Abstract
Bakgrunn
Mange viktige biologiske prosesser som blir styrt via celle-celle-interaksjoner blant koloniseringen av metastatiske tumorceller og kontroll av differensiering av stamceller i sin nisje. Til tross for den avgjørende betydningen av mobilnettet miljø i å regulere cellesignalering,
in vitro
metoder for studiet av slike interaksjoner er vanskelige og /eller indirekte.
metodikk /hovedfunnene
Vi rapporterer om utviklingen av en bildebasert metode for å skille to celletyper dyrket i coculture. Videre er celler av en type som er i direkte kontakt med celler av en andre type (tilgrensende celler) kan analyseres separat fra celler som ikke ligger innenfor en enkelt brønn. Endringer er evaluert med befolkningsstatistikken, som er nyttige i å oppdage subtile endringer over to populasjoner. Vi har brukt dette system for å karakterisere endringene i LNCaP prostata carcinoma-cellelinjen når dyrket i kontakt med humane vaskulære endotelceller (HUVECs). Vi finner at de uttrykk og fosforylering av WWOX er redusert i LNCaP-celler når de dyrkes i direkte kontakt med HUVECs. Redusert WWOX signalering har vært assosiert med redusert aktivering eller ekspresjon av JNK og p73. Vi finner at p73 nivåer er også redusert i LNCaP celler dyrket i kontakt med HUVECs, men vi gjorde ikke observere en slik endring i JNK nivåer.
Konklusjon /Betydning
Vi finner at metoden beskrevet er statistisk robust og kan tilpasses til en lang rekke studier hvor cellefunksjon eller signalisering blir påvirket av heterotypic celle-celle-kontakt. Ironisk nok en potensiell utfordring til fremgangsmåten er den høye grad av følsomhet er i stand til å klassifisere hendelser som statistisk signifikant (på grunn av det høye antallet celler evaluert enkeltvis), når den biologiske effekt kan være mindre klar. Metodikken vil være best anvendes i forbindelse med andre metoder for å evaluere den biologiske rolle av potensielt små forskjeller mellom populasjonene. Men mange viktige hendelser, for eksempel etablering av en metastatisk svulst, skje gjennom sjeldne, men viktige endringer, og metoder som vi beskriver her kan brukes til å identifisere og karakterisere bidraget av miljøet til disse endringene.
Citation: Lapan P, Zhang J, Hill A, Zhang Y, Martinez R, Haney S (2009) Bilde-Based Assessment of Vekst og signal endringer i kreftceller mediert av direkte Cell-Cell Contact. PLoS ONE 4 (8): e6822. doi: 10,1371 /journal.pone.0006822
Redaktør: Andreas Bergmann, University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 20 april 2009; Godkjent: 13 juli 2009; Publisert: 31 august 2009
Copyright: © 2009 Lapan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kompleks sykdom som ofte karakteriseres som. feilregulert vekst [1]. Mens roten av cancer celleproliferasjon er et resultat av et tap av vekst og cellesyklusregulerende kontrollen i kreftcellene, endringer i måten kreftceller kommuniserer med det omgivende miljø er også avgjørende for tumorutvikling og klinisk kreft [2], [3]. Disse inkluderer proliferative og invasive signaler som overføres fra stromale celler og proangiogenic signaler fra kreftceller til endothelium. Disse interaksjonene mellom kreftceller og deres miljø har vært vanskeligere å karakterisere og målrette for terapeutisk intervensjon enn iboende endringer i kreftceller, siden
in vitro
modeller av celle-celle interaksjoner er vanskelig å etablere og standardisere, spesielt på skalaen nødvendig for narkotika screening. Til tross for disse vanskelighetene, har samspillet mellom kreftceller og deres omgivelser vist seg å være en effektiv strategi for behandling av kreft [4], og derfor økt fokus på hvordan kreftcellene fungerer som svulster er et viktig problem.
Metoder for
in vitro
studie av kreft celle interaksjoner med stromale og endotelceller har blitt utviklet, for eksempel hvordan kreftceller induserer angiogenese og rekruttere makrofager [5] – [8]. Beslektede fremgangsmåter tillater studiet av intercellulære signalering gjennom en coculture fase for å indusere parakrin og heterotypic kontaktavhengige endringer, etterfulgt av separering av celletyper for kvantitering av transkripsjonen profilering, western blotting eller beslektede metoder. Evnen til å oppdage endringer i prøvene dyrkes i direkte coculture, blandet monokultur (gjennom bruk av innstikk eller relaterte fysiske barrierer), og standard monokultur ved hjelp av kondisjonert medium tillate slike prosesser skal kunne knyttes til bestemte nivåer av interaksjoner. Mens verdifull, disse systemene bære begrensninger ved å stole på svarene som må i gjennomsnitt over hele prøven for hver behandling, og vanligvis innebære betydelig behandling for å skille de celletyper etter direkte coculture å generere homogene prøver for profilering eller relaterte analyser. Integreringen av kvantitative fluorescens mikroskopi (High innhold Screening, eller HCS) i tidlig drug discovery prosessen og biologisk grunnforskning [9] – [11] tilbyr metoder for å forbedre coculture studier ved å tilrettelegge direkte måling av morfologi, spredning og cellulær signalisering i celler dyrket i direkte kontakt med forskjellige celletyper.
Vi har utviklet og testet en algoritme for kvantifisering av endringer i epiteliale kreftceller dyrket i direkte kontakt med endotelceller. Fremgangsmåten identifiserer celletype og plassering for å bestemme nærhet av endoteliale celler til kreftceller, og quantitates cellulære funksjoner, inkludert celle helse og graden av aktivering av signalveier for celler tilstøtende til endotelceller og sammenligner disse funksjonene til epitelceller som er ikke- -adjacent til endotelceller. Prosessen kan reverseres, for å karakterisere endringer i endotelceller som følge av interaksjoner med kreftceller. Effekten av kreftceller på endotelceller kan måles ved å sammenlikne disse to grupper innen den samme prøven uten å separere celler. Vi demonstrere tilnærming ved hjelp av prostata og bryst kreft celler, og validere metoden ved å demonstrere at genuttrykk endringer identifisert i transkripsjons profilering studier er observert i prøver studert med metodene beskrevet.
Materialer og metoder
Cells, media, reagenser og kultur vilkår
HUVEC celler ble kjøpt fra Cambrex (Cat #: CC-2519) og vedlikeholdes i EBM-2 medium (endotelcelle vekstmedium: CC-3162 med 2% FBS) , HUVEC-celler ble dyrket i ikke mer enn ti passasjer. Den prostatakreft linje LNCaP (ATCC, Manassas, VA) ble dyrket i RPMI 1640 supplert med glutamat, ikke-essensielle aminosyrer, penicillin-streptomycin og 10% FBS (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA).
Mus anti-CD31 (Cat #: 550 389) var fra BD Pharmingen (San Diego, California), mus anti-CDw75 (IgM) (Cat #: ab9515-500) var fra Abcam (Cambridge, MA), Kanin anti WWOX (28- 42) (Cat #: AP1008) var fra Calbiochem /EMD Chemicals (Gibbstown, NJ), Rabbit anti- (pThr33) WWOX (Cat #: AP1009), var fra Calbiochem /EMD Chemicals, mus anti p73 (Cat #: 32- 4200) var fra Zymed /Invitrogen, mus anti-c-Jun (Cat #: OP55) var fra Calbiochem, mus anti-JNK1 (Cat #: MAB17761) var fra R anti-WWOX, anti-pWWOX, anti-P73, anti-c-Jun, anti-JNK1 ble alle anvendt i en fortynning på 1:100. Etter tre PBS vasker, Alexa-merket sekundære antistoffer (Molecular Probes /Invitrogen) ble tilsatt ved en 1:200 fortynning og DAPI ble lagt inn i flekken kjerner, som indikert i figuren legender.
coculture, separasjon og RNA forberedelse for transkripsjon Profilering
LNCaP og HUVEC celler ble utvidet separat i T75 kolber. HUVECs ble dyrket til 70% konfluens, ved hvilket punkt 7 x 10
5 LNCaP-celler ble sådd, og cellene ble dyrket i EBM2-2% FBS i 48 timer. Cellene ble trypsinisert og resuspendert i 1 ml (til en T75-kolbe) iskald PBS /0,1% BSA ( 4 x 10
6 celler /ml), 25 ul CD31-bundet Dynabeads (4 x 10
8 kuler /ml) (Invitrogen: 111-55D) ble tilsatt, blandet godt og inkubert ved + 4 ° C med forsiktig vipping og rotasjon i 20 min. 1 ml iskald PBS /0,1% BSA ble tilsatt, og prøven ble plassert på en Dynal MPC (Magnetic Particle Concentrator, Invitrogen) i 2 min for å sedimentere kulene. Supernatanten, som inneholdt LNCaP-celler, ble lagret hver for seg, og kulene ble resuspendert i 1 ml iskald PBS /% 0.1BSA på nytt, og supernatanten ble fjernet og lagret. Vaskeprosessen ble gjentatt 4 ganger og supernatantene ble slått sammen. Bassenget ble spunnet ned og pelleten ble merket LNCaP fraksjonen og perlene ble merket som HUVEC fraksjon. RNA lyseringsbuffer ble tilsatt til begge fraksjoner og RNA ble renset ved anvendelse av en Qiagen miniRNA-sett (Valencia, CA). mRNA-prøver ble fremstilt og bearbeidet for transkripsjonen profilering ved hjelp av Affymetrix U133A GeneChips som tidligere beskrevet [12].
Proximity algoritme
Cell cocultures er farget med DAPI, som vil farge kjerner av alle cellene , og en andre celletype spesifikk flekk. Vi bruker enten CD44 å identifisere HUVEC celler eller CDw75 å identifisere LNCaP celler. Fluorescens er kvantifisert ved hjelp av en Cellomics VTi høyt innhold skanner. Bilder ble analysert i CellProfiler [13], forutsatt at x-y-koordinat plassering av en kjerne i et gitt bilde. Ved hjelp av de nukleære x-y-koordinater, kan x- og y-avvikene av en celle fra en annen celle beregnes. Disse forskyvninger gir lengden av sidene av en rettvinklet trekant.
Avstanden d mellom de to kjernene beregnes ved hjelp av disse forskyvninger og den pytagoreiske læresetning, whereand er x avstanden mellom x
1 og x
2 og er y avstanden mellom y
1 og y
2. Hvis avstanden d er mindre enn den midlere diameter av cellene, blir de to cellene antas å være ved siden av hverandre. I motsetning til dette, dersom avstanden d er større enn den midlere diameter av cellene, blir de to cellene anses å være ikke-tilstøtende. Den midlere diameter av cellene ble bestemt ved tabulerer de «MajorAxisLength» og «MinorAxisLength» verdier som ble beregnet ved CellProfiler for et sett av referansebilder.
atomavstand, og CDw75 farging eller CD44-farging ble deretter anvendes for å bestemme hvilke HUVEC celler som var i kontakt med en LNCaP cellen gjennom den følgende prosess. Det første trinnet omfatter identifisering alle celler i den totale coculture befolkningen bruker atom flekken DAPI. Det andre trinnet er å dele befolkningen i alle celler i to subpopulasjoner, vil disse cellene som flekker med CD44 (HUVEC) og de som flekken med CDw75 (LNCaP). Endelig er det tredje trinnet for ytterligere å dele opp epiteliale populasjon i to subpopulasjoner, disse LNCaP-celler i tilknytning til en celle HUVEC og de som ikke er tilstøtende til en HUVEC celle. En liste over alle LNCaP celler (CDw75 positive eller CD44 negative) og HUVEC celler (CDw75 negativ eller CD44 positive) ble bygget. Pythagorean avstand for hver LNCaP celle sammenlignet med hverandre HUVEC celle ble kalkulert. De avstander som er mindre enn den midlere diameter av en LNCaP cellen ble merket som LNCaP-celler ved siden av HUVEC-celler.
KS-statistikken
tilstøtende og ikke-tilstøtende subpopulasjoner av celler ble identifisert ved hjelp av den tidligere beskrevne nærhet algoritme. Intensiteten av et antigen av interesse ble sammenlignet på tvers av disse to populasjonene ved hjelp av ks.test funksjon i R programmeringsspråk (www.r-project.org). En tosidig ks.test p-verdi på mindre enn 0,05 ble brukt til å antyde at de to undergruppe distribusjoner ikke kom fra den samme overordnede fordeling.
Mosaic analyse av tilstøtende og ikke-tilstøtende LNCaP celler
For de data som er vist i figuren, ble vurdert to brønner. Fra disse to brønner, 3428 LNCaP-celler var tilgjengelig, og kategorisert som enten tilstøtende (655) eller ikke-tilstøtende (2773). Fra disse cellene, ble alle mulige 655 tilstøtende celler valgt, og 1000 ikke-tilstøtende celler ble tilfeldig prøve av. For å gjøre en firkantet mosaikk, ble de første 625 celler fra hver av disse prøver vises i en 25 x 25 matrise av bilder. Hver celle bildet var en 10 × 10 piksler kvadrat, sentrert om (x, y) koordinater i en celle. Channel 3 bilder (p73) ble vist ved hjelp av fargekartet standard HSV, med faste farge grenser 12-bits (intensiteter fra 0-4096), slik at intensitetskalaer var de samme for alle bilder.
Resultater
Utvikling av en bildebasert metode for studiet av endotelceller i direkte kontakt med kreftceller
Gjennom indirekte immunfluorescens av celletypespesifikke antigener, har vi vært i stand til å identifisere betingelser som tillater cellene ulik opprinnelse skal merkes for HCS. Betingelser for å spesifikt merking av HUVEC-celler er allerede beskrevet, ved bruk av antistoffer som er spesifikke for PECAM, eller CD31 [14]. En slik merking benyttes for flowcytometri-baserte studier og som sådan er det var en høy sannsynlighet for at en slik deteksjon ville være mulig i et vedheftende kultursystemet. Antistoffer ble oppnådd fra kommersielle kilder og med minimale screening fiksering og fargingsbetingelser ble bestemt. Et bredt utvalg av kandidat markører er tilgjengelig for påvisning av prostata carcinoma celler, særlig prostataspesifikt antigen (PSA) og prostata-spesifikt membran antigen, som begge er klinisk relevante for prostatakreft (selv om PSA i seg selv er et utskilt protein, dets produksjonen kan bli oppdaget i løpet av prostatakreftceller) [15]. Andre kandidat markører tumorantigener som vanligvis viser svært begrenset uttrykk (vanligvis til foster eller begrenset typer voksen vev). Et eksempel fra denne sistnevnte kategori er CDw75, en celleoverflate markør for B-celle-lymfocytter som er produsert av et beta-galactosid a-2,6-sialyl-transferase [16]. Ekspresjon av CDw75 antigener har blitt observert i mange epiteliale kreftformer, slik som mage, tykktarm og [17], [18]. I en skjerm av kandidat markører for påvisning av prostata carcinoma celler i coculture med endotelceller, har vi funnet at CDw75 var en spesifikk markør for alle tre prostatakreft-cellelinjer som ble studert. Coculture eksperimenter viste at celletyper kan være lett og definitivt identifisert ved hjelp av antistoffer mot disse markørene.
Etter identifisering av spesifikke celletyper i coculture, vi søkt å identifisere celler som er i heterotypic kontakt. Vår måte å gjøre dette var å identifisere alle celler etter type og plassering, og deretter utvikle en metode for å analysere celler i grupper på tilstøtende og ikke-tilstøtende celler med respekt cellene der målgruppen er i coculture med. HCS er meget multiparametric, fange mellom et dusin, og mer enn 100 funksjoner per celle [10], [11], [19]. Grunnleggende trekk omfatter DNA-innhold, størrelsen og formen på kjernen. Andre funksjoner er avhengig av metodene som brukes til å merke cellene, og kan omfatte målinger av cytoskjelettet, organeller, eller spesifikke proteiner og deres lokalisering og fosforylering status [20]. Innenfor rammen av denne studien, har vi utviklet betingelser for å detektere de enkelte celler og deres ekspresjon av enten CD31 eller CDw75 antigener, og deres plassering i feltet. Den siste funksjonen tillater oss å bestemme nærhet av to celler til hverandre. Identifiseringen av en celle som grenser kan strengt definert ved avstanden mellom kjernene i en kreftcelle til en endotelcelle. Som sådan, kan cellene bli separert i tilstøtende og ikke-tilstøtende, og forskjeller mellom disse to gruppene kan bestemmes.
Algoritmen som har blitt brukt for å identifisere tilstøtende og ikke-tilstøtende LNCaP-celler, i forhold til HUVEC-celler, som vist i figur 1. i figur 1 A, LNCaP-celler, merket med et anti-CDw75-antistoff i rødt, blir sådd med HUVECs, farget med et anti-CD44-antistoff i grønt. Intensiteten av CDw75-baserte fluorescens blir registrert for hver celle i felten. Hver celle er nummerert, og intensiteten for hver celle er vist i figur 1B. Fra denne måling, kan cellene bli kategorisert som enten kreft eller endotelceller. I tillegg til den CDw75 flekker, kan andre egenskaper forbundet med cancerceller bli brukt på dette trinn, inkludert DNA-innhold (mange cancercellelinjer, inkludert LNCaP er aneuploid og har betydelig høyere DNA-innhold enn primære celler). Disse dataene kan bli inkludert med antigenet intensiteten til vurdering celler som kreft eller ikke, eller i noen tilfeller kan brukes som en enkelt parameter for denne bestemmelse (data ikke vist). Når cellene er blitt identifisert, er deres romlige informasjon som brukes til å kartlegge hver celle til dens plassering. Etter å ha identifisert hver celle som LNCaP eller HUVEC, som hver celle er da kanten for de celler som er i nærheten av den, idet grensen avstand satt av den midlere diameter av cellene. Celler av en type, LNCaP i dette eksempel, er derfor videre er definert som i tilknytning til HUVEC eller ikke. -Celler er identifisert som grenser er vist skjematisk i figur 1C i gul, eller ikke-tilstøtende, i rødt. HUVEC-celler er vist som grønn. Fra dette tidspunktet, kan kvantitative data bli ekstrahert og analysert for de to undergrupper av LNCaP-celler. Forskjeller mellom disse undergruppene er tegn på en reaksjon på direkte kontakt med HUVEC celler.
coculture av LNCaP celler og HUVECs er LNCaP celler merket med anti-CDw75 antistoffer og vist i rødt, HUVECs er merket med anti-CD44 antistoffer, i grønt. A. Et eksempel felt bilde. B. Kvantifisering av CDw75 fluorescens som brukes for å karakterisere celler som enten LNCaP (høy intensitet, rød) eller HUVEC (lav intensitet, grønn). C. Kartlegging LNCaP celler og HUVECs. Steder kan sammenlignes med celler i panel A. Cellene er identifisert som tilstøtende LNCaP i gult og ikke-tilstøtende LNCaP celler i rødt og HUVECs i grønt.
En stor utfordring å utvikle en nærhet algoritme for HUVECs kan ses på figur 1C. Heterogeniteten i både størrelse og form av cellene som gjør det vanskelig å tilordne en avstand mellom to celler basert på plasseringen av kjernen. Tildeling av en avstand fra en kjerne som representerer en gjennomsnittlig radius for cellekroppen uriktig fremstilling samspillet mellom mange celler. Celler som varierer i størrelse, eller er betydelig langstrakte, ikke kan tas opp i de fleste aktuelle bildeanalysealgoritmer. To praktiske spørsmål er (a) hvilke tiltak kan iverksettes for å minimere effekten av variasjon i cellestørrelse, og (b) hvor mye feil kan algoritmen tåler før en effekt kan ikke observeres? Effekten av å endre måten cellene er belagt ble undersøkt ved, ble den samlede virkningen av variasjonen av coculture plating forholdene på robustheten i tilnærmingen generelt vurdert i analysen delen senere i denne studien.
Kandidat gener i endotelceller som viser endringer i uttrykk nivåer når dyrket med kreftceller
Flere studier har blitt publisert som beskriver endringer i genuttrykk nivåer i kreftcellelinjer dyrket i coculture [21] – [25]. Hvert system har identifisert spesifikke signalveien hendelser, både kreft og stromale celler, som utløses av celle-celle kontakt. Vi har søkt å identifisere endringer i cellelinjer vi bruker i disse studiene som den mest robuste kilde av kandidatproteinene som skal brukes for å validere system har vi beskrevet. Vi brukte seeded LNCaP prostata carcinoma celler og HUVEC endotelceller som coculture system for å utvikle en liste over kandidatgener for valideringsstudier. Dette ble oppnådd ved hjelp av tradisjonelle metoder for direkte coculture, veksten av celler for en bestemt tidsperiode, etterfulgt av en mekanisk separasjon av de to celletyper. Nærmere bestemt har vi brukt CD31-konjugerte perler til hurtig og kvantitativt skille endotelceller fra prostata carcinoma-celler, etter trypsinering av den blandede kultur. Evnen av perlene for å separere de to celletypene ble karakterisert ved immunfluorescens og ved RT-PCR. De to prøver av celler ble undersøkt ved indirekte immunofluorescens ved hjelp av CD31-antistoffer, og det ble vist at cellene adskilt av perlene var faktisk CD31 positive, mens de celler som ikke er bundet av perlene var CD31 negative. Disse resultatene indikerte at metoden var i stand til kvantitativt å separere de to celletypene følgende coculture.
Transkripsjonelle endringer som oppstår i LNCaP-celler etter coculture med HUVEC celler ble identifisert ved hjelp av oligonukleotid-matriser, som sammenligner veksten av cellene i coculture med HUVEC celler og etter vekst som en mock coculture; monokultur-celler ble behandlet med vulsten-baserte separasjons protokoll på en måte som er identisk med den faktiske coculture prøvene. Før fullstendig transkripsjonen profilering av oligonukleotid-mikromatriser, sjekket separering av celletyper ved RT-PCR av tre gener uttrykt i endotelceller. Dataene er presentert i figur 2. Her er resultater for tre gener vist for coculture og mock prøver. De tre gener, PECAM /CD31, KDR /MET og VE cadherin er uttrykt godt i HUVEC-celler, men dårlig i LNCaP-celler, som vist i monokultur (mock) forsøk på figur 2. Data fra coculture prøvene viser elimineringen av HUVEC celler fra LNCaP-celler i supernatantene til å være i det vesentlige fullført. Derfor har vi vært i stand til kultur LNCaP celler med HUVEC celler, og deretter skille celletyper for transkripsjonen profilering analyse.
RT-PCR analyse av entothelial gener i prøver av mono og coculture etter en separasjon av cellen typer. -Celler dyrket som monokulturer, enten endotelceller eller prostataceller, ble behandlet på en måte identisk med den som brukes til å separere celler etter coculture. Celler utvinnes ved å binde seg til maur-CD31-konjugert perler og pelletert. Expression data for hvert gen /tilstand er rapportert som sitt uttrykk nivå i forhold til kontrollgenet (β-2-makroglobulin) for hver prøve. Circles: pellet; Triangles: supernatant [avhengig av tidsskriftet, kan de ønsker denne informasjonen i en legende; Den opprinnelige figuren har en legende]
Transkripsjonell profilering identifisert 44 gener som ble oppregulert ved coculture med HUVEC celler, og 4 gener som ble nedregulert, vist i Tabell 1. Fire gener ble identifisert av to kvalifiseringskamper hver på oligonukleotid arrays, MOBK1B, SASH1, TGOLN2 og WIPI49; redundante kvalifiseringer ble fjernet fra listen. Fra kandidat gener på denne listen, vist vi kommersielle leverandører for antistoffer som spesifikt vil identifisere målene ved Western blotting og indirekte immunfluorescens. I mange tilfeller kommersielle antistoffer var ikke tilstrekkelig spesifikk, som bestemt ved både Western blotting og HCS. Vanligvis antistoffene enten ga en signifikant kryssreagerende band i Western blot eller ikke viser en titrerbar farging i et cellulært mønster forventet for antigenet. Dette var tilfellet for TNFRSF19, som hadde den mest dramatiske endringen i mRNA uttrykk nivåer. Imidlertid, i tilfelle av WWOX, identifisert som nedregulert ved celle-celle-kontakt i LNCaP-celler, var vi i stand til å identifisere og validere passende reagenser. WWOX har blitt godt karakterisert som en tumor suppressor, følgende studier som dets ekspresjon blir ofte tapt som et resultat av translokasjoner i det skjøre området FRA16D [26], [27], inkludert prostata-kreft [28]. Selv om uttrykket er tapt i mange kreftformer, kan dens uttrykk ofte observeres i mange kreftcellelinjer [29]. WWOX er fosforylert ved Thr-rest 33 i respons til behandling med TNF-α og hyaluranidase [30]. Fosforylert WWOX vil da aktivere p53, men dette induksjon av apoptose er undertrykt av JNK1, blant annet gjennom en direkte tilknytning til WWOX [31]. Som sådan, ville redusert WWOX uttrykk også dempe apoptose følge av eksponering for utenlandske miljøer, for eksempel pre-metastaser før etablering av ny tumorvekst. Identifiseringen av betydelig redusert uttrykk for WWOX i LNCaP celler ved kontakt med HUVECs presenterer en biologisk relevant prosess som kunne analyseres i det systemet vi beskrive.
Påvisning av endringer i signaloverføringsveier i prostata carcinom celler som følge av celle-celle kontakt
for å teste responsen WWOX nivåer for å coculture, metodikken som trengs for å bli endret. Nærmere bestemt er fremgangsmåten for tiden ikke er robust i fire kanaler, på grunn av spektral overlapping i det blå til orange utvalg av spektrene og noen svakhet i intensiteten i det røde området. Som sådan, merking av en antigen som trengs for å bli utelatt for å inkludere WWOX. Vi prøvde å utelate CD31 antigenet og teste om CDw75 flekker var nok til å skille mellom LNCaP celler og HUVECs. Monokulturer og cocultures ble evaluert for å bestemme fordelingen av CDw75 fargenivåer i hver celletype, og for å bestemme det punkt ved hvilket HUVECs begynte å bli kalt som LNCaPs. Utvalget av nivåene for de to celletyper var lik det som ble observert i den innledende fase av undersøkelsen (figur 1), hvor LNCaP-celler viste et bredt spekter av flekker, men bare noen få celler per felt ble farget lett nok til at de kan bli klassifisert som HUVECs, og derfor er denne fremgangsmåte for å skjelne de to celletypene først robust nok til å gi rom for farging av WWOX eller fosfo-WWOX også. Identifiseringen av celletyper og kvantifisering av WWOX nivåer er vist i figur 3. Forening av signaliserings intensiteter med riktig celletypen ble forbedret i forhold til innledende studier (beskrevet ovenfor) ved å begrense antallet av celler belagt, særlig for HUVECs.
LNCaP-celler og HUVECs i coculture ble merket ved anvendelse av (panel A) DAPI, for å identifisere kjerner, (panel B) anti-CDw75-antistoffer, for å identifisere LNCaP-celler, og (panel C) anti-WWOX antistoffer. I panelet D, blir cellene klassifisert som HUVEC vist som røde firkanter, tilstøtende LNCaP celler som gule firkanter og ikke tilstøtende LNCaP celler som blå firkanter.
For å teste bildebasert tilnærming vi har utviklet, vi undersøkt om endringene i WWOX uttrykk vi identifiserte i transkripsjons profilering studier kan rekapitulert i LNCaP celler i det systemet vi har beskrevet ovenfor. WWOX proteinnivåer i LNCaP-celler i tilstøtende og ikke-tilstøtende celler ble sammenlignet. Flere brønner ble anvendt for å dyrke LNCaP-celler og HUVECs og ble deretter fiksert og farget med DAPI og antistoffer mot CDw75 og enten WWOX eller fosfo-WWOX. LNCaP-celler ble bestemt til å være enten tilstøtende eller ikke tilstøtende til HUVECs og analysert for målproteinet nivåer. Gjennomsnittlig target protein nivåer og standardavvik ble bestemt. Fra disse data, ble forholdet og p-verdi på target proteinnivåer i tilstøtende og ikke-tilstøtende LNCaP-celler beregnes. Data fra disse sammenligningene er vist i figur 4. Dataene viser at tilstøtende LNCaP-celler har ofte reduserte nivåer av både WWOX og fosfo-WWOX og som differansen blir større, jo større betydning for målingen. Omvendt, brønner ikke viser en forskjell var ikke like robust statistisk. Dette synes å vise at det er ikke alltid mulig å foreta en bestemmelse om hvorvidt direkte kontakt har hatt en effekt, men når vi kan gjøre en bestemmelse, viser resultatene at disse antigenene er lavere i LNCaP-celler som kontakter HUVEC. Wells som ikke klarer å vise en effekt har blitt sammenlignet med de som gjør det, og vi observerer at brønner som ikke klarer å vise en forskjell gjør det som et resultat av for få LNCaP celler blir scoret som tilstøtende, typisk gjennom en ujevn fordeling av celler under plating .
uavhengige bestemmelser, over flere brønner, av forholdet mellom WWOX (sorte firkanter) og fosfo-WWOX (røde firkanter) nivåer i LNCaP-celler som er tilstøtende eller ikke tilstøtende til HUVECs er vist. Hvert punkt representerer en enkelt brønn, hvor ~350 hosliggende og ~1500 ikke tilstøtende LNCaP-celler ble evaluert.
En egen observasjon er at selv om forskjellene i mange brønner er statistisk signifikante (p-verdiene med nedenfor 1 x 10
-3), størrelsen på effekten vises beskjedne. På dette trinn anses vi en annen numerisk test av differansen mellom target proteinnivåene i LNCaP populasjoner. Testen vi brukte var Kolmogorov-Smirnov (eller KS) statistikk. Testen sammenligner to populasjoner som brøk bidrag til den totale mengden av antigen. Resultater for WWOX nivåer er vist i figur 5A og for fosforylert WWOX, som blir mediert av Src, som vist i figur 5B. Forskjellen i de to kurvene viser at LNCaP-celler som grenser til HUVECs ha mindre WWOX protein enn LNCaP-celler som er ikke-tilstøtende til HUVECs når sammenlignet i en rangert liste.
Mengden av WWOX protein (i panel A) og fosfor-WWOX protein (i panel B), er vist for LNCaP celler i tilknytning til HUVECs (i rødt) og disse cellene ikke tilstøtende til HUVECs (i svart). Datapunkter representerer (fosfo) proteinnivåer per celle som de bidrar til den totale antigen intensitet for hele feltet.
Fosforylering av WWOX av Src resulterer i binding til JNK1, p53 og p73 [31 ] – [33], og disse forbindelser har blitt assosiert med redusert apoptose. Redusere apoptose er et viktig skritt i tumorigenesis [2], og er forventet for kreftceller opplever fremmedcelletyper under invasjon og metastasering, og faktisk dette er knyttet direkte til JNK1 funksjon [34]. Siden WWOX og pWWOX nivåene er redusert i tilstøtende LNCaP celler, bestemte vi oss for å undersøke nivåene av c-Jun, JNK1 og p73 også. Resultatene for disse proteinene er vist i tabell 2. De tre proteinene viser varierende grad av følsomhet til nærheten av HUVECs. c-Jun og JNK1 utstillings bare beskjedne effekter som vist av de fleste tester som viser høye p-verdier og forhold nær 1. p73 viser en sterkere effekt, kan sammenlignes med det som ble observert for WWOX og fosfor-WWOX i tidligere analyser.
