Abstract
leverkreft rekkene i forekomst og dødelighet blant topp fem kreft på verdensbasis. Samler interesser har vært fokusert på å utvikle nye strategier for leverkreft behandling. Vi har tidligere vist at Dihydroartemisinin (DHA) viste antitumoraktivitet mot leverkreft. I denne studien viste vi at histondeacetylase hemmere (HDACi) betydelig utvidet den antineoplastiske effekt av DHA via økt apoptose
in vitro Hotell og
in vivo
. Inhibering av ERK-fosforylering bidrar til DHA-indusert apoptose, på grunn av det faktum at inhibitoren av ERK-fosforylering (PD98059) øket DHA-indusert apoptose. Sammenlignet med DHA alene, den kombinerte behandlingen med DHA og HDACi redusert mitokondriene membranpotensiale, utgitt cytokrom
c
i cytoplasma, økt p53 og Bak, redusert Mcl-en og p-ERK, aktivert caspase 3 og PARP, og induserte apoptotiske celler. Videre viste vi at HDACi forbehandling tilrettelagt DHA-indusert apoptose. I Hep G2-xenograft bærer nakne mus, intraperitoneal injeksjon av DHA og Saha resulterte i signifikant inhibering av xenograft tumorer. Resultater av TUNEL og H E farging viste mer apoptose indusert av kombinert behandling. Immunohistokjemi data viste aktivering av PARP, og reduksjon av Ki-67, p-ERK og Mcl-1. Til sammen våre data tyder på at kombinasjonen av HDACi og DHA har en antitumor effekt på leverkreft, og denne kombinasjonen behandling bør vurderes som en lovende strategi for kjemoterapi
Citation. Zhang CZ, Pan Y, Cao Y, Lai PBS, Liu L, Chen GG, et al. (2012) histondeacetylase hemmere Tilrettelegge Dihydroartemisinin apoptose i leverkreft
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 7 (6): e39870. doi: 10,1371 /journal.pone.0039870
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 10 april 2012; Godkjent: 28 mai 2012; Publisert: 28 juni 2012
Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (nr 81172345 og nr 30973506). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Leverkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den femte vanligste kreftformen i verden og den tredje vanligste dødsårsaken av kreft [1]. Mer enn 75% av nye tilfeller diagnostisert i utviklingsland; imidlertid forekomsten øker i økonomisk utviklede regioner, inkludert Japan, Vest-Europa, og USA [2], [3]. Selv kirurgisk reseksjon og levertransplantasjon er de to viktigste terapeutiske alternativer med kurativt potensial, er kirurgi bare mulig for ca 20% av leverkreft fordi pasienter er oftest diagnostiseres på et avansert stadium [4], [5]. Til dags dato, er kjemoterapi for leverkreft ikke tilfredsstillende og langsiktig overlevelse av leveren kreftpasienter er fortsatt dårlig [4], [6]. Derfor, utvikle nye og effektive terapeutiske strategier for leverkreft er av stor nød og betydning.
histondeacetylase hemmere (HDACi) er for tiden et stort fokus på interesse som antineoplastiske midler [7], [8]. HDACi er en klasse av midler som virker via blokkering av histon deacetylering, for derved å modifisere kromatinstruktur og gentranskripsjon [9]. Spesielt HDACi hemme acetylering av lysinrester i histon N-terminal hale som resulterer i å løsne foreningen av histoner med DNA, for derved å tillate ekspresjon av gener som er knyttet til tumor suppresjon [10]. Forstå sammenhengen mellom HDAC aktiviteter og ulike kreftformer ført mange forskere til å vurdere HDAC hemmere som potente stoffer som kan forstyrre kreftcelle spredning og /eller overlevelse gjennom modulering av cellesyklusprogresjon, differensiering, eller ved å fremme celledød. For eksempel, Kim et al. rapporterte at CG0006 eksponering i brystkreftceller resulterte i celledød via nedregule HDAC6 [11]. Bommi et al. viste at natriumbutyrat indusert apoptose i kreftceller ved nedregulering av transkripsjonen BMI1 [12].
Selv om HDACi alene kan være klinisk nyttige, vil de sannsynligvis være av verdi i kombinasjon med andre antitumormidler. Saha har blitt godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for behandling av kutan T-celle lymfom og andre HDACi nå gjennomgår fase I /II kliniske studier som monoterapi eller i kombinasjon med andre legemidler [13], [14 ]. Samler rapportene er indikert synergistisk effekt på dødelighet av kombinasjon av HDACi og andre kjemoterapeutika. Kretzner et al. viste at kombinasjonen av HDACi og Aki forbedret lymfom celledød gjennom undertrykkelse av c-myc, hTERT, og mikroRNA nivåer [15]. Nguyen et al. rapportert at samtidig bruk av HDACi synergistisk økt KW-2449 dødelighet som følge av inaktivering av Bcr /Abl [16]. Det siste, en fase II studie viste at behandling av vorinostat kombinert med tamoxifen signifikant forlenget overlevelse av pasienter med brystkreft [17]. Imidlertid har en slik synergistisk effekt sjelden påvist i leverkreft.
Nylig har vi rapportert at Dihydroartemisinin (DHA), den viktigste aktive metabolitten av artemisinin derivater, viste anticancer aktivitet mot leverkreft [18]. I foreliggende studie viste vi at (a) DHA-indusert apoptose via downregulating ERK-fosforylering, noe som ble ytterligere bekreftet ved de data som hemmer av ERK-fosforylering (PD98059) øket DHA-indusert apoptose, (b) HDACi
in vitro
bemerkelsesverdig forbedret DHA-indusert celledød, som følger med reduksjon av mitokondrier membran potensial, frigjøring av cytokrom
c
i cytoplasma, økning av p53 og Bak, og reduksjoner av Mcl-en og p-ERK, ( c) en kombinasjon av HDACi og DHA
in vivo
vesentlig stanset veksten av leverkreft tumor xenograft. Våre data kan foreslå en kombinasjon av HDACi og DHA som en lovende strategi for leverkreft kjemoterapi.
Materialer og Metoder
Cell kultur
Menneskelig leverkreft cellelinjer (Hep G2 og PLC /PRF /5) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 mg /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 og 95% luft ved 37 ° C.
Antistoffer og reagenser
Antistoffer for Mcl- 1, PARP, Bak, og Actin ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Antistoffer for kaspase 3, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, og p-JNK ble levert av cellesignalisering (Danvers, MA). Dihydroartemisinin (DHA, oppløst i DMSO), natriumbutyrat (NaB, oppløst i H
2o), suberoylanilide hydroksaminsyre (Saha, oppløst i DMSO) og p-ERK-inhibitor (PD98059, oppløst i DMSO) ble anskaffet fra Sigma ( St. Louis, MO).
MTT
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazo-Lium-bromid (MTT) analyse. I korthet, 8 x 10
3-celler ble sådd på 96-brønners plater i 24 timer, etterfulgt av inkubasjon med forskjellige doser av DHA for den angitte tid. Etter tilsetning av 100 ul /brønn av MTT-løsning, ble cellene inkubert i ytterligere 2 timer. Supernatantene ble deretter fjernet, og de formazankrystaller ble oppløst i 100 ul /brønn DMSO. Absorbansen ved 570/630 nm av hver prøve ble målt under anvendelse av multilabel plateleser (PerkinElmer). Tre uavhengige eksperimenter ble utført.
kolonidannelse
Ett hundre av celler ble sådd inn i 6-brønners plater, og dyrket i 7 dager. Og deretter ble mediet erstattet med friskt en inneholdende DHA. Etter å ha blitt inkubert i ytterligere 7 dager, ble koloni dannet av leverkreftceller farget med 0,05% krystallfiolett (Sigma, St. Louis, MO) i 8 min. Antallet koloni ble deretter kvantifisert.
Western blot
Cellelysater ble kokt med 6x natrium (SDS) lasting buffer og deretter fraksjonert ved SDS-PAGE. Proteinene ble overført til PVDF-membran, som så ble inkubert med et primært spesifikt antistoff i 5% ikke-fet melk, etterfulgt av et pepperrot-peroksydase (HRP) konjugert anti-mus eller anti-kanin andre antistoffer. ECL deteksjonsreagensen (Amersham Life Science, Piscataway, NJ) ble brukt til å demonstrere resultatene.
Annexin V /PI analyse
Apoptose ble vurdert ved hjelp Annexin V-PI dobbel farging. Etter behandling ble cellene trypsinert, og farget med 0,5 mg /ml Annexin V i bindingsbuffer (10 mM HEPES fri syre, 0,14 M NaCl, og 2,5 mM CaCl
2) i 30 min. Etterpå ble PI (5 pg /ml sluttkonsentrasjon) tilsatt og inkubert i ytterligere 15 min. Celler ble påført på et strømningscytometer for datainnsamling.
TUNEL assay
Apoptose-analysen ble utført ved anvendelse av Apo-Direct TUNEL Assay kit (Millipore). Celler ble høstet og fiksert i 4% PFA i 60 minutter ved 4 ° C, etterfulgt av en andre fiksering i 70% (v /v) etanol over natten ved -20 ° C. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige reagenser for en periode utformet i henhold til fremstillingen instruksjon. Til slutt ble cellene analysert ved hjelp av strømningscytometri ved å bruke FACS Vantage maskin (Becton Dickinson). The Cell quest programvare (Verity Software House) ble brukt til å analysere dataene.
In situ
celledød deteksjon
Merking av fragmentert DNA for å vurdere apoptose ble utført med TUNEL farging (grønn fluorescens), ved hjelp av
in Situ
celledød Detection Kit (Roche, LA), som beskrevet i vår tidligere studie [19].
Måling av caspase 3-aktivitet
aktiviteten av kaspase 3 indusert av DHA behandling ble bestemt ved caspase-3 aktivitet Assay Kit (Merck, Darmstadt).
Måling av mitokondriemembranpotensialet (Δψ
m) med flowcytometri
Forty nM DioC6 (Sigma-Aldrich, MO) ble inkubert med behandlede celler ved angitte tidspunkter i 15 minutter ved 37 ° C. De høstede celler ble vasket med iskald PBS og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av Becton Dickinson FACS Vantage maskin (Becton Dickinson, NJ). Celler med lav Δψ
m ble presentert som en prosentandel av den totale cellepopulasjon. Den Cellquest programvare (Verity Software House) ble brukt til å analysere dataene.
Dyrestudier
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer og har blitt godkjent av Institute Forskning Medical Etikkutvalget av Sun Yat-Sen universitetet Cancer Center. 1 x 10
7 av Hep G2-celler ble suspendert i steril PBS og injisert subkutant i høyre flanke av musene. Musene ble sjekket daglig for xenograft /svulst utvikling. Mus ble randomisert i tre grupper på 6 mus /gruppe. DHA (5 mg /kg mus kroppsvekt) ble gitt til den «DHA» gruppe, Saha (1,5 mg /kg mus kroppsvekt) ble gitt til «Saha» gruppe, ble kombinasjonen av Saha og DHA gitt til «DHA + Saha «gruppe, en gang daglig i fem påfølgende dager pr uke i 24 d. Den DMSO gruppen mottok et likt volum av oppløsningsmiddel kontroll. Etter behandling ved forskjellige tidsintervaller, ble mus kroppsvekt og tumorstørrelse ble målt. Til slutt, tumorer ble skåret ut, veiet og fiksert i 4% PFA. Parafininnstøpte vev ble deretter seksjonert ved 4 nm og klar for H . E farging og TUNEL assay
Immunhistokjemi
formalin-fikserte og parafininnstøpte leverkreft seksjoner med en tykkelse på 4 um ble avvokset i xylen og gradert alkoholer, hydrert, og vasket i phosphatebuffered saltvann (PBS). Etter forbehandling i en mikrobølgeovn, ble endogen peroksidase inhibert med 3% hydrogenperoksid i metanol i 20 minutter, fulgt av avidin-biotin blokkering ved hjelp av en biotin-blokkerende kit (DAKO, Tyskland). Platene ble deretter inkubert med antistoffer i 4 timer i et fuktig kammer ved romtemperatur, vasket i PBS og inkubert med biotinylert geite-anti-kanin /mus antistoffer. Lysbilder ble utviklet med Dako Væske 3, «3-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB) + Underlag kromogen System og kontra med hematoksylin.
Statistisk analyse
Forskjellen mellom gruppene ble bestemt for statistisk signifikans ved hjelp av en veis ANOVA eller Student
t
-test. Alle
P
-verdier er tosidig og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske beregninger ble utført med SPSS programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige eksperimenter.
Resultater
aktiveringer av MAP kinaser var involvert i DHA-indusert apoptose
DHA har vist seg å indusere celledød i humane cancere [20], [21]. Vi først vurderes DHA-indusert apoptose i leveren kreft cellelinjer, ved hjelp Annexin V analysen. Resultatene indikerte at prosentandelen av Annexin V-positive celler ble dramatisk økt ved DHA-behandling (fig. 1A), noe som tyder på DHA være en potent induser apoptose i leverkreftceller. Sammenlignet med kontrollen, etter eksponering av 10 uM DHA i 24 timer ble den prosentandel av apoptotiske celler merkbart øket fra 5,3% og 4,9% til 16,6% og 13,5%, henholdsvis i Hep G2 og PLC /PRF /5-celler (fig. 1B).
A. DHA indusert apoptose i leverkreftceller. Celler behandlet med enten DMSO eller 10 uM DHA i 24 og 48 timer ble farget med både Annexin V og propidium jodid (PI) i 45 min. Apoptose indusert av DHA ble deretter vurdert av strømningscytometer analyse. B. Prosentandelen av apoptotiske celler ble vist, etter kvantitativ analyse av PI /Annexin V-assay. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05, versus DMSO gruppen. C. MAP kinaser ble aktivert av DHA. Celler ble behandlet med 10 uM DHA for angitte tid. Fosforylering av p38, JNK og ERK ble bestemt. D. Kvantitative data fra tre uavhengige eksperimenter ble vist for å indikere den relative uttrykk for p-p38, p-JNK, og p-ERK.
apoptoseinduksjon assosierer vanligvis med aktivering av MAP kinaser. En tids kurs analyse ble utført på fosforyleringen nivåene av tre MAP kinase, inkludert medlemmer ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) og p38 (fig. 1C). Protein nivåer av alle 3 MAP kinaser forble uendret. Imidlertid ble p38 fosforylering øket etter behandling DHA i begge testede celler. Nivået av JNK-fosforylering forble den samme som kontrollen i Hep G2-celler, men var betydelig økt i PLC /PRF /5-celler (Fig. 1D). Nivåene av p-ERK dukket ned i både leverkreftceller behandlet med DHA. Disse dataene kan tyde på at inaktivering av ERK bidrar til DHA-indusert apoptose.
Hemming av ERK-fosforylering ble tilskrevet DHA-indusert apoptose i leverkreftceller
For å teste vår antagelse om at inaktivering av ERK var involvert i DHA-indusert apoptose, forbehandlet vi celler med PD98059, en inhibitor av ERK-fosforylering. For det første, ble cytotoksisiteten av PD98059 testet. Resultatene indikerte at PD98059 alene ikke forårsake betydelig apoptose i begge celler (data ikke vist). Vi har fastslått ved virkningen av PD98059 på DHA-indusert cellevekst dempning. Som indikert ved MTT resultat, PD98059 betydelig redusert leverkreft celle viabilities, sammenlignet med DHA-grupper (Fig. 2A).
PD98059, en inhibitor av ERK-fosforylering, forsterket DHA-indusert reduksjon av cellelevedyktighet. Celler ble forbehandlet med 10 uM PD98059 i 2 timer, og deretter inkubert med 10 pM DHA i ytterligere 24 timer. Den gjenværende cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-assay. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter, *
P
0,05. B. PD98059 behandlingen økte produksjonen av apoptotiske legeme. -Celler forbehandlet med 10 uM PD98059 i 2 timer, og deretter inkubert med 10 pM DHA i ytterligere 24 timer ble farget med Hoechst 33342 fargestoff. DNA-fragmentering (merket med en stjerne) og kjerne kondensasjon (angitt med pilene) ble observert under et fluorescens mikroskop. C. PD98059 behandling forbedret DHA-indusert apoptose. TUNEL assay ble utført for å bestemme apoptose. Antallet av apoptotiske celler ble bestemt, og den prosentvise ble indikert ved histogram. *
P
0,05. D. PD98059 pluss DHA behandling førte til spaltinger av PARP og caspase 3. Proteiner som er samlet fra celler behandlet med PD98059 og DHA i 24 timer ble utsatt for western blot å detektere spaltinger av PARP og caspase 3. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
Deretter undersøkte vi om PD98059 behandling forbedret DHA-indusert hemming av cellevekst gjennom å indusere apoptose. Vi vurderte DHA-indusert apoptose i leverkreftceller forbehandlet med 10 mm PD98059 i 2 timer ved Hoechst 33342 farging. Resultatene viste flere celler med karakteristiske funksjoner, inkludert kromatin kondens og apoptotisk kropp presentert i PD98059-forbehandlet celler (Fig. 2B). Dette ble ytterligere bekreftet ved TUNEL-analyser viser at prosentandelen av TUNEL-positive celler ble øket i leverkreftceller behandlet med både PD98059 og DHA (Fig. 2C). Videre nivåer av spaltet PARP og spaltet caspase 3 ble merkbart øket ved ERK-inhibitor i de to leverkreftcellelinjer (Fig. 2D). Disse funnene tyder på at DHA-indusert apoptose kan være relatert til ERK-fosforylering.
HDACi tilrettelagt DHA-indusert apoptose i leverkreftceller
I lys av at HDACi er i stand til å øke den dødelige effekten av kjemoterapeutika [22], [23], beregnet vi å undersøke om DHA kombinert med HDACi resulterte i mer celledød i leveren kreft. NaB og Saha ble anvendt i MTT-analyse. Ifølge resultatene, kombinasjon av DHA og HDACi betydelig redusert celle viabilities i leverkreftceller, sammenlignet med behandling med monoterapi (fig. 3A). Den økte cytotoksisiteten av kombinasjon av DHA og HDACi ble også bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen. Celler i DMSO grupper dannet et antall synlige kolonier på 15 d. Antallet koloni dannet av celler dyrket med både DHA og HDACi var betydelig mindre enn det med DHA alene (Fig. 3B).
Kombinasjonsbehandling med HDACi og DHA øket celledød. Celler ble behandlet med 4 mM NaB, 1,25 uM Saha, 10 uM DHA eller kombinasjoner av NaB /Saha og DHA i 24 timer. Celle viabilities ble målt ved MTT-analyse. B. Den hemmende effekten av HDACi og DHA i kombinasjon med leverkreft cellevekst ble ytterligere bekreftet ved kolonidannelse assay. Hundre av celler ble sådd inn i 6-brønners plater til 7 dager, og deretter dyrket med enten HDACi eller DHA for en annen 7 d. Koloniene ble farget med 0,05% krystallfiolett. Antallet koloni i hver brønn ble tellet og statistisk analyse ble utført. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. C. Effekten av HDACi på DHA-indusert apoptose ble målt ved TUNEL analyse, ved hjelp av
in situ
celledød deteksjon kit. Hep G2 celler ble behandlet som beskrevet i A ble utsatt for TUNEL assay. Apoptotiske celler ble observert under fluorescerende mikroskop. D. Effekten av HDACi og DHA i kombinasjon ble ytterligere bekreftet ved TUNEL-analyse, ved hjelp av strømningscytometri. Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet. E. Caspase 3-aktivering var involvert i HDACi-mediert apoptose i celler behandlet med DHA. Aktiviteten av caspase 3 i celler behandlet som beskrevet i A, ble bestemt og den aktuelle endring ble vist. For A, B, D og E, *
P
0,05, **
P
. 0,01, versus DHA gruppen
Neste vi bestemmes den pro-apoptotiske aktivitet av kombinert behandling med DHA og HDACi. DHA behandling potent indusert apoptose i leverkreftceller, men mer apoptose ble indusert ved den kombinerte behandling med begge midler, som vist ved TUNEL-analyser indikerer en merkbar økning i TUNEL-positive celler (Fig. 3C). Statistisk sett DHA i kombinasjon med NaB eller Saha øket apoptotiske celler med 1,9 eller 2,8 ganger, henholdsvis i Hep G2-celler, og ved 3,0 eller 3,5 ganger henholdsvis i PLC /PRF /5-celler (Fig. 3D). I tråd med økt apoptose, caspase 3-aktivitet var høyere i celler behandlet med både DHA og HDACi (Fig. 3E).
Offentliggjøring av cytokrom
c
til cytoplasma og nedregulering av Mcl-en og p-ERK bidro til apoptose som følge av den kombinerte behandling med HDACi og DHA
Vi har tidligere vist at DHA-indusert apoptose i forbindelse med Mcl-1 degradering og aktivering Bak [18]. Vi neste undersøkt om Mcl-en og Bak var involvert i HDACi-mediert anriking av apoptose i DHA-behandlede celler. Som indikert i resultatene av western blot, ble Mcl-en dramatisk redusert, mens Bak ble markert økt i Hep G2 celler behandlet med både DHA og NaB /Saha. Endringene av Mcl-en og Bak i PLC /PRF /5 celler delte en lignende trend med de i Hep G2 celler (fig. 4A). I tillegg ble villtype p53 i Hep G2 celler oppregulert, mens mutant p53 i PLC /PRF /5-celler ble neppe påvirket, etter behandlingen (fig. 4A).
Kombinasjonsbehandling med HDACi og DHA resulterte i nedregulering av Mcl-en og oppregulering av Bak. leverkreftceller ble utsatt for fire mM NaB, 1,25 uM Saha, 10 uM DHA eller kombinasjoner av NaB /Saha og DHA i 24 timer. Uttrykk for Mcl-en, Bak og spaltet PARP ble undersøkt av western blot. Øvre panel: et representativt resultat ble vist. Bunnplate: den relative uttrykk for Mcl-en og Bak normalisert til Actin ble angitt med histogram. B. Ekspresjon av p-ERK ble redusert i celler behandlet med HDACi og DHA. Proteiner som er samlet fra leveren kreftceller behandlet med Saha, DHA eller de kombinerte stoffene ble underkastet Western blot for å undersøke p-ERK uttrykk. Øvre panel: et representativt resultat ble presentert. Bunnplate: den relative uttrykk for p-ERK /ERK ble vist. C. Reduksjon av mitokondriemembranen potensial (MMP) ble indusert i HDACi /DHA-behandlede celler. Hep G2 og PLC /PRF /5-celler ble behandlet som beskrevet i A. MMP kollapset (Δψ
mL) ble målt ved flow-cytometri etter farging av cellene med DioC6 og kvantitativ analyse av Δψ
m er vist. Dataene representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. D. Cytokrom
c
ble sluppet til cytosol i behandlede celler. Celler ble behandlet som beskrevet i A. Fraksjoner på cytosol ble isolert for å undersøke fordelingen av cytokrom
c
. p-aktin ble benyttet som markør for cytosol. E. HDACi forbehandling sensibilisert celler til DHA-indusert apoptose. leverkreftceller forbehandlet med 4 mM NaB eller 1,25 uM Saha i 2 timer ble ytterligere eksponert for 10 uM DHA i ytterligere 24 timer. TUNEL analyser ble utført for å bestemme apoptose. Prosentandelen av TUNEL-positive celler ble vist. For B, C og E, *
P
. 0,05, versus DHA gruppen
I lys av nye data som ERK-fosforylering ble hemmet i DHA-behandlet og HDACi- behandlede celler. Vi undersøkte neste nivået av fosforylert ERK. Resultatene viste en rask reduksjon av p-ERK i leverkreftceller behandlet med både DHA og Saha, særlig i PLC /PRF /5-celler (Fig. 4B).
Siden DHA-indusert apoptose ble tilskrevet depolarisering av mitokondriell ytre membran [18], vi neste undersøkte reduksjon av mitokondriemembranpotensialet (MMP). Resultatene viste at den kombinerte behandlings bemerkelsesverdig senket mitokondrielle transmembranpotensialet (fig. 4C), etterfulgt av en åpenbar frigjøring av cytokrom
c
fra mitokondrier til cytoplasma (fig. 4D).
Som vist i vår forrige undersøkelse, for å HDACi forbehandling sensitivisert lever kreftceller Etoposide [22]. Vi forbehandlet celler med NaB eller Saha, og deretter vurderes det resulterende apoptose av tunel analyser. Sammenlignet med de av unpretreated celler, ble prosentandeler av TUNEL-positive celler i HDACi-forbehandlede celler signifikant øket (fig. 4E).
Saha forbedret antitumoreffekt av DHA på Hep G2 xenograft tumor i mus
Etter å ha demonstrert evne til Saha å forbedre DHA-mediert celledød
in vitro
, vi fast bestemt på ytterligere synergieffekten av Saha og DHA
in vivo
. Hep G2-celler ble injisert subkutant i nakne mus for å etablere tumor xenograft. Nude mus med tumorxenotransplantater ble dosert med DHA (5 mg /kg /Bud) og /eller Saha (1,5 mg /kg /Bud) daglig i 24 dager. Behandlingen synes ikke å ha en merkbar effekt på kroppsvekt hos mus. I gjennomsnitt var kombinasjonsbehandlingen hindres leverkreft tumorvekst med mer enn 44,7%, mens den enkelt middel behandling med enten DHA eller Saha bare inhiberte tumorvekst med 17,6% og 4,6%, respektivt (figur 5A.). På dag 24 ble musene avlivet og tumorvekter ble målt. Som forventet, er kombinasjonen av HDACi og DHA betydelig redusert vekt av tumor xenograft, sammenlignet med DHA-bare grupper (Fig. 5B). Disse data indikerte at kombinasjonsbehandling generert et større anti-proliferativ effekt og cytotoksisitet enn både monoterapi alene leverkreft xenografter
in vivo
.
Kombinasjon av Saha og DHA merkbart stanset veksten av Hep G2 xenograft tumor. Nude mus ble inokulert med 1 × 10
7 av Hep G2 celler. Etter at det dannede svulsten var merkbar, ble musene tilfeldig delt inn i fire grupper. DHA (5 mg /kg mus kroppsvekt) ble gitt til den «DHA-gruppen, ble Saha (1 mg /kg mus kroppsvekt) gitt til «Saha» gruppe, ble kombinasjonen av Saha og DHA gitt til« DHA + Saha «gruppe, en gang daglig i fem påfølgende dager pr uke i 24 d. Tumorvolumene ble beregnet hver to dager. Seks xenografter ble utført i hver gruppe. Dataene er gjennomsnitt ± SD, *
P
0,05, versus DMSO gruppen. B. Kombinasjon av Saha og DHA behandlinger resulterte i en dramatisk nedgang på svulst vekt. På dag 24 ble musene avlivet og tumorvekter ble målt. C. Apoptose ble indusert
in vivo
. Svulster ble seksjonert og apoptose ble bestemt ved hjelp av
in situ
celledød deteksjon kit. Apoptotiske celler ble observert under fluorescerende mikroskop. D. Saha økt betydelig apoptose i DHA-behandlede mus. Prosenter av apoptotiske celler ble målt ved å telle antallet av grønne celler under fem tilfeldige områder.
For å teste hvorvidt HDACi forsterket den dødelige effekten av å øke DHA via apoptose, tumorvev ble seksjonert og underkastet
in situ
celledød deteksjon (fig. 5C). Resultatene viste at andelen av apoptotiske celler ble signifikant øket fra 8,6 ± 2,4% DHA gruppen til 17,7 ± 3,3% i kombinerte behandlingsgruppen (fig. 5D). I tillegg, undersøkte vi histologi av tumorer etter behandling ved hjelp av H E farging for bestemmelse av patologisk vurdering. På den annen side ble vev av xenotransplantater kastes immunkjemi for å påvise ekspresjon av Ki-67, p53, Mcl-1, p-ERK, og aktivt PARP. Original forstørrelse × 400.
I tillegg utførte vi immunhistokjemi for å påvise proteiner involvert i HDACi /DHA-indusert apoptose (Fig. 6). Redusert ekspresjon av Ki-67 indikerte reduksjon av celleproliferasjon og trolig forbedret celledød. ble observert påviselig forskjell i p53 uttrykk. Slående økning av aktivt PARP, så vel som en fremherskende nedgang av Mcl-1 og p-ERK, var til stede i HDACi /DHA-behandlede xenograft. Samlet utgjør disse data indikerte at HDACi var i stand til å betydelig øke DHA-medierte antitumor effekt.
Diskusjoner
Nyere studier tyder på at HDACi inkludert NaB og Saha samhandle synergi med cytotoksiske midler, for eksempel fludarabin og etoposid, for å dramatisk øke mitokondrie skade og apoptose i leukemi og epiteliale kreftceller [24], [25]. Den antitumorigenic egenskaper HDACi er spesielt bemerkelsesverdig sannsynligvis på grunn av det faktum at deres cytotoksiske effekter er vanligvis spesifikke for kreftcellene, men ikke til normale celler. Men når det brukes som monoterapi, kan HDACi utviser begrenset dødelig aktivitet mot leverkreft, som er tydelig i denne studien viser at både NaB og Saha ved lave doser er ikke i stand til å indusere betydelig veksthemming
in vitro
og
in vivo
. Men når HDACi anvendes i kombinasjon med DHA, et derivat av artemisinin som klinisk brukes i behandling av malaria med god toksikologisk profil [26], kan de indusere apoptose mye mer, noe som resulterer i bemerkelsesverdig stans av tumor xenograft i nakne mus. Det er svært begrenset informasjon om HDACi i kombinasjon med andre antitumormidler mot leverkreft. Våre data for den første gang har vist en synergistisk effekt av DHA og HDACi i hemming av leverkreft.
Mange rapporter har vist at terskelen av apoptose i kreftceller kan kontrolleres ved aktiviteten av flere signaloverføringsveier , er en av hvilken Raf-MEK1 /2-ERK1 /2 pathway [27], [28]. Denne veien er ofte dysregulerte i neoplastisk transformasjon, sammen med c-Jun NH2-terminal kinase (JNK1 /2) og p38 MAPK trasé [29]. Det har også vært implisert at aktivering av ERK1 /2 veien er vanligvis forbundet med overlevelse men JNK1 /2 og p38 MAPK-reaksjonsveien med apoptose [30]. I vår studie ble ERK1 /2 fosforylering litt hemmet av DHA behandling, men sterkt hemmet av kombinert behandling med DHA og HDACi. I tillegg, ved hjelp av ERK-spesifikk hemmer PD98059, demonstrerte vi at aktivering av ERK er antiapoptotic siden ERK-inhibitoren forbedret DHA-indusert apoptose i leverkreftceller.
En rekke antiapoptotic effektor-proteiner har blitt identifisert nedstrøms av ERK1 /2-signalering, omfattende Bcl-xL og Mcl-1 [31], [32]. Endringer av både fosforylert ERK og Mcl-en hyppig forekommer i den samme retning. Yuen et al. rapporterte at tie Ran kan føre til deaktivering av ERK og nedregulering av Mcl-1 i kreftceller [33]. Reeves et al. viste at aktivering av ERK og induksjon av Mcl-1 ble observert i myeloide celler infisert med humant cytomegalovirus [34]. Calviño et al. rapportert treate med lonidamine pluss Arsenikk resultert i reduserte Mcl-en og p-ERK [35]. Sun et al.
