Abstract
Eggstokkreft er den vanligste dødsårsaken fra gynekologisk kreft. Forståelse biologien til denne sykdommen, spesielt hvordan tumorassosierte lymfocytter og fibroblaster bidra til progresjon og metastase av tumoren, er blitt hindret ved mangelen på en egnet tumor xenograft modell. Vi rapporterer en enkel og reproduserbar system hvor tumoren og tumor stroma er vellykket podet inn i NOD-scid IL2Rγ
null (NSG) mus. Dette oppnås ved å injisere tumorcelleaggregater avledet fra friske ovarier tumorbiopsi vev (inkludert tumorceller og tumorassosierte lymfocytter og fibroblaster) i.p. i NSG mus. Tumorprogresjon hos disse musene tett paralleller mange av de hendelser som er observert i eggstokkreft pasienter. Svulster etablere i det omentum, ovarier, lever, milt, uterus, og bukspyttkjertel. Tumorvekst er i utgangspunktet meget langsom og gradvis i løpet av bukhulen med en endelig utvikling av tumor ascites, spontan metastasering til lungen, øker serum og ascites nivåer av CA125, og retensjonen av tumorassosierte humane fibroblaster og lymfocytter som forblir funksjonell og responsive til cytokiner for lengre perioder. Med denne modellen vil man være i stand til å fastslå hvor fibroblaster og lymfocytter i svulsten mikromiljøet kan bidra til tumorvekst og metastase, og vil gjøre det mulig å evaluere effekten av behandlinger som er utformet for å målrette disse celler i tumoren stroma.
Citation: Bankert RB, Balu-Iyer SV, Odunsi K, Shultz LD, Kelleher RJ Jr, Barnas JL, et al. (2011) humanisert musemodell for Ovarian Cancer rekapitulerer Pasient Solid tumorprogresjon, Ascites formasjonen, og metastasering. PLoS ONE 6 (9): e24420. doi: 10,1371 /journal.pone.0024420
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 30 juni 2011; Godkjent: 08.08.2011; Publisert: 15.09.2011
Copyright: © 2011 Bankert et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet delvis av NIH stipend CA34196 (LDS) og ved NIH Grants CA131407, CA108970 og AI079188 (RBB), T32AI1007614 (MSA), Ovarian Cancer Working Group Grant for Cancer Research Institute (KO) og NIH Grant HL-70227 (SB -JEG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Både normale og neoplastiske humane vev har blitt innpodet i T-celle og B-celle-mangel
prkdc
SCID (SCID)
mus. Den første vellykkede engraftment av humane celler i disse C.B-17
SCID
mus ble rapportert over 20 år siden [1]. Bruken av menneskelige vev xenografter i disse immunsvikt mus har siden ført til innsikt i biologien til kreft hos mennesker, autoimmunitet og smittsomme sykdommer [2]. Potensialet for å bruke flere forskjellige menneskelige tumor xenograft modeller for å studere og evaluere anti-kreft terapi sammen med modellenes begrensninger og fallgruvene er blitt anmeldt [3]. En av de største hindringer for de tidligere xenograft-modeller var vert-versus-transplantat (HVG) respons som ble observert etter implantering av humane vev. Mens
SCID
mus manglet funksjonell B og T-celler, disse musene hadde en intakt medfødte immunrespons som var ansvarlig for den komplekse cellulært og molekylært HVG respons. Intensiteten av denne HVG respons varierte betydelig fra mus til mus og med den histologiske type tumor som brukes for innpoding [3]. Forbedrede nivåer av menneskelig vev engraftment har vært avhengig primært på genetiske modifikasjoner av immunsvikt verts mus [2]. Et stort gjennombrudd var genereringen av immundefekte mus som er homozygote for målrettede mutasjoner på interleukin-2-reseptoren γ kjedes locus [2]. Disse musene er sterkt svekket i utvikling og funksjon av T-celler, B-celler og NK-celler [2]. Et eksempel på denne nye typen immunodeficient musestamme er NOD.Cg-
Prkdc
scidIL-2RG
tm1Wjl
, forkortet NSG. Immunodefekte mus som mangler IL-2-reseptoren γ-kjeden har blitt funnet å understøtte den forlengede innpoding av humane hematopoietiske celler og perifere mononukleære blodceller [2] bedre enn tidligere immunodeficient musestammer.
A xenograft modell hvor humane tumorer og autologe tumorassosierte T- og B-celler kan være co-podet og deres interaksjoner studert
in vivo
ville gi en mulighet til å finne ut hvordan menneskelige immunkompetente celler og kreftceller påvirker hverandre. Resultatene kan potensielt bli anvendt for å vurdere immunterapeutiske metoder for kreft. Videre, i lys av den økende bevissthet om at ikke-ondartede stromale celler innbefattende fibroblaster, epitelceller og andre leukocytter samvirker med og har en effekt på tumorvekst og metastase [4], utvikling og bruk av modeller i hvilke tumoren mikromiljøet opprettholdes i xenograft er også avgjørende for å oppnå innsikt i patogenesen av tumorprogresjon. Ved implantering av ikke-forstyrret stykker av humane tumorer subkutant i NSG mus, ble xenografter ble etablert i hvilken vevet arkitektur, inkludert tumorassosiert leukocytter, stromale fibroblaster og tumorceller ble bevart og holdt der i lengre perioder [5]. Denne modellen viste seg å være nyttig i å demonstrere evnen av eksogent IL-12 levert av biodegraderbare mikrosfærer for å aktivere hvilende minne-T-celler i tumoren mikromiljøet [5]. Men fordi disse tumorxenotransplantater ikke ble etablert orthotopically, og bare begrenset dokumentasjon av tumorutbredelse ble observert, modellen ikke nøyaktig gjenspeiler mønstre av vekst og metastasering som er observert hos kreftpasienter, og var derfor begrenset potensiell verdi i å identifisere faktorer som bidrar til metastase eller for å vurdere effekten av immunterapeutiske protokoller.
En svulst xenograft modell har blitt utviklet og er rapportert her hvor menneske epitelovarialcancer tumorxenotransplantater er etablert orthotopically, og mønsteret av tumorvekst og metastasering reflekterer det som er observert i eggstokkkreftpasienter. Tumor-assosiert T- og B-lymfocytter og fibroblaster co-innpode innenfor tumornoduler og T-cellene forblir funksjonelle og lydhør overfor eksogent administrert cytokin. CA125 er til stede i sera og ascites av CA125 + tumorbærende mus, og gir en mulighet for å overvåke tilstedeværelsen og fremdriften av tumorxenografter med jevne mellomrom. Det er forventet at denne modellen vil gjøre det mulig å undersøke evnen til human tumor-assosierte leukocytter og tumor stroma å modulere
in situ
tumorprogresjon. Videre gir modellen mulighet for å evaluere effekten av single, samt kombinasjon, terapeutiske tilnærminger til eggstokkreft.
Resultater
Menneskelige eggstokkene epiteltumorer innpode orthotopically i eggstokken og andre organer følgende områder intraperitoneal (ip) injeksjon av tumor-avledede celleaggregater i NSG mus
det ble fastslått tidligere at subkutan implantasjon av faste stykker av friske humane tumorvev i NSG mus resulterte i etableringen av tumor microenvironments [ ,,,0],5]. Fordelene med denne fremgangsmåten i forhold til tidligere fremgangsmåter var at de resulterende xenotransplantater opprettholdt sin opprinnelige arkitektur, inkludert tumorassosierte leukocytter, stromal fibroblast og tumorceller, og de xenotransplantater overlevde i lengre perioder uten HVG forstyrrelser eller infiltrering av vertsceller. En vesentlig begrensning av dette tidligere xenograft modell var at den ikke kan gjenspeile mønstre av tumorvekst og spredning som er observert hos kreftpasienter, og noen tumorer mislyktes i å innpode eller resulterte i xenotransplantater med store områder av nekrose på grunn av en utilstrekkelig vaskularisering av solide biter av svulster.
Vi rapporterer her en metode for engraftment, der ovarietumorer kan med hell etablert som xenografter orthotopically i eggstokken og andre organ områder av mottaker mus. Den tumorvekst reflekterer mønsteret og progresjon observert i eggstokkreft pasienter. Dette er oppnådd ved å injisere en suspensjon av celleaggregater (som er avledet fra en mild avbrudd av faste ovarietumorer) i.p. i NSG mus (se metodedelen). For å sikre vellykket innpoding tumor, må tumorbiopsi vevet består av områder av levedyktige tumorceller som omfatter tumorassosierte lymfocytter, fibroblaster og som vist i fig. 1. De tumor-avledede-cellesuspensjoner som følge av avbrudd av den friske faste tumorvev inneholde små (200-300 um diameter) aggregater av celler som inneholder CD45 + leukocytter, cytokeratin positive tumorceller, CD3 + T-celler og Trichrome positiv kollagen som er produsert av fibroblaster (fig. 2A-E). Celle tilslag som stammer fra ovarietumorer hentet fra fem forskjellige pasienter (Eksperimenter 1-5) ble injisert intraperitonealt inn i NSG mus og mottaker musene avlivet ved tidspunktene angitt i tabell 1. Mens histologiske tegn på festingen og veksten av tumorcelleaggregater ble observert på omentum så tidlig som 8 dager etter i.p. inokulasjon (data ikke vist) brutto og histologiske tegn på svulst og tumor stroma innenfor forskjellige organ nettsteder (omtalt nedenfor) ble ikke etablert før 80 til 177 dager etter vaksinasjonen (tabell 1). Ingen av musene viste noen åpenbare kliniske tegn på tumorutvikling i løpet av de første 10 ukene av observasjon etter svulst inokulering. Døden var ofte det første tegn på svulst engraftment. En mus fra hvert forsøk døde uten evaluering, og ble ikke tatt med i den endelige analysen
En del av en papillær serøs adenokarsinom i eggstokken farget med hemotoxylin og eosin (H E).. Vist i en 100 × forstørrelse og i B 400 x forstørrelse klynger av kreftceller (T) som viser lymfatisk infiltrasjon (L), sammen med fibrøst bindevev (F).
Histologi og immunhistokjemi av svulst -avledede celleaggregater avledet ved mild avbrudd av et primært ovarial tumor. H E-farging viser klynger av celler av forskjellige størrelser (A) Immunohistokjemisk farging for human CD45 (B) og CD3 (C) viser tegn på humane leukocytter og T-celler, dvs. mørk brun farget celler. Trichrome-farging (D) viser nærværet av kollagen som er produsert av fibroblaster og flekker blågrønt. Tumorceller flekken mørk brun med immunhistokjemisk flekk for cytokeratin (E). Alle tall er 400 × forstørrelse.
Knuter oppdaget grovt i bukhulen på mus injisert med tumor avledet celle aggregater ble bekreftet histologisk å være svulster (Fig. 3AA og 3AB). De tumorknuter varierte i diameter fra 2 mm til 10 mm og ble mest hyppig observert innenfor eller nær området av omentum, dvs. tilstøtende til magesekken, milt og pankreas. I noen muse-tumorer ble observert grovt på overflaten av milten og leveren. For å avgjøre om svulstene hadde spredt seg til andre organer områder innenfor bukhulen, ble deler av hvert organ tatt, fiksert og farget. Fig. 3AC-3Ag avsløre tilstedeværelsen av tumor i eggstokken, periovarian fett, bukspyttkjertel, uterus, milt og lever fra en mus avlivet 140 dager etter injeksjon av tumor-avledede celle aggreages (4 Eksperiment #).
H E farging viser tegn til tumor (se pilene) i peritoneal nodule fra omentum (Aa og Ab), eggstokk og periovarian fett (Ac), bukspyttkjertel (Ad), livmor (AE), milt (Af) og lever (Ag) . Disse svulstene resulterte fra i.p. injeksjon av tumor-avledede celleaggregater avledet fra en papillær serøs karsinom i ovariene. Mus ble ofret 140 dager etter vaksinasjonen. Lymfocytter (pil) ble observert i sidestilling med tumorceller (pilspiss) (Ba). Immunhistokjemisk farging (B) viser tilstedeværelsen av humane CD45 + leukocytter (Bb), CD3 + T-celler (BC), CD20 + B-celler (BD), CD138 + plasmaceller (Be), og HLA + tumor knute ved siden av eggstokk (Bf). Proliferasjon av tumorceller er vist ved positiv flekk med Ki67 (Bg), og tegn på stromale fibroblaster illustrert ved Trichrome farging av kollagen se pilene (BH). Arrow head viser tumorceller. Alle delene i A er på 100 × forstørrelse og i B delene er på 400 x forstørrelse.
Hyppigheten av svulster observert histologisk i ulike organ områder varierte fra tumor til tumor og fra mus til mus for hver tumor-avledede celle-aggregatet implantert. I et typisk eksempel på organ fordeling på 15 mus, 116 dager etter i.p. injeksjon av celleaggregater avledet fra faste ovarietumorer (Eksperiment 5 A, tabell 1), ble histologiske tegn på tumor påvises i eggstokken av 10 mus, milten hos 10 mus, leveren av 8 mus, og livmoren av 2 mus. Det er sannsynlig at dette organet nettstedet engasjement er en undervurdering av den faktiske frekvensen av svulster i forskjellige organer, fordi bare et lite område av hvert organ ble undersøkt histologisk.
Menneske CD45 +, CD3 +, CD20 +, CD138 + Leukocytter , fibroblaster og prolifererende tumorceller er til stede i mikromiljøet av tumorxenografter
Deler av tumorknuter fjernet fra bukhulen og farget med eosin og hemotoxylin avdekket områder hvor lymfocytter (se pil) var til stede i sidestilling med tumor celler (se pilhode) (fig. 3Ba). Immunhistokjemisk farging av dette vev fastslått at de tumorassosierte lymfocytter var humane CD45 + og inkludert CD3 + T-celler, CD20 + B-celler, og CD138 + plasmaceller (Fig. 3bb-Be). Tumorceller farget positivt for HLA klasse I (fig. 3Bf), og inkludert aktivt delende Ki67-positive celler (Fig. 3BG).
A Trichrome flekk av tumorknuter viste at i tillegg til de inflammatoriske celler, fibroblaster var til stede i mikromiljøet av tumorxenografter (se pil) (fig. 3BH). Fibroblastene farget positivt for HLA klasse I (data ikke vist).
Vi konkluderer med at det histologisk arkitektur og cellulært preparat omfattende tumorcellene, inflammatoriske leukocytter og fibroblaster til den opprinnelige tumorvevet blir opprettholdt i lengre perioder (opptil til 177 dager etter engraftment) i svulsten xenograft, og at kreftceller fortsetter å spre innenfor tumornoduler stede i bukhulen.
tumor Ascites utvikling i NSG Mus inokulert med Ovarian tumor-avledede celle Aggregater
Ovarian kreftpasienter vanligvis utvikle en svulst ascites i de senere stadier av sykdommen [6], [7]. For å finne ut om kreft ascites utvikle seg i svulsten xenograft modell, ble NSG mus overvåket i lengre perioder etter den i.p. inokulering av tumor-avledet celle aggregater. Oppblåst livet ble observert hos mus ved 14 uker etter tumorinjeksjon tyder tilstedeværelsen av ascites. Parasentese bekreftet tilstedeværelsen av ascites fluid i bukhulen til mus. For å bestemme hvorvidt levedyktige tumorceller var tilstede i ascitesvæsken ble ascitesvæsker fra tumorbærende mus (som ble generert ved intraperitoneal inokulering av ovarian tumor-avledede celleaggregater fra tre forskjellige eggstokkkreftpasienter) injisert i.p. inn naive NSG mus. Åtti-syv til 94 dager etter inokulasjon mus hadde histologiske tegn på tumorutvikling i eggstokken, uterus, lever, milt og lunge (data ikke vist). De fleste av disse sekundære mottakerne hadde også utviklet ascites ved dette tidspunktet. Disse resultater etablerer både tilstedeværelse av levedyktige tumorceller i ascitesvæsken av den opprinnelige tumorbærende mus, og evnen til å underkanal tumoren og derved utvide antall mus med tumor-xenografter. Svulster har nå vært vellykket under passert tre ganger. Etter tredje passering de tumorxenotransplantater ser ut til å være stort sett blottet for menneskelige tumorassosierte fibroblaster og tumorassosierte lymfocytter.
Tilstedeværelse av CA125 i Sera og Ascites av Ovarian tumor Peiling NSG Mus
CA125 er en høy molekylvekt glykoprotein som er forhøyet i serum hos ca. 90% av pasienter med avansert ovarialcancer [8], [9], og brukes til å overvåke tumorprogresjon og respons på kjemoterapi i eggstokkkreftpasienter [8]. Fordi den eneste kliniske tegn på svulst utvikling i musene var kreft ascites som skjedde veldig sent, var det av interesse å finne ut om CA125 nivåer kunne påvises i NSG mus innpodet med eggstokkreft tumor-avledet celle tilslag, og for å fastslå om denne markøren kan brukes til periodisk å overvåke tilstedeværelsen og progresjon av de humane tumorer i mus etter tumorinokulasjon. Celle Aggregatene ble avledet fra faste tumorer i tre forskjellige kreftpasienter eggstokk med forhøyede serumnivåer (mer enn 500 u /ml) av CA125. Hver av de tre tumor-avledede celleaggregater ble injisert i.p. i 10 NSG mus og CA125-nivåer i serum og ascites ble analysert ved forskjellige tidspunkter etter tumor-inokulering. Ved 80 dager etter tumor-inokulering, CA125 var til stede i ascites og sera fra alle mus inokulert med tumorer avledet fra de tre forskjellige pasienter. I en av de tre grupper av mus ble dyrene tappet for blod med jevne mellomrom og serumnivåene av CA125 bestemt. CA125 i serum økte med tiden når et nivå som er større enn 500 enheter /ml 100 dager etter tumor-avledede celle-aggregatet inokulering. Mengden av CA125 i ascites variert betydelig fra tumor til tumor nådd nivåer av 400-5800 enheter /ml 85-116 dager etter tumor-avledet celle samlet vaksinasjon. Evnen til å detektere CA125 i serum og ascites av tumor xenograft bærende mus er reflekterende av enda en hendelse som er observert i eggstokkkreftpasienter, og er signifikant fordi det gir en måte til periodisk å overvåke tilstedeværelsen og progresjon av tumoren, og i siste instans å vurdere den terapeutiske effekten av ulike behandlingsprotokoller.
metastatisk spredning av Ovarian tumorxenotransplantater fra bukhulen til pleurahulen
den intra-abdominal spre at vi sees etter ip inokulering av ovarial tumor-avledede celle-aggregater i NSG mus, og generering av tumor ascitesvæske er konsistent med det som ses i trinn IIIC eggstokkkreftpasienter [7]. På dette stadiet av sykdommen kan innebære omentum, tarm mesenteriet, abdominal peritoneal flater, serosale overflate av tarmen og membranen. Mus som hadde utviklet tumor-ascites ved 16 uker etter i.p. injeksjon av tumor avledet celle aggregater, hadde brutto bevis på svulster på serøse overflater av tarm og omentum og ble nøye undersøkt for diaphragmatic kreft implantater. Gross forsøk på mulig tumorvekst ble observert på membranen av 12 av 15 mus inokulert med tumor-avledede celleaggregater. Histologisk analyse bekreftet tilstedeværelsen av tumorveksten på membranen (figur 4A).
H . E farging (100 x forstørrelse) avslører tilstedeværelsen av tumor i membranen (A), og i lungen 100 x forstørrelse (B) og 400 × forstørrelse (C). Den immunhistokjemisk farging av svulst i lungen for HLA klasse I (D) slår fast at disse svulstene er av menneskelig opprinnelse. Snittene ble gjort fra vevene hos en mus 16 uker etter i.p. injeksjon av en suspensjon av tumor = avledet celle aggregater.
Stage IV sykdom pasienten har bevis for utenom abdominal spredning av svulsten, og dette kan innebære pleurahulen med spredning til lungene parenchyma [7 ]. Selv om ingen brutto tegn på tumormetastaser i mus ble observert etter 16 uker etter tumor-avledede celle-aggregatet inokulering, histologisk analyse av lungene fastslått at mikrometastase av tumoren fra det peritoneale hulrom hadde forekommet i 4 av 15 mus. Små foci av tumorer i lungen (Fig. 4B, C) farget positivt for HLA klasse I (fig. 4D). Antallet mus med lungemetastaser er trolig et underestimat som bare en liten del av lungen ble undersøkt histologisk.
Vårt kollektive funn tyder på at den langsomme og progressiv mønster av tumorvekst og metastasering av ovarietumorer i NSG mus etter ip vaksinasjon av friske menneskelige eggstokkene tumor-avledet celle aggregater tett reflekterer at sett hos pasienter som utvikler seg til Stages IIIc og IV av sykdom som står for over 70% av eggstokkreft pasientene sett i klinikken [7].
humane T-celler som er tilstede i xenotransplantater produsere IFN-γ ved aktivering med eksogene IL-12 og plasmaceller konstitutivt produserer immunglobulin (Ig)
Lymfocytter inkludert effektor minne CD4 + T-celler [10], NY-ESO-1 tumorspesifikke CD8 + T-celler [11], CD4 + og CD8 + regulatoriske T-celler [12] – [14] og TH17 celler [15] har blitt funnet i eggstokkene tumor microenvironments. Disse og andre tumor-infiltrerende leukocytter er blitt vist å være assosiert med både forsterkning og inhibering av tumorprogresjon [16]. Det var av interesse og som er relevant for den potensielle nytten av vår humanisert musemodell for å fastslå om de valgte tumorassosierte lymfocytter som ble funnet i de tumorxenografter forble levedyktig og funksjonell. Etter å ha etablert ved immunohistokjemi nærværet av human CD45 + leukocytter CD3 + T-celler, CD20 + B-celler og CD138 + plasmaceller i svulsten mikromiljøet av xenografter etablert etter i.p. injeksjon av tumor-avledede celleaggregater (Fig. 3B), til levedyktighet og kapasiteten på disse celler reagerer på eksogene stimuler cytokin
in vivo
ble undersøkt.
Vi har tidligere fastslått at T celler i svulsten mikromiljøet har et svekket TCR drevet aktiveringssignal, men forblir levedyktig og svare på stimulering med IL-12 ved å produsere IFN-γ [17], [18]. Dersom T-cellene er tilstede i tumorxenografter forble levedyktig spådd vi at det ville være en betydelig økning av IFN-γ i sera fra tumorbærende mus etter behandling av mus med IL-12 [19]. Tumorbærende mus (21 dager etter tumorinokulasjon) ble injisert intraperitonealt med enten humane IL-12 inneholdende liposomer (50 ug av IL-12 per mus) eller kontroll (tom) liposomer og deres sera ble analysert med hensyn 5 dager senere med hensyn til nærvær av humant IFN-γ. Mens nivået av IFN-γ i sera av de IL-12-behandlede mus varierte fra mus til mus, 9 ut av 10 av disse musene viste signifikant forhøyede nivåer av IFN-γ (233-5392 ug /ml) (tabell 2) . Alle fem av de tumorbærende mus behandlet med kontroll-liposomene hadde lavere serumnivåer av IFN-γ strekker 32-88 pg /ml. Disse resultatene tyder på at de humane tumorassosierte T-lymfocytter, og muligens NK-celler, som er tilstede i tumorbærende mus er både levedyktig og som svar på IL-12. Den eneste behandling med IL-12 ikke resulterte i en signifikant reduksjon i tumorprogresjon sammenlignet med kontrollmus. Fremtidige studier er planlagt for å vurdere effekten av multiple behandlinger av mus med IL-12, enten alene eller i kombinasjon med kjemoterapi.
levedyktighet og funksjon av B-celler og plasmaceller i svulsten bærende mus ble løst ved analysering av sera for tilstedeværelse av menneskelig Ig. Vi konsekvent observert høye nivåer av human Ig i sera hos tumorbærende mus (Tabell 2). I en representativ eksperiment ble det observert forhøyede nivåer av Ig i mus 78 dager etter behandling i både IL-12 behandlede og kontrollmus, og ingen konsekvent forbedring av serum-Ig-nivåer har ennå blitt sett i respons til IL-12.
tilstedeværelsen av både funksjonelle tumorassosierte T- og B-celler i svulsten xenograft bærende mus for 100 dager gir en mulighet til å undersøke den mulige rollen som disse lymfocytter (og de biologisk aktive faktorer de produserer, dvs. cytokiner og antistoffer ) spille i overlevelse og metastasering av svulsten, og for å finne ut om det er mulig å manipulere disse lymfocyttene slik at de montere en effektiv anti-tumorrespons
in situ
.
Diskusjoner
Siden den første rapporten på den vellykkede engraftment av menneskelige celler i CB-17-SCID mus [1], har flere tusen papirer blitt publisert om bruken av disse og andre immunsvikt mus å innpode menneskelige maligne og ikke-maligne vev i studier av kreft hos mennesker, hematopoiesis, adaptive og medfødt immunitet, smittsomme sykdommer, autoimmunitet og regenerativ medisin [2]. Musemodeller har blitt brukt til å studere kreftcellevekst og for å preklinisk evaluere den terapeutiske effekt av immunbaserte og ikke-immunbaserte behandlingsstrategier for kreft. Begrensninger av disse tidligere modeller inkludert en betydelig medfødte immunrespons av de resipientmus som begrenset varighet av graftet og gjorde det vanskelig å tolke resultatene av terapeutisk effektivitetsstudier. Disse xenograft modeller unnlatt å rekapitulere områder og mønstre av tumorvekst og i de fleste av modellene co-engraftment av stromale celler med svulsten ikke ble etablert [3].
Vi rapporterer her en humanisert modell som nærmere paralleller mønstre av tumorprogresjon som er observert i eggstokkreft pasienter enn noe annet tidligere beskrevet modell. Vår modell fanger opp flere viktige funksjoner i menneske eggstokkreft ikke sett på tidligere modeller. Den intra-abdominal spre sammen med utviklingen av ascites er påfallende lik det som er observert hos pasienter. Den ko-innpoding av tumor-assosierte fibroblaster og T- og B-lymfocytter som forblir levedyktig og funksjonell etter lengre perioder gir en mulighet til å undersøke den mulige bidrag av disse ikke-maligne celler, og de biologisk aktive faktorer som de produserer, til vekst og spredning av kreftceller.
orthotopic engraftment og spredning av svulsten og co-engraftment av tumorassosierte immunkompetente celler med tumor stroma i denne nye humanisert musemodell gjør det mulig å studere
in vivo
interaksjon mellom lymfocytter og svulsten, lymfocytter og tumorassosierte fibroblaster og fibroblaster og svulsten. Det er tidligere blitt fastslått at tumor stroma er kritisk for å forhindre eller å tillate den immunologiske ødeleggelse av kreftceller [20]. Dette arbeidet ble senere bekreftet [21], og deretter utvidet viser at tumoren stroma fører til en T-celle mediert utrydding av etablerte tumor [22]. Orimo
et al.
Viste at fibroblaster avledet fra menneskelige invasiv brystcarsinomer betydelig forbedret tumorvekst i xenograft modeller [23]. Tumorassosierte fibroblaster er blitt vist av andre, for å forsterke eller undertrykke T-cellefunksjonen [24] – [26] og undergrupper av tumorassosierte T-celler er kjent for å interagere med tumorceller og gjensidig modulere hverandre [27]. Enten fibroblast eller leukocytter stede i humane tumor microenvironments forbedre og /eller undertrykke svulster gjenstår å bli etablert [28], [29]. Ved å tappe, funksjonelt inhibering eller aktivering av spesifikke undergrupper av celler i tumor-avledede celleaggregater før inokulering i NSG mus effekt på innpoding og påfølgende intra-abdominale spredning og metastasering inn i den ekstra-abdominal pleurahulen kan bestemmes, og dermed etablere hvilke celler i svulsten mikromiljøet bidrar til svulst arrest eller forbedring av tumorprogresjon.
Eggstokkreft er oftest asymptomatisk i en tidlig fase som de fleste pasienter har utbredt sykdom ved diagnosetidspunktet [30]. Ny innsikt i patogenesen og opprinnelsen til serøs eggstokkreft kan til slutt føre til en tidligere diagnostisering av denne sykdommen. Økende bevis har indikert at de fleste eller alle høyverdige serøs ovariekarsinomer opprinnelse i egglederne [31], [32]. Forhøyede serumnivåer av CA125 (en svulst markør protein) finnes i 90% av pasienter med avansert stadium eggstokkreft, men relativt få pasienter med stadium I sykdom er CA125 positive. Tilsvar mus inokulert i.p. med tumor-avledede celleaggregater viser ingen kliniske tegn på tumor i minst 80 dager ved forhøyede CA125 nivåer i sera ble først oppdaget. Serumet CA125 nivå så raskt økt rekkende nivåer som overskrider 500 enheter /ml etter dag 100 post inokulasjon. På denne tiden og utover musene viste en patologi i samsvar med Stage IIIc og IV av eggstokkreft, dvs. bevis for intra-abdominal spredt i flere organ nettsteder, diaphragmatic implantater, utvikling av tumor ascites og ekstra-abdominal spredning i pleurahulen med metastaser til lungene [7].
Så mens CA125 nivåer er en pålitelig indikator for tilstedeværelse og utvidelse av ovarietumorer hos pasienter og i vår humanisert musemodell, er det ikke egnet for tidlig svulst deteksjon i enten pasienter eller i mus inokulert med tumor-avledede celleaggregater. Imidlertid er serumnivået av CA 125 i dag brukes effektivt til å overvåke ovarialcancer pasientenes respons på kjemoterapi og kirurgi [8]. Dette biomarkør har også blitt brukt som en prognostisk indikator for ovarian kreftpasienter. Vi forventer at serum CA125 nivåer vil også være et svært nyttig kvantifiserbare markør for å overvåke periodisk og sammenligne
in vivo
terapeutiske effekter i vår humanisert musemodell.
Den forbedrede evne til små aggregater av svulsten og ikke-maligne tumorceller for å etablere, vokse og spre seg inne i bukhulen (sammenlignet med faste ikke-forstyrret stykker av tumorvev) kan avhenge av evnen til små celleklynger til å overleve i første omgang til en tilstrekkelig vaskulær tilførsel er etablert for å tillate svulstvekst . Suksessen til innpodingen av tumor-avledede celleaggregater kan også delvis avhenge bidraget av biologisk aktive faktorer fremstilt av ikke-maligne celler i celleaggregatene som produserer tumorvekstfaktorer og stimulerende midler til angiogenese. Tumormasser oftest forekommer først i den kraniale områder av bukhulen nær og innenfor omentum. Posisjonen til tumorknuter, så vel som den forbedrede veksten av celleaggregater og langsom progresjon av svulstene til andre organer kan resultere fra den innledende feste av tumorcelleaggregatene til høyt vaskulariserte områder innen omentum kalles melkeaktige flekker. Disse adskilte områder ble først gjenkjent av Ranvier [33], og har vist seg å være områder hvor tumorer festes preferensielt og proliferere etter i.p. injeksjon av flere forskjellige murine tumorcellelinjer og en human ovarial tumor cellelinje i mus [34], [35].
