Abstract
microRNAs (mirnas) spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser og er nært knyttet til utviklingen av kreft. Faktisk har avvikende ekspresjon av mirnas vært implisert i en rekke kreftformer. I livmorhalskreft, er MIR-203 nivåer redusert, selv om årsaken til denne avvikende uttrykket er fortsatt uklart. I denne studien undersøker vi de molekylære mekanismene som regulerer MIR-203 gentranskripsjon. Vi identifiserer Mir-203 transkripsjon start stedet ved 5 «rask forsterkning av cDNA ender og deretter identifisere MIR-203 promoter-regionen. Promoter analyse viste at IRF1, en transkripsjonsfaktor, regulerer MIR-203 transkripsjon ved binding til MIR-203-promoteren. Vi viser også at Mir-203 mål på tre utranslaterte område av
BANF1
, og dermed downregulating sitt uttrykk, mens MIR-203 uttrykk er drevet av IRF1. MiR-203 er involvert i cellesyklus regulering og overekspresjon av MIR-203 undertrykker livmorhalskreft celleproliferasjon, kolonidannelse, migrasjon og invasjon. Den hemmende effekten av MIR-203 på kreftcellene er delvis mediert av downregulating sitt mål,
BANF1
, siden knockdown av
BANF1
også undertrykker kolonidannelse, migrasjon og invasjon.
Citation: Mao L, Zhang Y, Mo W, Yu Y, Lu H (2015)
BANF1
Er nedregulert ved IRF1-regulert mikroRNA-203 i livmorhalskreft. PLoS ONE 10 (2): e0117035. doi: 10,1371 /journal.pone.0117035
Academic Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, UNITED STATES
mottatt: 15 august 2014; Godkjent: 17 desember 2014; Publisert: 06.02.2015
Copyright: © 2015 Mao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens støtteinformasjon filer.
Innledning
det er anslått at ca 30% av menneskets gener er regulert av miRNAs. Dereguleringen av mirnas kan endre uttrykket nivåer av målgener, noe som resulterer i unormal cellulære prosesser [1]. Nylig har flere studier vist at avvikende uttrykk for microRNAs (miRNAs) er innblandet i en rekke sykdomstilstander og at dette uttrykket er nært knyttet til utviklingen av menneskelige maligniteter [2]. I tillegg har noen mirnas blitt undersøkt som potensielle biomarkører for diagnostisering eller prognose av humane sykdommer [3-6]. Derfor mekanismene som er involvert i miRNA deregulering er et spørsmål om haster og viktig forskning.
Mekanismene som fører til avvikende uttrykk for miRNAs er ennå ikke helt forstått. mirnas er vanligvis transkribert av RNA polymerase II inn i primære mirnas (pri-mirnas), som behandles av drosha til pre-mirnas og deretter videre spaltes ved dicer til korte, modne mirnas [7,8]. Teoretisk kan avvikende uttrykk for miRNAs være forårsaket av ulike mekanismer, inkludert slettinger, presiseringer og mutasjoner som involverer miRNA loci, epigenetiske modifikasjoner og feilregulering av transkripsjonsfaktorer som er rettet mot spesifikke miRNAs. På genomisk nivå, kromosomavvik og epigenetiske modifikasjoner, blant annet mutasjoner, CpG island metylering og undertrykkende histonmodifikasjonene, er ansvarlig for miRNA lyddemping i kreft. På transkripsjonsnivået, mirnas samhandle med transkripsjonsfaktorer og transkripsjons hemmere for å skape en dynamisk balanse som regulerer deres uttrykk [1].
Livmorhalskreft er en av de mest diagnostisert kreft og den ledende årsak til kreft dødsfall i kvinner over hele verden, sto for 9% av nye krefttilfeller og 8% av totalt antall kreftdødsfall blant kvinner [9]. Avvikende miRNA uttrykket har blitt funnet i livmorhalskreft [10-12], og et stort antall avvik miRNA funksjoner har blitt rapportert på verdensbasis [13]. Imidlertid har de fleste studiene fokusert på den avvikende ekspresjon av miRNA, mens de som er involvert i miRNA deregulering mekanismer er mindre rapportert.
MiR-203 er blitt rapportert å være dysregulerte og å fungere som en tumor suppressor i leverkreft, prostatakreft, lungekreft, spiserørskreft, livmorhalskreft og [14-18]; imidlertid, er den mekanisme som fører til den avvikende ekspresjon av MIR-203 ikke helt klart. I denne studien identifiserer vi Mir-203 transkripsjon start hotellet (TSS) ved 5 «rask forsterkning av cDNA endene (5» RACE) og deretter identifisere MIR-203 promotorsekvens. Vi viser at Mir-203 mål 3 «ikke-translatert område (3’UTR) av
BANF1
, og dermed downregulating
BANF1
uttrykk, og at MIR-203 uttrykk er drevet av transkripsjonsfaktoren IRF1 . Vår studie etablerer en lineær signalveien fra
IRF1
til
BANF1
som kan bidra til å
BANF1
indusert tumordannelse i livmorhalskreft. Dette arbeidet bidrar til helhetlig forståelse av mekanismen av HPV-mediert livmorhalskreft progresjon.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Menneskelivmorhalskreft vev og tilstøtende normale cervical vev ble samlet inn fra Shanghai Changhai Hospital (Shanghai, Kina). Alle pasienter gitt skriftlig samtykke, og studien ble godkjent av de etiske komiteer i Shanghai Changhai Hospital og Fudan University (referansenummer 2011-120).
Cell kultur, RNA-molekyler og transfeksjon
Livmorhals cancer-cellelinjer (CaSki og HeLa) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco, USA) inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS, Gibco) hos 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Syntetiske miRNA molekyler, inkludert MIR-203 etterligne, inhibitor og negativ kontroll, ble innkjøpt fra Ambion, USA. De små interfererende RNA mot
BANF1 Hotell og negativ kontroll ble syntetisert ved Genepharma (Shanghai, Kina) [19]. Sekvensene var som følger: siRNA-BANF1, 5′-CCAGGUGCAUUUAAAGAAATT-3 «og kontroll-sekvens, 5′-UUUCUUUAAAUGCACCUGGTT-3». Cellene ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real time PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra vev og celler ved hjelp TRIzol reagens (Ambion, USA) og revers transkribert ved hjelp av PrimeScript RT reagent Kit (Takara, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere som brukes er oppført i S1 tabell. For MIR-203 deteksjon, ble RNA revers transkribert av en spesifikk revers-transkripsjon primer (RT-MIR-203). For mRNA deteksjon, ble RNA revers transkribert av Random 6 mers og Oligo dT primer. SYBR Premix Ex Taq (Takara, Kina) ble anvendt for å kvantifisere moden MIR-203 og mRNA uttrykk ved hjelp av LightCycler 480 II Real Time PCR system (Roche, Tyskland). RNU6B og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble benyttet som interne kontroller for MIR-203 og mRNA-ekspresjon, respektivt. Relative genuttrykk nivåer ble bestemt ved hjelp av delta Ct metoden [20] og uttrykt som gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± standardavvik.
5 «rask forsterkning av cDNA endene (5’RACE)
TSS av MIR-203 primær transkripsjon (fra HeLa-celler) ble bestemt ved hjelp av en 5′-Full RACE kit (Takara, Kina). To mikrogram RNA ble anvendt i hver reaksjon, og HL60 total RNA, som ble levert med settet, ble brukt til å analysere den 5 «ende av det humane
Prohibitin plakater (PHB) genet (PCR-produkt 750 bp) , som fungerte som en positiv kontroll. Nivåene av den MIR-203 primære transkript ble bestemt ved nestet PCR ved anvendelse av ytre og indre primere (S1 Table). Alle reaksjoner ble utført med de samme parametrene som foreslått i manualen. PCR-produktene ble separert ved 1% agarosegel-elektroforese, oppdaget, renset og deretter sekvensert.
Dual-luciferaserapportørplasmid analyser og transkripsjonsfaktoranalyse
3’UTR av
BANF1
ble amplifisert fra humant genomisk DNA fra HeLa celler og klonet inn i psiCHECK-2 reporter vektor (Promega, USA), og mutasjon og sletting av
BANF1
3’UTR ble oppnådd ved SOE PCR (gen spleising av overlapping utvidelse PCR). HeLa-celler ble ko-transfektert med rapportør vektorer og enten MIR-203 etterligne (30 nM) eller miRNA etterligner negativ kontroll (NC, 30 nM). Luciferase-aktivitet ble målt ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega, USA), og resultatene ble uttrykt som normaliserte forholdet av Renilla for ildflue luciferase.
For det MIR-203 promoter reporter assay 744 -bp genomisk sekvens oppstrøms for MIR-203 ble amplifisert ved PCR og klonet inn i pGL3-Basic (Promega, USA) reporter vektor. HeLa-celler ble ko-transfektert med promoteren reporter vektoren og enten pcDNA-IRF1 eller styre plasmid, pcDNA3.1. En Renilla luciferase plasmid, PRL-TK, ble anvendt for å normalisere transfeksjonseffektiviteten. Celler ble lysert ved 24 eller 48 timer etter transfeksjon, og luciferaseaktiviteten ble målt med Dual-luciferase reporter Assay System (Promega, USA). Resultatene er uttrykt som normaliserte forholdet mellom ildflue luciferase til Renilla og er presentert som gjennomsnitt ± SDS fra tre uavhengige eksperimenter.
Western blotting
Cellene ble lysert i RIPA-buffer pluss proteaseinhibitorer ( Millipore, USA). Lysatene ble deretter utsatt for SDS-PAGE, elektrooverført til PVDF-membraner (Millipore, USA), blokkert med 5% fettfri melk, inkubert med antistoffer i 2 timer ved romtemperatur, inkludert anti-beta-tubulin (Abmart, M20005, 1: 2000, Kina), anti-BANF1 (Santa Cruz, sc-33787, 1: 200, USA), HRP anti-kanin (KPL, 4751-1516, 1: 2000, USA) og HRP anti-mus (KPL, 0751- 1809, 1: 2000, USA), og visualisert ved hjelp cECL Detection Reagenser (CWBIO, Kina). Bilder ble ervervet ved hjelp av Gene Gnome Bio Imaging system (Syngene, UK).
Chromatin immunoprecipitation (chip) analyser
chip analysene ble utført ved hjelp av EZ-Magna ChIP One-Day Kromatin Immunpresipitasjon Kit (Millipore, USA) i henhold til bruksanvisningen. Kort, ca 1×10
7 HeLa-celler ble kryssbundet og lysert ved lysis buffer som inneholder proteasehemmer Cocktail II. Chromatin ble skåret ved ultralyd (høy effekt, 10 sykluser på 30 s «på» og 30 s «off»; Bioruptor UCD-300, USA) til en gjennomsnittlig størrelse på 200-1000 bp, og skåret kromatin prøvene ble delt inn i 50 -μl porsjoner. Hver aliquot av kromatin (1×10
6-celle-ekvivalenter av kromatin) ble fortynnet i 450 ul fortynningsbuffer. Fem mikroliter (1%) av supernatanten ble fjernet som «Input», og immunoutfelling antistoff, IRF1 (Abcam, ab26109, 5 pg, UK), og 20 ul protein A-magnetiske kuler ble tilsatt til den gjenværende supernatant. Til slutt, ble immunkompleksene samlet opp, vasket og eluert, og de kryssbindinger ble deretter reversert. DNA ble utvunnet og analysert ved QRT-PCR. Som en negativ kontroll ble normal mus IgG anvendt for immunopresipitering.
celleproliferasjon og kolonidannelse assays
For de celle proliferasjonsanalyser, CaSki og HeLa-celler ble sådd i 96-brønners plater og transfekterte med enten 30 nM MIR-203 etterligne eller negativ kontroll og opprettholdt i full vekstmedier i 7 dager. Cellelevedyktigheten ble vurdert ved hjelp av et MTT-assay. For denne analysen ble cellene sådd ut i triplikat i den samme opprinnelige tetthet, og absorbansen ved 490 nm ble avlest på hverandre følgende dager ved hjelp av en plateleser (BioTek, USA). For kolonidannelse assays, ble 200 celler sådd ut i 24-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i enten 10 dager (HeLa celler) eller 15 dager (CaSki-celler). Cellene ble farget med 0,1% krystallfiolett og tellet hvis kolonien inneholdt mer enn 50 celler. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
In vitro
migrasjon og invasjon analyser
Invasion og migrasjon analysene ble utført ved hjelp av 24-brønns transwell kamre (8 mikrometer porestørrelse polykarbonat membran, Corning, USA) med eller uten 150 ug Matrigel (BD, USA). For migrerings assays, 5 x 10
4-celler i serumfritt medium ble sådd ut i det øvre kammer. For invasjonen analysene, 1 × 10
5 celler i serumfritt medium ble belagt i det øvre kammeret. Medium med 10% FBS ble tilsatt til de nedre brønnene i kamrene. Etter 20 timer (HeLa celler) eller 26 timer (CaSki-celler) inkubering ble cellene fester seg til den nedre membranen fiksert med metanol og farget med 0,1% krystallfiolett. De overførte eller invaderte celler ble talt opp og avbildes med en IX51 invertert mikroskop (Olympus, Japan).
Flowcytometri analyser
Celler ble transfektert med 30 nM miRNA etterligne i 6-brønners plater, den mediet ble endret til neste dag, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i ytterligere 48 timer etter transfeksjon. For celle-syklusanalyse, ble cellene resuspendert i NP40 /PI fargeløsning (0,01 mg /ml propidiumjodid, 0,1% Na-citrat, 0,0564% NaCl, 0,025 mg /ml ribonuklease A, 0,3% NP-40) og inkubert ved 37 ° C i 30 min. Cellene ble så analysert for DNA-innhold ved hjelp av et FACSCalibur Flowcytometer (BD, USA). Cellesyklus-modellering ble utført ved anvendelse av programvaren Modfit.
Statistisk analyse
t-test ble anvendt for å vurdere signifikante forskjeller mellom de to grupper av data i alle hensiktsmessige eksperimenter. En
P
verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Identifikasjon av MIR-203 promoter
For å finne ut om Mir-203 uttrykk er. unormal i livmorhalskreft, ble QRT-PCR utføres på 20 parvise pasientprøver og livmorhalskreft cellelinjer (HPV 16+ CaSki og HPV 18+ HeLa). Som vist på fig. 1A, MIR-203 uttrykk ble vesentlig nedregulert i livmorhalskreft vev og cellelinjer som sammenligner med de tilstøtende normale cervical vev. Men mekanismen av denne nedregulering er fortsatt uklart. For å utforske regulering av MIR-203 uttrykk på transkripsjonsnivået, må vi først bestemt TSS på MIR-203 bruker 5’RACE analyse. Som vist på fig. 1B, det var to 5’RACE PCR-produkter for pri-MIR-203, som foreslo at MIR-203 kan ha minst to TSSs. TSS nær pre-MIR-203 var i overensstemmelse med den som er vist i en tidligere publikasjon [21], og ble merket med en.
(A) Mir 203 uttrykk nivåer i normale humane cervikale vev, livmorhalskreft og vev livmorhalskreft cellelinjer (CaSki og HeLa) ble målt ved QRT-PCR bruker RNU6B som en intern kontroll. (B) 5’RACE PCR resultater viser transkripsjon start områder av menneskelig (HeLa celler) pri-MIR-203. (C) Skjematisk av de antatte bindingssteder av IRF1 i MIR-203 genet promoter. Tallet angir den relative avstanden fra 5′-enden av den primære MIR-203 transkripsjon (indikert som +1). (D) Justering Resultatene viser bevaring av MIR-203 promotersekvenser mellom ulike dyr. (E) MiR-203 promoteraktivitet analyse av dual-luciferase-analyser. Den forutsagte MIR-203-promoteren ble klonet inn i pGL3-basisvektor oppstrøms for ildflue luciferase-genet. Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferaseaktivitet og plottet i forhold til kontrollen (*
P
0,05). Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
Vi deretter utført i silico analyse av MIR-203 promoter-regionen (inkludert 2 kb oppstrøms av pre-MIR-203) ved hjelp av elektroniske verktøy FirstEF, PromoterScan , softberry-fprom, og arrangøren 2,0 Prediction. Disse verktøyene spådd at en 1-kb, GC-rik sekvens (ca. 70%) i nærheten av MIR-203 TSS var arrangøren (Fig. 1C). Vanligvis blir promoter-sekvenser i forskjellige arter konservert. Derfor er innrettet vi den antatte humane promotersekvensen til regionen oppstrøms for forhånds MIR-203 fra mus, rotte, hund og ku og funnet et sterkt konservert region (fig. 1D). Vi antok at dette konservert sekvens var mest sannsynlig promotersekvensen av MIR-203. Deretter, analyserte vi aktiviteten av denne promoteren ved hjelp av luciferase reporter-analyser. Som vist på fig. 1E, sammenlignet med kontrollvektor, den forutsagte promotersekvens økt betydelig luciferase-aktivitet (ca. 17 ganger), noe som indikerer at dette konserverte sekvensen har sterk promoter-aktivitet.
IRF1 er involvert i den transkripsjonelle regulering av speil 203
etter å skanne identifisert MIR-203 arrangøren med TRANSFAC (https://www.biobase-international.com/product/transcription-factor-binding-sites), flere potensielle transkripsjonsfaktorer (AP-1, HSF1, MZF1, IRF1, og SP1) ble spådd. For å validere denne spådommen, undersøkte vi effekten av flere potensielle transkripsjonsfaktorer på MIR-203 promoter-drevet luciferase aktivitet. Blant disse spådd transkripsjonsfaktorer, overekspresjon av IRF1 i HeLa-celler aktiveres betydelig MIR-203 promoter-drevet luciferase aktivitet (Fig. 2A). Videre ble effekten av IRF1 overekspresjon på Mir-203 uttrykk analysert av miRNA QRT-PCR. Som vist på fig. 2B, IRF1 overekspresjon øket endogen modne MIR-203 uttrykk 8-ganger sammenlignet med kontrollvektor. Disse resultatene indikerer at MIR-203 transkripsjon er regulert av IRF1.
(A) Dual-luciferase analysene viser effekten av flere transkripsjonsfaktorer (IRF1, MZF1, AP-1, HSF1, og SP1) på speil 203 promoter aktivitet. Konstruksjonene ble co-transfektert inn i HeLa-celler med vektorer som uttrykker transkripsjonsfaktorer og PRL-TK vektor som transfeksjon kontroll. Villtype pcDNA3.1 plasmid fungert som en negativ kontroll. De relative luciferase-aktivitet er vist som forholdet for ildflue /Renilla luciferase-aktivitet. (B) QRT-PCR-analyser viser effekten av IRF1 overekspresjon på Mir-203 uttrykk. (C) Chromatin immunoutfellingsstudier analyser viser
in vivo
samspill mellom IRF1 og Mir-203 promoter. HeLa-celle kromatin fragmenter ble immunoutfelt med et antistoff for IRF1 eller negativ kontroll-antistoff (normal IgG). DNA-prøver fra immunopresipitatene ble analysert ved QRT-PCR ved anvendelse av primere spesifikke for den MIR-203-promoteren. (D) luciferase-analyser ved anvendelse av de mutante promotor konstruksjoner. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05
Samspillet mellom IRF1 og Mir-203 promoter ble ytterligere bekreftet av Chip QRT-PCR-analyser.. Som vist på fig. 2C,
in vivo
binding av IRF1 til MIR-203-promoteren var signifikant høyere enn den til kontrollgruppen. Å identifisere IRF1 bindingsseter i MIR-203 promotorsekvens, mutert vi den anslåtte IRF1 bindingssteder (Fig. 1C). Som vist på fig. 2D, mutasjon av IRF1 bindingssete 2 (pGL3-mut 2) opphevet virkningen av IRF1 på reporteren, mens muterende bindingssete 1 hadde ingen effekt. Ifølge disse resultatene, regulerer IRF1 uttrykket av MIR-203 ved å binde seg til nettstedet 2 (CACTT).
MiR-203 undertrykker
BANF1
uttrykk ved å målrette den 3’UTR av
BANF1
for å utforske funksjon av MIR-203, vi søkte etter potensielle Mir-203 mål gener ved hjelp av miRNA databaser (TargetScan, Miranda, og miRecords). Som vist på fig. 3A, frøet region av mir-203 er perfekt komplementær til targetsekvensen i 3’UTR av
BANF1
. For å validere dette i silico prediksjon, klonet vi den delen av
BANF1
3’UTR inneholder MIR-203 målområde inn luciferase reporter plasmid psiCHECK-2. Vi utførte en luciferase reporter analysen etter samtidig transfeksjon av reporteren konstruerer med Mir-203 etterligne i HeLa-celler. I nærvær av den MIR-203 etterligne, luciferaseaktiviteten av reporter konstruksjon inneholdende
BANF1
3’UTR ble signifikant redusert, mens den for den ikke-modifiserte konstruksjonen ikke ble forandret (fig. 3B). Videre mutasjon (Mut) og sletting (Del) av MIR-203 frø sekvens både avskaffet MIR-203-mediert reduksjon i luciferase aktivitet (Fig. 3B).
BANF1
mRNA-nivåer ble målt ved QRT-PCR, som viser reduserte nivåer av
BANF1
mRNA i nærvær av det MIR-203 etterligne (Fig. 3C). For ytterligere å bekrefte at
BANF1
er et mål på MIR-203, undersøkte vi den endogene
BANF1
proteinnivå via western blotting etter forbigående trans Mir-203 etterligne og inhibitor i HeLa og CaSki celler . Som vist på fig. 3D,
BANF1
uttrykk nivå redusert som konsentrasjonen av transfekterte MIR-203 ligne ble økt, mens
BANF1
uttrykk nivået øker når cellene ble transfektert med MIR-203-hemmer. Disse resultatene indikerer at MIR-203 kan direkte rettet mot
BANF1
3’UTR og downregulate
BANF1
uttrykk.
(A) Moden MIR-203 sekvenser og gjenkjenningsseter innen den 3’UTR av
BANF1
. Frøet sekvens av MIR-203 er understreket. Villtype (WT), mutert (Mut) og slettet (Del)
BANF1
3’UTR gjenkjenningsseter er også vist. (B) Den relative luciferase aktivitet av konstruksjoner som inneholder
BANF1
WT, Mut eller Del 3’UTRs. Luciferasepreparater konstruksjonene ble co-transfektert med miRNA etterligne negativ kontroll (NC, 30 nM) eller Mir-203 etterligne (30 nM) i HeLa-celler. Renilla luciferase-aktiviteten ble målt 36 timer etter inkubering og normalisert til ildflue luciferase-aktivitet. En stjerne indikerer betydelig nedregulering av pre-MIR-203 sammenlignet med uttrykk for WT
BANF1
3’UTR konstruere. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) QRT-PCR analyse av
BANF1
mRNA fra CaSki og HeLa celler transfektert med miRNA etterligne NC (30 nM) eller Mir-203 etterligne (30 nM). Data ble normalisert til nivået av GAPDH mRNA, og forholdet mellom
BANF1
/GAPDH i den negative kontrollen ble satt til 1. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (D) Western blot analyse av endogen
BANF1
uttrykk i CaSki og HeLa celler 48 timer etter transfeksjon med Mir-203 etterligne eller hemmer. Tubulin fungerte som en lasting kontroll. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (E)
BANF1
uttrykk nivåer i humane normale cervical vev, livmorhalskreft vev og livmorhalskreftcellelinjer (CaSki og HeLa) ble målt ved QRT-PCR, bruker GAPDH som en intern kontroll. (F) Western blot-analyse av BANF1 nivåer i 20 parrede tumorvev (T) og tilstøtende normale vev i livmorhalsen (N). Tubulin fungerte som en lasting kontroll. De fem parede prøver som oppviste ingen forskjeller i BANF1 ekspresjon er angitt med boksene. *
P
0,05, **
P .
0,01
For å finne ut om redusert Mir-203 uttrykk er korrelert med
BANF1
uttrykk nivåer i livmorhalskreft, vi evaluert
BANF1
nivåer i 20 paret livmorhalskreft vevsprøver og deres tilstøtende normale livmorhalsprøver samt i livmorhalskreft cellelinjer (HPV 16+ CaSki og HPV 18+ HeLa) via QRT-PCR.
BANF1
ekspresjon var signifikant høyere i cervical kreft celler og vev enn i normalt vev (fig. 3E). I tillegg, western blot analyse viste at uttrykkene for BANF1 ble forhøyet i 15 ut av 20 sammenkoblet (75%) tumorvev (T) enn i normal (N) livmorhals vev (fig. 3F). De andre 5 parede prøver viste ingen forskjeller i BANF1 uttrykk er angitt med bokser. Disse resultater antyder at den unormale reduksjon i MIR-203 nivåer i livmorhalskreft er knyttet til høy ekspresjon av
BANF1
.
IRF1 regulerer MIR-203 og indirekte påvirker ekspresjonen av
BANF1
for å validere om IRF1 regulering av MIR-203 kan formidle endringer i
BANF1
uttrykk, vi evaluert
BANF1
uttrykk ved QRT-PCR og Western blotting henhold IRF1 overekspresjon. Som vist på fig. nivåer 4A og B, IRF1 mRNA og protein økt betydelig i CaSki og HeLa celler etter celler ble transfektert med pcDNA-IRF1. Interessant,
BANF1
mRNA og proteinnivåer ble redusert i CaSki og HeLa celler transient transfektert med pcDNA-IRF1 (fig. 4C og 4D), som sterkt antyder at IRF1 stimulerer Mir-203 uttrykk, som senere nedregulerer
BANF1
uttrykk.
(A, B) QRT-PCR og Western blot analyse av IRF1 mRNA og proteinnivåer i CaSki og HeLa celler transfektert med pcDNA-IRF1. IRF1 mRNA og proteinnivåer ble betydelig økt når transfektert med pcDNA-IRF1. (C) QRT-PCR analyse av
BANF1
mRNA uttrykk i HeLa celler transient transfektert med kontroll vektor eller pcDNA-IRF1. Dataene ble normalisert til GAPDH uttrykket. (D) Western blot-analyse av BANF1 ekspresjon i CaSki og HeLa-celler forbigående transfektert med pcDNA-IRF1. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P .
0,05
MiR-203 undertrykker livmorhalskreft celleproliferasjon og kolonidannelse
Vi har utforsket de cellulære funksjoner av MIR-203 i livmorhalskreft og funnet at MIR-203 overekspresjon markert undertrykkes veksten av CaSki og HeLa-celler (fig. 5A og B). Tilsvarende ble kolonidannelse kapasitet redusert i CaSki og HeLa-celler når MIR-203 var over uttrykt (fig. 5C og D).
(A, B) Cell proliferasjonsanalyser av CaSki og HeLa-celler transfektert med speil 203 ligne eller negativ kontroll. (C, D) kolonidannelse analyser av CaSki og HeLa-celler transfektert med MIR-203 etterligne eller negativ kontroll. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P .
0,05
MiR-203 er involvert i cellesyklus regulering og undertrykker livmorhalskreft celle migrasjon og invasjon
in vitro
Celler transfektert med MIR-203 etterligne ble underkastet cellesyklusanalyse via strømningscytometri. Som vist på fig. 6A, livmorhalskreftceller som overuttrykker MIR-203 hadde en høyere prosentandel av G1-fase celler og en lavere andel av S-fase celler, noe som tyder på at MIR-203 induserer G1 arrest. I tillegg Transwell analyser med eller uten Matrigel viste at MIR-203 overekspresjon i CaSki og HeLa-celler undertrykkes migrering og invasjon evne sammenlignet med negativ kontroll (NC) celler (Fig. 6B, C, D og E).
(A) Strømningscytometri-analyse som viser virkningen av MIR-203 overekspresjon på cellesyklusen av CaSki og HeLa-celler. Cellene ble transfektert med 30 nM Mir-203 etterligne eller negativ kontroll (NC) og samlet, farget og analysert 48 timer etter transfeksjon. (B, C) Transwell migrasjon analyser av CaSki og HeLa celler transfektert med Mir-203 etterligne eller NC. De migrerte celler ble kvantifisert og representative bilder vises nederst. (D, E) Transwell invasjons analyser av CaSki og HeLa celler transfektert med Mir-203 etterligne eller NC. De invaderte celler ble kvantifisert og representative bildene blir vist. Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P .
0,05
BANF1
knockdown undertrykker celle koloni dannelse, migrasjon og invasjon
For ytterligere å validere om
BANF1
er involvert i MIR-203 mediert kolonidannelse, migrasjon og invasjon, siRNA målretting
BANF1
designet og transfektert inn CaSki og HeLa celler. Resultatene viste at siRNA målretting
BANF1
betydelig redusert
BANF1
mRNA og proteinnivåer i CaSki og HeLa celler (Fig. 7A og B). Som forventet, knockdown av endogen
BANF1
av siRNA resulterte i en signifikant reduksjon i kolonidannelse (Fig. 7C og D). Tilsvarende migrasjon og invasjon evner CaSki og HeLa-celler ble også betydelig redusert med
BANF1
siRNA men ikke av den negative kontrollen (NC) siRNA (Fig. 7E, F, G og H).
(A, B) QRT-PCR og Western blot analyse av
BANF1
nivåer i
BANF1
-knockdown CaSki og HeLa celler.
BANF1
mRNA og proteinnivåer ble betydelig redusert når transfektert med siRNA-BANF1. (C, D) kolonidannelse analyser viste at den gjennomsnittlige kolonidannelse nummer ble redusert i
BANF1
-knockdown CaSki og HeLa celler. (E, F) Cell migrasjon analyser avslører at de migrerte celler ble redusert ved å slå ned
BANF1
. (G, H) Cell invasjon analyser avslører at de invaderte celler ble redusert ved å slå ned
BANF1
. Alle data er representative for tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05
Diskusjoner
Et økende antall studier har vist at mirnas er involvert i ulike fysiologiske prosesser og er assosiert med utvikling av sykdommer. gjennom sin evne til å regulere målgener [22,23]. Regulering av miRNA uttrykket er viktig for å opprettholde celle homeostase; derimot, er de molekylære mekanismene som regulerer miRNA gentranskripsjon ikke godt forstått [24,25]. Regulering av uttrykk på transkripsjonsnivået er et kritisk punkt i miRNA biosyntesen [26].
miRNA gener transkriberes som en enhet eller klynge og kan ligge i enten intergeniske områder eller innenfor introner eller eksoner av gener [ ,,,0],27]. Når mirnas bor i intragenic regioner, kan de bli transkribert uavhengig om de har sine egne arrangører [27], eller de kan bli transkribert sammen med verts genet hvis de mangler sine egne arrangører. Identifikasjon av TSSs og arrangører er avgjørende for å forstå mekanismene og transkripsjonsfaktorer som medierer miRNA uttrykk [28]. Mir-203 genet er lokalisert i en intergeniske regionen og transkribert uavhengig. Vår studie identifisert MIR-203 TSSs av 5’RACE og senere identifisert MIR-203 promotorsekvens.
Å ha flere TSSs er en viktig mekanisme for å øke genet kompleksiteten og bidra til funksjonelle mangfold, et fenomen som har vært godt undersøkt for protein-kodende gener. I komplekse art, er det vanlig for gener for å ha flere forskjellige TSSs som kan være aktiv under forskjellige betingelser [29]. Det har blitt rapportert at den menneskelige miRNA clusteret MIR-23a-MIR-27a-MIR-24-2 og
Drosophila melanogaster
mirnas MIR-276a og MIR-277 har alternativ TSSs [30]. I denne studien identifiserte vi to TSSs for MIR-203. I de fleste tilfeller kan de variable transkripsjoner for hver miRNA produsere det samme modne miRNA [31]. Derfor danner flere transkripsjoner har liten innflytelse på funksjonen til en miRNA. Men spekulerer vi at distinkte TSSs av miRNAs kan ha forskjellige transkripsjons efficacies og kunne regulere uttrykk nivået av miRNAs. Videre forståelse av alternativ spleising kan gi mer informasjon om miRNA genregulering.
Vår studie etablerer en lineær signalveien (
IRF1
til MIR-203 til
BANF1
) (Fig . 8).
IRF1
koder interferon regulerende faktor 1, et medlem av interferon regulerende transkripsjonsfaktor (IRF) familie. IRF1 er redusert i kreft vev og funksjoner i immunrespons, apoptose regulering, DNA-skade reparasjon og svulst undertrykkelse [32-34]. Tidligere studier har bekreftet at MIR-203 regulerer en rekke målgener, inkludert
VEGFA product: [18],
ALB1 product: [35],
PKC
α [16], og
ATM product: [36] (fig. 8). Disse mål gener som er involvert i biologiske prosesser som ligner IRF1.
