Abstract
Olfactory reseptorer (ORS) er uttrykt i olfactory epitel, hvor de oppdager odorants, men også i andre vev med tilleggs funksjoner. Noen ORS er selv overexpressed i tumorceller. I denne studien har vi identifisert ORS uttrykt i Enterochromaffin kreftceller ved RT-PCR, som viser at enkeltceller kan co-express flere ORS. Noen av de reseptorene identifiserte allerede rapportert i andre svulster, men de er foreldreløs (uten kjent ligand), som det er tilfellet for de fleste av de hundrevis av menneskelige ORS. Dermed ble gener som koder for menneske ORS med kjente ligander transfektert inn i disse cellene, som uttrykker funksjonelle heterologe ORS.
in vitro
stimulering av disse cellene med tilhørende OR odorant agonister fremmet celle invasjon av kollagen gels. Ved hjelp av LNCaP prostata kreft celler, stimulering av PSGR (prostataspesifikk G-protein-koblet reseptor), et endogent overuttrykt OR, ved β-ionon, dens odorant agonist, resulterte i den samme fenotypisk endring. Vi viste også involvering av en PI3 kinase γ avhengige signalveien i denne kampanjen av tumorceller invasivitet utløst av eller stimulering. Endelig, etter subkutan inokulering av LNCaP celler i NSG immunsvikt mus,
in vivo
stimulering av disse cellene ved PSGR agonist β-ionone betydelig forbedret metastaseveksten og spredning
Citation. Sanz G , Leray jeg, Dewaele A, Sobilo J, Lerondel S, Bouet S, et al. (2014) Promotion of Cancer Cell Invasivitet og metastase Emergence forårsaket av olfactory Receptor stimulering. PLoS ONE 9 (1): e85110. doi: 10,1371 /journal.pone.0085110
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 24 april 2013; Godkjent: 01.12.2013; Publisert: 08.01.2014
Copyright: © 2014 Sanz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av INRA og CNRS (Nasjonalt senter for Scientific Research (Frankrike). Denne forskningen ble utført i omfanget av LEA EBAM (The European Associated Laboratory (LEA) tittelen «Pulsed elektriske felt applikasjoner i biologi og medisin»). den funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
olfactory reseptorer (ORS) er G protein-koblede reseptorer hovedsakelig uttrykt i olfactory sensoriske nevroner (OSNs) av olfactory epitel, hvor de oppdager og diskriminerer myriader av odorants ifølge en kombinatorisk kode der en OR kan aktiveres av ulike dufter og en odorant kan stimulere ulike ORS [1], [2]. Videre er ORS uttrykt i ikke-lukt vev [3] – [5] hvor de kan spille flere roller. De særlig styrer sperm chemotaxis, regulere migrering og adhesjon av muskelceller, og kontrollere serotonin sekresjon av Enterochromaffin (EC) celler [6] – [10]. Flere studier har også rapportert at enkelte ORS kan være svulst markør, en av dem endrer
in vitro
spredning av LNCaP prostatakreftceller [11], [12], [13], [14].
i særdeleshet kan EC-celler skaffe en tumor fenotype og differensielt uttrykte ORS avhengig av nevroendokrin kreft evolusjon [15]. Bon-celler, en human EC-cellelinje avledet fra en metastase av en pankreatisk karsinom [16], [17], ble beskrevet for endogent uttrykte ORS [8] som kan være tumor markører når den overuttrykkes [15]. Fordi BON-celler ble avledet fra et metastase, utforsket vi hvorvidt aktivering av ORS ved agonist odoranter kan ha en rolle i tumorprogresjon. For å oppnå dette, har vi besluttet å identifisere ORS uttrykt i BON celler. Men agonist eller antagonist dufter spesifikke for BON celler ORS er ukjent, som for de fleste av de hundrevis av identifiserte menneskelige ORS. Vi prøvde derfor å utvikle en modell ved trans disse cellene med deorphanized ORS. Det heterologe uttrykk oppnådd tillatt oss å vurdere
in vitro
invasivitet av disse cellene ved stimulering med odoranten ligand av transfekterte reseptoren. Videre identifiserte vi PI3 kinase γPI3Kγ som en komponent i signalveien indusert av OR stimulering og fremme celle invasivitet. En mer fysiologisk modellen ble også brukt
in vitro
, de LNCaP prostata kreft celler som overuttrykker den PSGR (prostata spesifikt G protein-koblet reseptor), et endogent og deorphanized OR betraktet som en svulst markør, og wich ble beskrevet for å hemme proliferasjonen av disse cellene
in vitro product: [12]. Denne modellen ble så brukt
in vivo
å analysere rollen ORS stimulering i tumorprogresjon, som er i metastaseveksten og spredning.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
dyrene ble håndtert i samsvar med retningslinjene i den franske regjeringen om operative prosedyrer og dyr omsorg. Protokollen ble godkjent av etikk comity for forsøk med dyr som heter «Comité d’Ethique en eksperimentering Animale de l’IRCIV» CEEA-26 (protokoll nummer 2012-043).
Revers transkripsjon (RT) -PCR, kloning og sekvense
Totalt RNA ble ekstrahert ved TRIzol reagens (Invitrogen) og behandlet med DNase I. RT ble utført med «Super Første Strand®, Synthesis System for RT-PCR» sett (Invitrogen).
For enkelt celle RT-PCR, enkeltceller ble samlet ved aspirasjon til et glass pipette og RT ble utført ved hjelp av «enkelt celle Hevet ™ III Cells direkte cDNA Synthesis System» sett (Invitrogen) etter celle avbrudd, protein denaturering og DNAse behandling.
Nøstet PCR ble utført fra 1 mL av RT produkter og bruk av degenererte primere målretting eller konserverte regioner eller primere spesielt rettet OR identifisert med degenererte primere. Degenererte primere sekvensene ble vennlig levert av Stephan Bieri (Givaudan, Sveits). Fravær av genomisk DNA ble kontrollert under anvendelse av human GAPDH eller p-aktin-primere på DNase-behandlede RNA uten revers transkriptase.
PCR-produktene amplifisert med degenererte primere ble klonet inn i pGEM-T vektor (Promega) og sekvensert ved Beckman Coulter Genomics. PCR produktene amplifisert med spesifikke primere ble direkte sekvensert (Beckman Coulter Genomics).
Kjemi
Dufter, ble DMSO og mineralolje (M3516) kjøpt fra Sigma-Aldrich, Fluka eller Acros Organics på høyeste renhet tilgjengelig. AS605240 ble kjøpt fra Euromedex (Selleck, S1410) og Gallein fra Tocris biovitenskap. Parafin (CellWax) ble hentet fra CML, og hemalun, eosin og safran fra RAL.
Pattedyr ekspresjonsvektorer
OR1G1 eller OR17-40 kodende sekvenser ble innført i pCMV-Tag3B pattedyr uttrykk vektor (Stratagene) på en måte som resulterer i sammensmeltingen av en cmyc epitop på reseptoren N-terminus. De resulterende vektorer ble kåret pCMV-TagOR1G1 og pCMV-TagOR17-40.
Cell kultur og transfeksjon
BON celler (kloning # 7) var vennlig levert av Dr Courtney M. Townsend (Institutt for kirurgi UTMB, Galveston, TX 77551, USA) [16], [17]. De ble dyrket i DMEM /F-12 (Ham) uten fenolrødt (Gibco, Invitrogen Corporation) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Perbio) og antibiotika (100 enheter penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml, Invitrogen) , ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2. Cellene ble transient transfektert med pCMV-TagOR1G1 eller pCMV-TagOR17-40 hjelp jetPEI ™ (Polyplus-transfeksjon) i henhold til produsentens instruksjoner. OR ekspresjon på celleoverflaten ble undersøkt ved immunfluorescens-mikroskopi ved å bruke det monoklonale anti-cmyc-Cy3-antistoff (C6594, Sigma-Aldrich) på ikke-permeabilised celler.
LNCaP-celler ble anskaffet fra ATCC (klon FGC, No . CRL-1740 ™) ved passasje 19, og dyrket i RPMI 1640 medium (ATCC, nr 30-2001) supplert med 10% føtalt bovint serum (ATCC, nr 30-2021), ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
Kalsium avbildning
BON og LNCaP-celler ble sådd ut på en 96-brønners dyrkingsplate (svart mikrotiterplate, Greiner Bio-on), henholdsvis ved en tettheten av 10
5 og 0,5 × 10
5 celler per brønn. 24 timer senere ble cellene ladet med 2,5 jiM fluo-4-acetoksymetyl-ester (Molecular Probes), som tidligere beskrevet [18]. Kalsium bildebehandling ble utført ved hjelp av en omvendt epifluorescence mikroskop (CK40 Olympus) er utstyrt med et digitalt kamera (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Ca
2 + reponses ble observert ved 460-490 nm eksitasjon og ≥ 515 nm emisjonsbølgelengder. Datainnsamling og analyse ble utført ved hjelp av SimplePCI programvare (Hamamatsu, Compix). Luktstoffer og mineralolje ble fremstilt ekstemporert ved en første fortynning i DMSO og deretter seriefortynninger inn i Hanks saltoppløsning (Eurobio) supplert med 20 mM Hepes, pH 7,2. Stimuli ble testet ved konsentrasjoner som ikke utløser kalsium-respons i mock-transfekterte celler. 1 uM isoproterenol (Sigma-Aldrich) ble anvendt som en positiv kontroll. Ca
2 + signal ble målt som den relative endringen i fluorescens-intensitet AF /F = (F-F
0) /F
0, hvor F
0 er fluorescensen nivå før stimulering. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet for AF /F på minst tyve celler.
In vitro vurderingen av
celle invasjon
Kollagen type I geler ble fremstilt som beskrevet av de Wever [19]. Celler ble dyrket i 48 timer før poding dem som en suspensjon av enkeltceller avsatt på toppen av kollagen type I geler. For å stimulere ORS, odoranter og mineralolje ble først fortynnet i DMSO og deretter inn i kollagen-oppløsningen eller kulturmediet. Effektene av spesifikke hemmere av PI3Kγ (AS605240) og βγ subenheter av G-proteiner (Gallein) ble også vurdert ved å legge dem til kollagen gel og dyrkingsmedium. For kontroller ble DMSO tilsatt ved samme sluttkonsentrasjon anvendes for å fortynne disse kjemikaliene. Mengden av tilsatt DMSO ikke overstige 0,2%, og ikke endre antall invasive celler sammenlignet med prøver uten DMSO (data ikke vist). 24 timer etter sin seeding, ble invasive celler som presenterer invasive utvidelser inn i kollagen gel og ikke-invaderende celler telles i 10-15 mikroskop felt tilfeldig utvalgte. Resultatene ble uttrykt som prosentandelen av invasive celler (invasjon indeks). Morerover, F-aktin cytoskjelettet ble observert ved anvendelse av rhodamin-konjugert phalloidin (Invitrogen). For dette formål ble cellene fiksert i 20 minutter med 3% paraformaldehyd i PBS ved romtemperatur, og deretter permeabilisert i 15 minutter med 0,5% Triton X-100 i PBS og blokkert i 30 minutter med 2% BSA, 1% glycin i PBS. Celler ble inkubert med rhodamin-phalloidin (1:300) i PBS i 30 minutter ved romtemperatur og vasket grundig med PBS før observasjon med et invertert mikroskop epifluorescens.
Mus
Nod SCID Gamma ( NSG) hannmus ble avlet i dyr bolig fasilitetene på Institut Gustave Roussy, med fri tilgang til mat og vann. Plastmæren var koblet til kontrollerte ventilerte racks. Burene med dyr eksponert for odoranten β-ionone var koblet til et skilt ventilasjonsaggregat.
In vivo
vurdering av celle invasjon og metastaser
LNCaP cellene ved passasje 25 ble inokulert i åtte uker gamle kastrerte hann NSG mus (kastrering ble utført to uker før celle inokulasjon). 10
6-celler ble suspendert i 75 ul RPMI 1640 pluss 75 ul av Matrigel (BD Biosciences) og injiseres med en nål (26G) i den subkutane plass, på 2 steder i hver flanke av musene. Odoranten β-ionon ble først fortynnet i DMSO ved en konsentrasjon på 100 mM, og deretter inn i RPMI + Matrigel blandingen ved sluttkonsentrasjon på 100 uM. DMSO ble også lagt i samme dose til RPMI + Matrigel blanding uten odorant. En første gruppe på fem mus ble inokulert med LNCaP-celler (i nærvær av DMSO) og mottok ingen ytterligere behandling. Fem andre mus ble inokulert med LNCaP-celler (i nærvær av DMSO), og børstet med mineralolje tre ganger daglig i løpet av 6 uker og deretter tre ganger i uken inntil avlivning. En tredje gruppe på 5 mus ble inokulert med LNCaP-celler i nærvær av β-ionon i DMSO. Disse mus ble børstet med 1 mM β-ionon direkte fortynnet i mineralolje tre ganger daglig i løpet av 6 uker og deretter tre ganger i uken inntil avlivning. Før offer, ble noen dyr først undersøkt av tomoscintigraphy (SPECT, NanoSPECT /CT Bioscan) ved hjelp av
99mTc-MDP, en klassisk bein scintigrafi agent for funksjonell avbildning av benet. Denne analysen ble ikke utført på alle dyr fordi det dukket opp mindre informativ enn røntgenstråler i vår studie. Dermed alle musene ble utforsket
in vivo
av microcomputed tomografi (μCT) (CT120, General Electric Healthcare) for å påvise bein metastasering. 360 X ray anslagene ble samlet inn i trinn på 1 ° (100 KVP, 50 mA, 20 msek eksponering) for ca 5 min total skanning tid. Bilder ble rekonstruert i 3D-volumer (50 mikrometer oppløsning) på en rekonstruksjon klynge ved hjelp av en modifisert telt FDK conebeam algoritme (GE rekonstruksjon programvare). 3D-data ble behandlet ved hjelp MicroView (GE Healthcare). Dataanalyse ble utført først på enkeltsektorer (aksial, koronal sagittal) så på rekonstruerte volumer og MIP-bilder (Maximum Intensity Projection). Dyrene ble avlivet når tumorstørrelse skredet 1.500 mm
3. Ved obduksjon, svulster og vev er kjent for å huse metastaser fra prostatakreft som lymfeknuter, lunger og pigger, ble prøvetatt. Lever og Tyson kjertler ble også samplet noen lever vises unormal og noen Tyson kjertler overraskende stor. Vevene ble fiksert i 24 timer i formaldehyd og deretter lagret i 70% etanol ved 4 ° C. For pigger, ble avkalking realisert ved en ytterligere inkubasjon i 10% EDTA, pH 7,4, ved 4 ° C i løpet av en uke. Alle prøver ble dehydrert i etanol og som inngår i parafin. Seriesnitt av 5 pm tykkelse ble fremstilt og avvokset i toluen og rehydratisert i etanol og deretter vann. Noen deler ble farget med hemalun (RAL), eosin og safran (HMS flekker). Immunhistokjemi ble utført på andre deler ved hjelp av anti-PSGR (LS-A6332, Cliniscience), anti-PSA (ab9537, Abcam), eller kaninserum som negativ kontroll, Vectastain Elite ABC-peroksidase kit kanin IgG (Cliniscience), og en DAB åpenbaring (SK-4100, Vector).
Resultater
ORS endogent uttrykt av BON celler
Siden BON celler viser en heterogen morfologi, isolerte vi homogene subkloner. OR uttrykk ble undersøkt ved nestet PCR på cDNA fra ni kloner bruker degenererte primere målretting eller konserverte regioner, og PCR-produkter sekvensering. Vi oppdaget ORS transkripsjoner i seks av de kloner (Tabell S1). Blant disse er fem viste ekspresjon av mer enn ett gen OR eller pseudogen, og panelet av ORS identifisert varierte fra klon til klon. For å bekrefte disse resultatene, utførte vi nestet PCR med primere med spesiell fokus på tidligere identifiserte ORS. Egentlig alle ni kloner uttrykt ORS transkripsjoner (tabell 1), og noen av dem (OR7D2, OR1F1) ble funnet i de fleste av kloner. Det må understrekes at OR7A17, OR7D2 og OR2A1 transkripsjoner er også funnet i flere svulster (samle såkalte oppført i HORDE database).
For ytterligere å vurdere det, i motsetning til OSNs, BON celler co-express flere Ors, analyserte vi ELLER uttrykk ved encellede nivå. Vi lykkes i å amplifisere cDNA som tilsvarer GAPDH eller β-aktin for de fleste testede celler, men OR cDNA kan amplifiseres bare for noen få celler, sannsynligvis på grunn av det meget lave nivået av mRNA eller ved enkeltcellenivå. Våre data viser at noen enkelt BON cellene samtidig uttrykke mer enn én eller karakter (figur S1 A).
heterologe funksjonelt uttrykk for ORS i BON celler
Siden BON celler endogent uttrykte Ors, vi infered at de kunne også heterologt uttrykke funksjonelle ORS etter transfeksjon av OR1G1 og OR17-40 gener. BON celler syntes å uttrykke disse heterologe reseptorer og å eksponere dem på plasmamembranen (figur S1b). Vi har også funnet i BON celler transkripsjon av REEP1, et protein som letter eller uttrykk i OSNs [20] (figur S1c). Vi demonstrerte at heterologt uttrykte reseptorer er funksjonelle, indusere en kalsium-respons når de stimuleres med sine respektive ligand (1-nonanol for OR1G1 og helional for OR17-40 [18], [21]) (figur 1). Kalsium-responsen indusert ved stimulering av reseptoren OR17-40 er mindre uttalt enn den som fremkalles ved stimulering av OR1G1 reseptoren, men det gjenstår betydelige. Forskjeller mellom OR responsnivåene kan være på grunn av forskjellige uttrykk nivåer av reseptorene, til en annen koblingseffektivitet med de endogene G-proteiner av heterologe celler, eller til en annen effektivitet av ligandene som benyttes. Mock-transfekterte celler ikke svare på nonanol heller helional, som viser at odorants testet er ikke agonister av ORS endogent uttrykt i BON celler.
BON celler ble transient transfektert til å uttrykke OR1G1 eller OR17-40 reseptorer. 72h senere ble cellene ladet med fluo-4 og stimulert med de respektive odorant-ligandene av de transfekterte ORS (1-nonanol og helional). Kalsium responser på grunn av samspillet mellom OR og dets spesifikke odorant agonist er uttrykt som midlere fluorescens variasjonen AF /F (%). (åpne sirkler) OR1G1 celler, 1-nonanol; (Fylte diamanter) OR17-40 celler, helional; linjer indikerer standardavvik (n = 3). Mock-transfekterte celler ikke svare på en-nonanol eller helional.
OR-indusert forbedring av cellen invasivitet
Ved hjelp av BON celler heterologt uttrykker OR1G1 eller OR17-40 reseptorer, vi vurdert invasive av kollagen type i geleer [19] av disse cellene, stimulert eller ikke med odorant agonister av disse ORS. I fravær av odorant stimulering ble invasivitet av BON cellene ikke endret av heterologe uttrykk for ORS (invasjonen indeksen forblir rundt 3%, figur 2a). Nonanol stimulering betydelig økt invasjon indeks av OR1G1-uttrykkende celler (OR1G1 celler) ved en faktor på 2,7, mens helional stimulering økt invasjon indeksen for OR17-40 celler med en faktor på 2,5 (figur 2a). Vi observerte at 10
-6 og 10
-7 M av nonanol indusert samme invasjonen nivå, mens 10
-6 M dukket opp mer effektiv i å aktivere OR1G1 i kalsium bildebehandling eksperimenter. Dette kan være på grunn av den manglende evne av BON-celler for å oppnå større invasjon nivåer (ca. 10% invaderende celler). Nonanol og helional hadde ingen signifikant effekt på mock-transfektert kontrollceller. Nonanol hadde ingen signifikant effekt på OR17-40 uttrykker celler, og heller helional på OR1G1 uttrykke celler. Videre vanillin, en antagonist av OR1G1 reseptor [22], var i stand til å spesifikt motvirke invasive indusert av nonanol i OR1G1 celler. Invasjonen indeks av kontrollceller stimulert av nonanol alene eller med en blanding av nonanol og vanillin var uforandret (figur 2a). Invasive cellulære utvidelser til kollagen type I geleer, karakteriserer invasiv celler, ble også observert etter immunolabeling av F-aktin cystoskeleton (figur 2b). Alle sammen, disse resultatene viser at
in vitro,
ORS stimulering av luktstoffer kan spesifikt fremme invasivitet av OR-uttrykker kreftceller.
(a) BON celler ble transient transfektert til å uttrykke OR1G1 eller OR17-40 reseptorer eller mock-transfektert. Celler ble sådd på collagen type I gels og stimulert av de respektive odorant ligander av OR1G1 og OR17-40 reseptorer (nonanol: OR1G1 agonist, vanillin: OR1G1 antagonist, helional: OR17-40 agonist). Invaderende celler ble tellet 24 timer senere. Resultatene er presentert som invasjonen indeksen. (B) Modifikasjon av F-aktin cytoskjelettet av BON-celler i kollagen type I matriser. F-aktin ble avslørt av rhodaminkonjugert phalloidin. Invasive utvidelser til kollagen-geler som karakteriserer invaderende celler er angitt med piler. (C) LNCaP-celler ble sådd ut på kollagen type I-geler og stimulert av PSGR ligander (β-ionon: agonist, α-ionon: antagonisten). Invaderende celler ble tellet 24 timer senere. Resultatene er presentert som invasjonen indeksen i forhold til kontrollceller uten odorant stimulering. Standardavviket til kontrollen var 13,42%. Statistikken ble utført ved hjelp av en to-tailed Student test og linjene viser standardavvik (n = 3).
Vi har bekreftet dette resultatet ved hjelp av LNCaP prostatakreftceller som endogent uttrykker en OR, den PSGR. Denne reseptor er kjent agonist og antagonist luktstoffer [12], henholdsvis den β-ionon og α-ionon. Vi brukte en 100 uM konsentrasjon av β-ionon å stimulere LNCaP-celler, siden denne dosen ble allerede rapportert å stimulere PSGR [12], og den induserte den høyeste invasivitet av LNCaP-celler i våre hender (data ikke vist). Som vist i figur 2c, stimulering av PSGR med 100 uM β-ionon økt invasivitet av LNCaP-celler med en faktor på 2,75, og denne effekten er helt opphevet ved antagonisten α-ionon. Alene, dette antagonist hadde ingen effekt på LNCaP-celler invasjon nivå. Selv om det ikke er noen negativ kontroll med LNCaP-celler som ikke ville uttrykke PSGR, den drastiske farmakologiske effekten av α-ionon argumenterer for en spesifikk effekt av β-ionon gjennom PSGR stimulering. Utelukkelse av en ikke-spesifikk kjemisk virkning av β-ionon på LNCaP-celler som induserer invasivitet understøttes også av det faktum at α-ionon, som er meget lik p-ionon og er påført på det dobbelte av β-ionon dose, førte ikke til invasivitet av LNCaP celler. Videre testet vi effekten av 100 mikrometer β-ionone på invasivitet av PC3 celler, andre prostata kreft celler som ikke uttrykker den PSGR [12], og vi ikke observere en økt invasivitet i disse cellene. Eksperimentelle resultater beskrevet nedenfor også støtte ideen om at LNCaP invasivitet kan bli styrket gjennom PSGR stimulering.
Involvering av PI3Kγ i cellen invasivitet indusert av ORS
PI3Kγ aktivisering gjennom GPCR kan være involvert i å transformere funksjoner slike som invasjon [23], og en krysstale mellom odorant signalering og PI3Kγ ble beskrevet i lukt sensoriske nevroner [24], [25]. Vi derfor undersøkt om PI3Kγ kunne være en del av signalveien som er utløst av odoranten aktivering av ORS og fremmer celle invasivitet. Først viste vi ekspresjonen av PI3Kγ i BON og LNCaP-celler med rå lysater immunblotting med et antistoff rettet mot PI3Kγ (data ikke vist). Vi vurderte invasivitet av BON celler som uttrykker hetorologously OR1G1 eller fra LNCaP-celler ved stimulering med agonister av OR1G1 eller PSGR, i nærvær av en spesifikk hemmer av PI3Kγ (AS605240). 10
-6M av AS605240 har blitt rapportert å fullstendig hemme PI3Kγ [26]. Når det gjelder BON-celler, under anvendelse av 10
-6M og 10
7M av AS605240, har vi funnet en tilsvarende stor (ca. 80%), men ikke total reduksjon av cellen invasivitet fremmes av OR1G1 ved nonanol stimulering (figur 3), indikerer at maksimal effekt blir observert ved 10
7M av AS605240. Således synes PI3Kγ å spille en viktig rolle ved formidling av BON celle invasivitet fremmes ved eller stimulering av dets spesifikke odorant, selv om andre signalveier kan også være involvert. Involvering av PI3Kγ ble bekreftet for LNCaP celler (figur 3). Men i motsetning til BON celler, PI3Kγ inhibitor AS605240 indusert reduksjon av LNCaP invasivitet selv i fravær av PSGR stimulering. Derfor PI3Kγ synes å være involvert i den basal invasivitet av LNCaP-celler. Dessuten, siden PI3Kγ kan aktiveres ved G
βγ underenhet av G-proteiner gjennom GPCR aktivering [27], brukte vi Gallein, en G
βγ subenheter inhibitor som forstyrrer samspillet av G
βγ subenheter med PI3Kγ [28], og viste at den motvirker den forbedring av LNCaP celle invasivitet indusert ved stimulering PSGR (figur 3). Dette resultatet støtter også involvering av PI3Kγ i invasivitet av tumorceller forårsaket av eller stimulering.
BON celler heterologt uttrykker OR1G1 reseptoren ble sådd på collagen type I gels og ble stimulert av nonanol (OR1G1 agonist) i nærværet av en spesifikk PI3Kγ inhibitor (AS605240). LNCaP-celler ble sådd ut på kollagen type I geler og ble stimulert ved β-ionon (PSGR agonist) i nærvær av en spesifikk PI3Kγ inhibitor (AS605240) eller en inhibitor av βγ subenheter av G-proteiner (Gallein). Invaderende celler ble tellet 24 timer senere. Resultatene er presentert som invasjonen indeksen i forhold til den for kontrollceller (uten odoranten eller AS605240 eller Gallein). Standardavvik for kontrollen var 4,74% for kontroll BON celler og 13,86% for kontroll LNCaP celler. Statistikken ble utført ved hjelp av en to-tailed Student test og linjene viser standardavvik (n = 3).
ELLER aktivisering-indusert forbedring av kreft celle invasivitet
in vivo
Siden
in vitro
forbedring av cellen invasivitet av ORS aktivering antyder en mulig rolle (i hvert fall noen) ORS i metastaseveksten
in vivo
, vaksinert vi LNCaP prostata kreftceller subkutant i immunodeficient NSG (NOD SCID gamma) mus. Dyrene ble enten ubehandlet eller daglig børstes på huden med PSGR agonist β-ionon fortynnet i mineralolje (en oljeholdig eksipiens nødvendig for å anvende de lipofile odoranter over musehud), eller med mineralolje alene som en kontroll. Tumorstørrelse ble målt og metastaser ble oppdaget av
in vivo
bildebehandling og med post-mortem immunhistokjemi bruker antistoffer rettet mot PSGR eller PSA (prostata spesifikt antigen) (eksempler på ryggraden og lungemetastaser er vist i figur 4). PSGR ekspresjon ble påvist i primærsvulster og i alle metastaser (se andre eksempler i fig S2), noe som bekrefter at denne reseptoren var til stede og eventuelt aktivert i løpet av våre eksperimenter. Uten behandling metastaser dukket hovedsakelig i inguinal noder og occasionnally i ryggraden og leveren (figur 4a). Metastaser lokalisert i inguinal noder var godt utviklet, mens de som ligger i ryggraden og leveren var mikrometastaser. Antallet metastaser økt ved behandling med mineralolje og deres lokalisering var mer variert, i nærvær av β-ionon. Egentlig metastaser dukket opp i lungene og Tyson kjertler bare for mus behandlet med β-ionone (3 av 5 dyr for Tyson kjertler og 2 av 5 dyr for lungene). Videre metastaser lokalisert i Tyson kjertler ble høyt utviklet, med størrelser som nærmer seg 1.000 mm
3. I lungene, bare mikrometastaser ble funnet, som i ryggraden og leveren. Siden mus ikke ble avlivet på samme tid, men avhengig av tumorstørrelsen, viser vi i fig 5b og 5c utviklingen med tiden av antall metastaser i henhold til antall avlivede mus og den gjennomsnittlige antall metastaser per mus på tiden av ofre for hver forsøksgruppe. Vi observerte at mus behandlet med mineralolje eller β-ionon måtte ofres tidligere, på grunn av hurtigere tumorvekst, og at de viste en betydelig økning i antall metastaser sammenlignet med ubehandlede mus. Parallelt vi også observert at tumorene utviklet ved 85% av de inokulerte områder i ubehandlede mus, mens de var mindre tallrike (50%) i mineralolje eller β-ionon behandlede mus.
metastaser er indikert med piler. I ryggraden, ble metastaser observert ved hjelp microcomputed tomografi (Maximum Intensity Projection) og bekreftet post mortem av HMS farging og immunohistologi hjelp av anti-PSA (prostataspesifikt antigen) og anti-PSGR antistoffer (bare en metastase er presentert). I lungene, ble metastaser preget av HMS flekker og immunohistologi bruker anti-PSA og anti-PSGR antistoffer
(a) Antallet metastaser observert i ulike vev etter mus ofrer (hvit. Ubehandlet kontroll mus, grå: mus behandlet med mineralolje, svart: mus behandlet med 1 mM β-ionon i mineralolje). (B) Akkumulert antall metastaser, uavhengig av hvor de befinner seg, som en funksjon av medgått tid mellom LNCaP-celler inokulering og mus avlivelse (hvit: ubehandlede kontrollmus, grå: mus behandlet med mineralolje, svart: mus behandlet med 1 mM β -ionone i mineralolje). Mus ble ofret når tumorstørrelse skredet 1.500 mm
3. Antallet mus avlivet er angitt i parentes for hvert tidspunkt og hver mus gruppe. (C) Kurver som rapporterte forholdene mellom antallet av metastaser over antall avlivede mus som en funksjon av tiden (sort stiplede: ubehandlede kontrollmus, grå: mus behandlet med mineralolje, svart: mus behandlet med 1 mM β-ionon i mineralolje).
resultatene med mineralolje var spennende. Siden ORS kan aktiveres ved ulike molekyler [2], [12], [18] undersøkte vi om mineralolje kan stimulere PSGR i
in vitro
celle invasjon analyser og kalsium bildebehandling eksperimenter. Mineralolje økt både invasivitet og kalsiumresponsen av LNCaP-celler, og den PSGR antagonist-α-ionon avskaffet disse effektene (Figur 6 a, b). Disse resultater viser at en mineralolje komponent stimulerte LNCaP-celler via PSGR, fremme deres invasivitet. Dessuten ble LNCaP-celler invasivitet indusert av mineralolje inhibert ved PI3Kγ eller G
βγ subenheter inhibitorer (henholdsvis AS605240 og Gallein), viser at PI3Kγ er involvert i denne prosess, som det er involvert i celle invasivitet indusert av β-ionon. Men selv om mineralolje forbedret metastasevekst, metastase forekomst var enda mer uttalt i nærvær av β-ionon, noe som resulterer i at cellene sprer seg til lungene og Tyson kjertler som skjedde bare i nærvær av β-ionon. Alle disse data konvergere for å demonstrere at stimulering av en OR, den PSGR, kan bidra til formidling av prostata tumorceller og i metastaser generasjon.
(a) LNCaP-celler ble sådd ut på kollagen type I geler og ble stimulert av mineralolje eller mineral olje blandet med 10
-4m β-ionone, 2,10
-4m α-ionone, 10
7M AS605240 eller 10
-5 Gallein. Mineralolje ble først fortynnet 1/4 i DMSO (mineralolje ble ikke fullstendig oppløst ved denne dosen, men dette tillater oss å forvente en meget stor oppløseliggjøring av de mineralske oljekomponenter), og løsningen ble deretter fortynnet 1/1000 i kulturmediet eller kollagen jeg gel. Invaderende celler ble tellet 24 timer senere. Resultatene er presentert som invasjonen indeksen i forhold til den for kontrollceller (med bare DMSO). Linjene indikerer standardavvik. Standardavviket til kontrollen var 3,67%.
