppe, B- DMH behandlet, C) FO + CO (01:01) + DMH, D) FO + CO (2.5:1 ) + DMH. Mørk blå farge representerer de normale levende celler, svak blå eller rosa representerer apoptotiske celler (Forstørrelse 400 ×). E) Grafisk fremstilling av% av levende og apoptotiske celler i ulike grupper. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. for n = 4 (
### p 0,001 wrt DMH).
Endring i uttrykket av PTEN på behandling med ulike prosenter av fiskeolje
Etter å ha vurdert endringer i% av apoptotiske celler på å motta disse flerumettede fettsyrer, vi så tenkte å undersøke uttrykket av regulator av apoptose. Svulsten suppressor PTEN (fosfatase og tensin homolog) er den viktigste regulatoren apoptotiske signalveien. Derfor, i denne studien, ble ekspresjonen av PTEN beregnet og resultatene av PTEN er angitt i tabell 1. I initiering fasen har flowcytometric dataene vist at ekspresjon av PTEN ble hevet betydelig i DMH-behandlede dyr sammenlignet med kontrolldyrene, mens videre behandling av dyrene med forskjellige forhold mellom FO + CO, ble PTEN økt betraktelig i forhold til kontrolldyr, men økningen var mindre i forhold til DMH-behandlede dyr. De etter Initieringsfasen data har vist at PTEN uttrykket ble redusert betydelig på behandling med DMH med hensyn til å kontrollere dyr. Imidlertid, ved behandling med begge prosenter av fiskeolje og maisolje, ble PTEN uttrykket økt betydelig. Økningen var mer betydelig med FO + CO (2.5:1) + DMH i post-initieringsfasen.
Effekt av tilskudd av fiskeolje og maisolje på PARP aktivitet
PARP er et rikelig DNA-bindende enzym som registrerer DNA trådbrudd. PARP-enzymet spiller en viktig rolle i forskjellige cellulære funksjoner, for derved å gjøre PARP som et lovende mål i kreftterapi [10]. Derfor, i denne studien, aktiviteten av PARP ble analysert for å undersøke effekten av forskjellige forhold av fiskeolje og maisolje på DNA-reparasjonsenzym. Resultatene av immunhistokjemisk farging av PARP er vist i fig. 3. kolon mukosa av kontrolldyrene har vist meget moderat eller svak ekspresjon av PARP. Ved behandling med DMH, ble PARP ekspresjon utvidet i begge fasene, sammenlignet med kontrolldyrene. Cellene var sterkt positive for PARP i etter initieringsfasen i forhold til aktiveringsfasen. Men på mottar de ulike prosenter av fiskeolje og maisolje, ble uttrykket av PARP redusert i forhold til DMH behandlede dyr med effekten blir uttalt med FO + CO (2.5:1) + DMH i post-initieringsfasen.
Immunhistokjemisk farging av PARP i formalinfiksert parafin integrerte deler av tykktarmen vev. A-D viser de representative photomicrographs av initieringsfasen og E-H representerer etter initieringsfasen ( «pil» skildrer uttrykk for PARP). (A og E) Kontroll, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .
nedregulering av NF-kB subenheter på tilskudd av fiskeolje
aktivering av NF-kB veien er en viktig begivenhet i betennelse-indusert tumorvekst og progresjon [20]. NF-kB er en allestedsnærværende transcriptional faktor som spiller en sentral rolle i celleoverlevelse og celledød [21]. NF-kB er til stede i cytosol i en bundet form med IicB. Fosforylering av serin rester av IKB proteiner ved IKB kinaser (IKKS), retter seg mot det IKB for proteasomal degradering. De frie NF-kB subenheter (P50 og P65) transporteres til kjernen som en dimer og rettet mot de promotere som fører til aktivering av gener som er involvert i cellevekst, invasjon og celledød. NF-kB er negativt regulert av PTEN og ytterligere mål i en rekke anti-apoptotiske gener slik som Bcl-2 og Bcl-XL [15]. Derfor, etter evaluering uttrykk for PTEN, vi så tenkte å analysere uttrykket samt lokalisering av begge subenheter av NF-kB i eksperimentelt indusert tykktarmskreft.
Expression og lokalisering av NF-kB p65
ekspresjon av NF-kB p65 har blitt målt ved flowcytometer og lokalisering ble undersøkt ved hjelp av fluorescens mikroskop. Strømnings-cytometrisk resultatene av initieringsfasen vist at ekspresjon av NF-kB p65 har blitt betydelig øket ved behandling med DMH i forhold til kontrolldyrene. På behandling med FO + CO (01:01) + DMH, NF-kB p65 ble ytterligere utvidet betydelig imidlertid på mottar FO + CO (2.5:1) + DMH, uttrykk for NF-kB p65 ble betydelig redusert i forhold til DMH behandlede dyr (tabell 2). Den post-Initieringsfasen data har vist at ved å gi DMH, ble NF-kB p65 ekspresjon betydelig øket sammenlignet med kontrolldyrene. På behandling med både prosenter av FO + CO + DMH ble uttrykket betydelig redusert i forhold til DMH behandlede gruppen. Nedgangen var mer betydelig med FO + CO (2.5:1) + DMH i forhold til FO + CO (01:01) + DMH.
Som de aktiverte NF-kB subenheter translocate fra cytoplasma til kjerne, og derfor i den foreliggende undersøkelse, nukleær lokalisering av NF-kB ble også evaluert. Resultatene av lokalisering av NF-kB p65 er oppsummert i fig. 4. immunfluorescens data har vist at ved behandling med DMH, ble% av celler som har NF-kB p65 i kjernen og cytoplasmaet økt betydelig i begge faser sammenlignet med kontrolldyrene (figur 4B 0,001) i begge faser sammenlignet med kontrolldyr (tabell 3). Imidlertid, ved behandling med FO + CO (01:01) + DMH og FO + CO (2.5:1) + DMH, ekspresjonen av NF-kB p50 ble redusert signifikant (p 0,001) sammenlignet med DMH-behandlede dyr i både igangsetting samt post-initieringsfasen.
i denne studien, lokalisering av NF-kB p50 fra cytoplasma til kjernen ble gjort ved å dobbeltmerking. Immunfluorescens data har vist at behandling med DMH, den% av celler med NF-kB p50
+ i kjernen og cytoplasma ble øket betydelig i begge fasene, sammenlignet med kontrolldyrene (figur 5B & Co.. 5F). Imidlertid, ved behandling med forskjellige forhold mellom fisk olje og maisolje, ble lokalisering av NF-kB P50 fra cytoplasma til kjernen falt med effekten blir mer uttalt med FO + CO (2.5:1) + DMH i den post-initiering fasen.
De isolerte faste colonocytes ble permeabilized og inkubert med monoklonalt antistoff mot NF-kB p65 og tilhørende FITC konjugert sekundært antistoff seksjonene ble kontra med PI å visualisere kjernefysiske lokalisering. Rød fluorescens representerer nukleær farging ved PI med ingen ekspresjon av NF-kB (angitt med «stiplet pil») og grønn fluorescens indikerer ekspresjonen av NF-kB p65. Gul farge angir lokalisering av NF-kB p65 fra cytoplasma til kjernen (representert ved pilen «»). A-D viser aktiveringsfasen og E-H representerer det etter initieringsfasen. (A og E) Kontroll, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .
Effekt av fiskeolje på VEGF i både initiering og post-initieringsfasen av tykktarmskreft
Angiogenese er en viktig del av normal embryoutvikling, som krever komplekse interaksjoner mellom endotelceller og celler i omkringliggende vev. Signalering av VEGF og deres reseptorer VEGFRs spiller sentrale roller i disse inter [22]. VEGF binder seg til disse reseptorene stimulerer og endotelcelle proliferasjon, migrering og overlevelse. Derfor i den foreliggende undersøkelse, ble effekten av tilskudd av fiskeolje og maisolje på ekspresjonen av VEGF estimert. Resultatene av immunhistokjemisk farging av VEGF for denne studien er vist i fig. 6. kolon mukosa av kontrolldyr har vist en svak ekspresjon av VEGF i endotelcellene. Ved behandling med DMH, ble ekspresjonen av VEGF forhøyet i endotelcellene i tykktarmen i begge fasene, sammenlignet med kontrolldyrene. Økningen i ekspresjon av VEGF var mer uttalt i den post-initieringsfasen i forhold til aktiveringsfasen. Ved mottak av FO + CO (01:01) + DMH, var det ingen signifikant forskjell i ekspresjonen av VEGF i initieringsfasen sammenlignet med DMH behandlede dyr, men behandling med FO + CO (01:01) + DMH i post-aktiveringsfasen, ble ekspresjonen av VEGF redusert. Ved mottak FO + CO (2.5:1) + DMH ble uttrykket av VEGF redusert i begge fasene i forhold til DMH behandlet dyr.
uttrykk for VEGF ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi på formalinfiksert parafin innebygd seksjoner av kolon vev. A-D viser de representative photomicrographs av initieringsfasen og E-H representerer etter initieringsfasen (→ skildrer uttrykk for VEGF). (A og E) Kontroll, (B og F) DMH behandlet, (C og G) FO + CO (01:01) + DMH, (D og H) FO + CO (2.5:1) + DMH (forstørrelse 400X) .
diskusjon
det har blitt demonstrert ved de tidligere rapporter om at DHA og EPA, to aktive komponenter av fiskeolje, hindre transkripsjonen av NF-kB avhengige gener og øker ekspresjonen av PTEN i bukspyttkjertelen, bryst og tykktarm kreft celler. De tidligere studier utført i vårt laboratorium har vist at FO + CO (2.5:1) har bedre Kjemopreventivt effektivitet sammenlignet med FO + CO (01:01) i eksperimentelt indusert koloncancer [12]. Derfor er denne studien ble utført for å forstå mekanismen for Kjemopreventivt virkning av disse diett PUFA på de apoptotiske reaksjonsveier. Resultatene av vår undersøkelse har vist at tilsetning av fiskeolje og maisolje i dietten utøver differensial Kjemopreventivt effekt ved økning av apoptose som kan være mediert gjennom endringer i ekspresjon av PTEN og NF-kB-signalering.
A viktig regulator av apoptose er PTEN veien. PTEN antagoniserer PI3K-aktivitet ved å konvertere PIP3 tilbake til PIP2, og derved redusere den cellulære pool av PIP3 [23], [24]. Det tap av funksjon av tumorsuppressorgen PTEN, er den vanligste genetiske avvik i kreft [25].
