Abstract
Bakgrunn
Endringer i DNA metylering i kreft inkluderer global hypometylering og gen-spesifikke hypermethylation. Det er ikke klart om disse to epigenetiske feil mechanistically koblet eller opptrer uavhengig av hverandre. Denne undersøkelsen ble utført for å bestemme forholdet mellom DNA hypometylering, hypermethylation og mikro ustabilitet i kreft.
Metodikk /hovedfunnene
Vi undersøkte 61 kreftcellelinjer og 60 kolorektal karsinom og deres tilstøtende vev ved hjelp LINE-en sulfitt-PCR som et surrogat for global demetylering. Kolorektal karsinom med sporadisk mikro ustabilitet (MSI), hvorav de fleste er på grunn av en CpG island metylering fenotype (CIMP) og tilhørende MLH1 promoter metylering, viste i gjennomsnitt ingen forskjell i LINE-en metylering mellom normale grenser og kreft vev. Interessant, noen kreftprøver i denne gruppen viste økning i LINE-en metylering. I motsetning til dette, MSI-viste en signifikant reduksjon i LINE-en metylering mellom normale og kreft tilstøtende vev (P 0,001). Microarray analyse av repeterende element metylering bekreftet denne observasjonen, og viste en høy grad av variasjon i hypometylering mellom prøvene. I tillegg unsupervised hierarkisk clustering identifisert en gruppe av høyt hypomethylated svulster, består hovedsakelig av svulster uten mikro ustabilitet. Vi utvidet LINE-en analyse for å kreftcellelinjer fra forskjellige vev og fant at 50/61 ble hypomethylated sammenlignet med lymfocytter fra perifert blod og normal tykktarmsslimhinne. Interessant, disse kreftcellelinjer også viste en stor variasjon i demetylering, som var vev-spesifikke og dermed neppe være resulterende fra en stokastisk prosess.
Konklusjon /Betydning
Globalt hypometylering er delvis reversert i kreft med mikro ustabilitet og viser også stor variasjon i kreft, noe som kan reflektere alternative progresjons trasé i kreft
Citation. Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, Ibrahim AE, Doshi K, han R, et al . (2007) LINE-en Hypomety-lering i Krepsen er svært variabel og negativt korrelert med mikro Ustabilitet. PLoS ONE 2 (5): e399. doi: 10,1371 /journal.pone.0000399
Academic Redaktør: M. Cristina Cardoso, Max Delbrueck senter for molekylærmedisin, Tyskland
mottatt: 10 januar 2007; Godkjent: 04.04.2007; Publisert: 02.05.2007
Copyright: © 2007 Estecio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (USA) gir CA098006, CA100632 og CA105346 (JP.JI) og fra FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Brasil) gir 99 /09368-1 (MRHE) og 00 /12361-8 (EHT)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kompleks sykdom, som oppstår fra både genetiske og epigenetiske feil. Betydningen av genetiske endringer i kreft, inkludert kromosomfeil og genetiske mutasjoner samt dens årsaksfaktorer (f.eks ioniserende stråling og kjemiske karsinogener) er nå godt kjent. Den epigenetisk del av cellulær transformasjon, men var inntil nylig dårlig forstått. Det har vært kjent i flere tiår at genom-wide hypometylering skjer i tumorer sammenlignet med normale celler [1] – [4] og over-ekspresjon av onkogener ble antatt å være et resultat av denne hypometylering. DNA hypermethylation i kreft fått oppmerksomhet for noen år senere med studier fra Baylin et al. [5], [6] og Jones et al. [7]. Sistnevnte endring skjer i CpG island arrangører av løssalgs gener og svekker gentranskripsjon, noe som resulterer i stanse av svulst lyddemper gener. Flere studier er beskrevet en vev-spesifikk mønster av metylering i kreft og hundre av mål-gener er kjent, blant annet tumorsuppressorgener og gener som er involvert i invasjon, angiogenese og apoptose [8], [9]. Den aldersrelatert natur promoter hypermethylation i normalt vev [10] har blitt foreslått som en predisposisjon faktor i kreft.
En viktig og uløst spørsmål er om genom-wide hypometylering og løssalgs CpG island promoter hypermethylation er to uavhengige endringer, eller om de er mekanistisk koblet. Objektive undersøkelser av DNA-metylering endringer har identifisert både hyppig hypermethylation og hypometylering i flere typer neoplasi [11] – [14]. Forsøk på å besvare dette spørsmålet resulterte i motstridende funn, med noen grupper som støtter [15], [16] og andre gjendrive [17], [18] en kobling mellom de to endringer.
Her gjennomførte vi en genome- bred metylering studie i cancercellelinjer og primære tumorer for å bestemme forholdet mellom DNA hypometylering, hypermethylation og mikro ustabilitet i kreft. Den retrotransposable element LINE-en ble brukt som et surrogat for genom-wide hypometylering, og metylering microarrays utvidet vår analyse til andre klasser av repeterende elementer. Genome-wide metylering skilte seg i kolorektal karsinom som tilhører tydelig CpG island metylering fenotype (CIMP) grupper, spesielt i de med tilhørende mikro ustabilitet (MSI), hvor hypometylering var sjeldent i forhold til både CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI- grupper. Cancercellelinjer viste en stor variasjon i genom-bred demetylering, som ble vev-spesifikk og således neppe være en stokastisk prosess. Oppsummert viser våre resultater at genom-wide hypometylering i kreft er svært variabel, årsakene som er ukjent, og det finnes en sterk invers sammenheng mellom global hypometylering og mikro ustabilitet i kreft.
Materialer og Metoder
Vevsprøver og cellelinjer
Seksti matchet par av svulsten og tilsynelatende normale tilstøtende kolon prøver ble innhentet fra pasienter behandlet ved Johns Hopkins University (Baltimore, MA). CpG island metylering fenotype (CIMP) og mikroanalyse ble tidligere bestemt for disse prøvene [19]. Perifere blod lymfocytter ble hentet fra fem friske givere, og normal tykktarm mucosavev ble ressected fra fem personer sendt til operasjon for pistol skutt sår eller ikke-maligne lesjoner. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Johns Hopkins University (Baltimore, MA), og informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.
Seksti-en kreftcellelinjer fra åtte forskjellige vev (bryst, sentralnervesystemet, tykktarm, leukemi, lever, lunge, eggstokk og prostata) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket ved å bruke standard metoder. DNA fra pasienter og cellelinjer ble ekstrahert ved hjelp av standard fenol-kloroform utvinningsmetoder.
Bisulfite-pyrosekvensering LINE-en analyse
Bisulfite behandling ble utført som rapportert [20]. Metylering analyse av LINE-en promoter (GenBank tilgangsnummer X58075) ble undersøkt ved hjelp av en pyrosekvensering baserte metylering analyse. Vi har utført 50 ul PCR i 60 mM Tris-HCl pH 8,5, 15 mM ammoniumsulfat, 2 mM MgCl2, 10% DMSO, 1 mM dNTP blanding, en enhet av Taq-polymerase, 5 pmol av forover-primer (5′-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG -3 «), 5 pmol av revers-biotinylerte primer (5′-BIO-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3′) og 50 ng av bisulfitt-behandlede genomisk DNA. PCR sykkel betingelsene var 95 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 sekunder i 50 sykluser. Det biotinylerte PCR-produktet ble renset og gjort enkelt-trådet for å virke som et templat i en pyrosekvensering reaksjon som anbefalt av produsenten, ved hjelp av pyrosekvensering vakuum Prep Tool (pyrosekvensering, Inc., Worcester, MA). I korthet ble PCR-produkt bundet til streptavidin Sepharose HP (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) og Sepharose-kuler inneholdende det immobiliserte PCR-produkt ble renset, vasket, denaturert ved å bruke en 0,2 M NaOH-oppløsning, og vasket igjen. Deretter, 0,3 uM pyrosekvensering primer (5»-GGGTGGGAGTGAT-3 «) ble hybridisert til det rensede enkeltkjedet PCR-produkt og pyrosekvensering ble utført ved anvendelse av PSQ HS 96 pyrosekvensering System (pyrosekvensering, Inc.).
metylert CpG island forsterkning (MCA) /CpG island microarray
Seksten kolorektal tumorer ble sammenlignet med deres normale vises tilstøtende vev ved hjelp av en CpG island microarray protokoll utviklet i vårt laboratorium. For hver prøve ble MCA amplikonene fremstilt ifølge Toyota et al. [20] med RXMA PCR adaptere. For å minimere forsterkning skjevhet på grunn av forskjells inkorporering av fluorescerende fargestoffer, valgte vi en indirekte-merking protokollen. For dette ble inkorporering av amino-allyl dUTP (aa-dUTP, Sigma) til 600 ng av hver av tumor-DNA og normalt DNA utført ved bruk av den Bioprime DNA-merkingssystemet protokoll (Life Technologies). Cy5 og Cy3 fluorescerende fargestoffer ble koblet til aa-dUTP-merkede tumor og normal tilstøtende amplikonene, henholdsvis, og cohybridized til HCGI12K-Human CpG 12K Array (Microarray Centre, University Health Network, Toronto, Canada). Hybridisering og post-hybridisering vaskeprosedyrer er i henhold til DeRisi og kolleger og kan bli funnet på https://www.microarrays.org. Hybridiserte lysbilder ble skannet med GenePix 4000A skanner (Axon Instruments, Foster City, California) og de oppkjøpte bildene ble analysert med programvaren GenePix Pro 6.0. Bare flekker med merket DNA-sekvensen med 90% eller mer av sin lengde overlappende en repeterende element ble benyttet for analyse. Totalt 770 plassene som representerer repeterende DNA fra forskjellige klasser ble evaluert ved hjelp av denne metoden og metylering data for hver spot ble representert som loggen
2ratio av tumor (Cy5, rød) /normal (Cy3, normal) intensiteter. Values≥1.0 (2 ganger endring) var en indikasjon på økt metylering (hypermethylation) og values≤-1.0 var et tegn på redusert metylering (hypometylering) i tumor. Unsupervised hierarkisk clustering ble gjort ved hjelp av programmet CIMminer (https://discover.nci.nih.gov/cimminer/) med beregning for avstand med absolutt korrelasjon og komplett kobling clustering.
Statistisk analyse
betydningen av forskjellene observert mellom midler ble beregnet med tosidig t-test. P-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Enveis ANOVA ble anvendt ved sammenligning av likheten i tre eller flere grupper. Statistiske analyser ble utført med Statistica programvarepakke (Statsoft, Tulsa, Oklahoma).
Resultater
LINE-en metylering i kolorektal karsinom korrelerer med MSI status
Vi anvendt pyrosekvensering metode for å bestemme metylering tettheten i LINE-en promoter. I tidligere studier har vi bekreftet anvendelsen av denne fremgangsmåten for å evaluere genom-wide metylering innhold [21], [22], og viste en sterk positiv korrelasjon mellom LINE-en metylering og LC-MS (væskekromatografi /massespektrometri) data. Således kan LINE-1-metylering nivåene benyttes som et surrogat for genom-wide demetylering. Kartet over LINE-en promoter med primere og probe stillinger er presentert i figur 1A. Denne metoden er avhengig av bisulfitt behandling av DNA som modifiserer unmethylated cytosines til tymidines mens denaturert cytosines er ikke-reaktiv. PCR av bisulfitt behandlet DNA resulterer i bassenger av produkter som inneholder både metylert og unmethylated DNA som kan bli diskriminert og kvantifisert ved hjelp av pyrosekvensering metoden. Representative LINE-1 pyrograms er vist i figur 1B. Vi undersøkte fem normal tykktarmsslimhinnen og fem perifere blod lymfocytter (PBL) DNA-prøver fra friske givere for å bestemme normale nivåer av LINE-en metylering. LINE-1-metyleringen var lik i de to forskjellige vev, med et gjennomsnitt på 71,9% i PBL og 70,8% i normal tykktarmsslimhinne.
Kvantifisering av DNA-metylering ved bruk av bisulfitt LINE-1 PCR og pyrosekvensering. A) Diagram av CpG øya promoter (GenBank tilgangsnummer. X58075, nukleotid-posisjon 108 til 520 bp) i forbindelse med full lengde LINE-1. Hver vertikal linje betegner en enkelt CpG område. Den 3’UTR, 5’UTR og to ORF av LINE-en vises på toppen. Piler indikerer plasseringen av primerne anvendt for PCR bisulfitt (R-Biot og F) og pyrosekvensering (S). B) Representative LINE-1 pyrograms for normale perifere blod lymfocytter (PBL) og brystkreft cellelinjer (MB-468 og SKBR3). Den pyrogram quantitates C for metylert og T for unmethylated DNA. Det skraverte området representerer CpG nettstedet kvantifisert i LINE-1 elementer, og prosent metylering er vist over toppen.
Vi neste evaluert LINE-en metylering i seksti primære kolorektal karsinom og normal matchende slimhinne og korrelert dette med demografiske, clinopathologic og molekylære variabler (tabell 1). Kolorektale tumorer i gjennomsnitt 54,9% metylering (SEM = 1,1%) sammenlignet med 64,3% (SEM = 0,5%) metylering i tilstøtende normalt vev, tilsvarende en gjennomsnittlig relativ demetylering av 14,6% (P 0,001). Sammenlignet med LINE-en metylering i normal tykktarm, som i gjennomsnitt 70,8% (SEM = 1,3%), både tumor og i tilknytning til tumor kolon mukosa ble demetyleres, med en respektiv gjennomsnitt på 22,5% og 9,2% relativ demetylering (P = 0,001). Ingen forskjeller i LINE-en metylering ble funnet av alder eller kjønn, men en signifikant forskjell ble funnet for side, med lavere nivåer av metylering i normal tilstøtende høyre colon (63,0%) sammenlignet med venstre colon (65,5%, P = 0,016) og scene, med lavere nivåer av metylering for svulster i etapper 3 og 4 (51,9%) sammenlignet med etapper 0-2 (57,1%, P = 0,028).
Den primære kolorektal tumorer presentert en høy variasjon i LINE-en metylering mellom forskjellige prøver (Figur 2A), og lagdeling av disse tykktarmssvulster og normal tilstøtende vev avslører en ikke-uniform variasjon i LINE-en metylering. CRC med sporadisk mikro ustabilitet (MSI), hvorav de fleste er på grunn av MLH1 arrangøren metylering, viste ingen forskjell i LINE-en metylering mellom normale grenser og kreft vev (62,6% ± 1,1% versus 60,6% ± 1,7%, p = 0,33) , med en gjennomsnittlig reduksjon på metylering av bare 3,12% ± 2,3%. I motsetning MSI-tilfellene hadde en signifikant reduksjon i LINE-1 hypometylering mellom normale og kreft tilstøtende vev (64,6% ± 0,5% vs. 53,8% ± 1,2%, P 0,0001). Angivelig, LINE-en hypometylering var uavhengig fra CIMP status, siden CIMP + /MSI-trekk og CIMP-saker ble like hypomethylated (15,4% ± 2,7% versus 17,7% ± 2,7%, p = 0,56). Denne ulik fordeling av relativ demetylering av nærvær av mikro ustabilitet er representert i figur 2B, som illustrerer opprettholdelse av LINE-en metylering i CIMP + /MSI + tumorer sammenliknet med normal vises slimhinne, mens CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI- gjennomgå alvorlig hypometylering, med ett tilfelle presentere en ekstrem relativ demetylering (61,3%).
Differensial LINE-en metylering blant CIMP /MSI grupper i primære kolorektal karsinom prøver (CRC). A) Colorectal svulst DNA og deres normale vises ved siden slimhinne fra seksti pasienter ble evaluert for LINE-en metylering. Disse tumorene ble tidligere evaluert for CpG øy methylator fenotypen (CIMP), ved hjelp av et panel av enkelt-kopigener metylering analyse, og mikro ustabilitet (MSI) status, noe som resulterte i identifisering av tre CIMP /MSI grupper. I normal vises slimhinne (øverst) liten variasjon i LINE-en metylering er observert mellom prøver og CIMP /MSI grupper (gjennomsnittlig metylering = 64,3%), mens i tumor (nederst) flere prøver gjennomgå høy LINE-en demetylering (25/60 svulst prøvene har metylering tetthet under 55%), mest kjent i CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-grupper. B) Relativ LINE-en demetylering i CRC. Relativ demetylering ble beregnet som den prosentvise endring av LINE-en metylering i tumor sammenlignet med de normale opptrer mucosa. Begge CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-prøvene som presenteres i gjennomsnitt 16% demetylering for LINE-1, mens ble det ikke observert signifikante endringer for CIMP + /MSI + prøver. For CIMP + gruppe, 4-9% økning av metylering tetthet for LINE-1 ble observert for en liten brøkdel av prøver, de fleste av dem er identifisert som CIMP + /MSI + prøver.
Metylering analyse av repeterende elementer ved hjelp av MCA /CpG island mikromatriser
i tillegg til LINE-en metylering analyse av bisulfite PCR og pyrosekvensering, også evaluert vi metylering status for repeterende elementer, inkludert LINE (lang ispedd kjernefysiske elementer), SINE (kort ispedd kjernefysiske elementer), LTR (lang terminal repetisjoner), gjentar DNA og satellitt, ved å koble MCA (metylert CpG island forsterkning, 20) til en CpG island microarray som inneholder totalt 770 plassene som representerer repeterende DNA fra forskjellige klasser. Den første analysen ble utført ved å telle hypermethylated (log
2ratio 1,0) og hypomethylated (log
2ratio -1.0) gjentar skilt i henhold til deres forskjellige klasser (figur 3A). For CIMP + /MSI + prøvene, ble hver av klassene gjentas bortsett fra satellitt gjentar funnet å være anriket for hypermethylation i tumor-DNA sammenlignet med normal tilstøtende mucosa (hypermethylation /hypometylering = 2,4 ganger i gjennomsnitt). Den berikelse for hypermethylated sekvenser redusert kraftig i CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI- (0,88-og 0,71 ganger henholdsvis). Disse funnene tyder på at det er et sterkt press for vedlikehold og /eller de-novo-metylering av repeterende elementer i MSI + gruppen. Validering av våre microarray-metoden ble gjort ved å sammenligne resultatene for LINE-en til pyrosekvensering av data i de samme kolorektal prøvene. Denne analysen viste at svulster med lavest LINE-1 demetylering av pyrosekvensering analyse viste den høyeste anrikning for hypermethylated LINJE gjentakelser (figur 3B), og den inverse situasjon blir observert for tumorer med høyest LINE-1 demetylering. Disse resultatene støtter at vår microarray analyse er en egnet metode for å få tilgang til metylering endringer i repeterende elementer.
denaturert CpG Island Amplication (MCA) /CpG island microarray for repeterende DNA-sekvenser. A) Relativ overflod av hypermethylated og hypomethylated gjentar for hver CIMP /MSI gruppe. Det ble observert en høyere antall hypermethylated forhold til hypomethylated gjentar for CIMP + /MSI + gruppe, og en gradvis endring i representasjon av hypermethylated og hypomethylated gjentar ble sett for CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-grupper, noe som resulterer i en overrepresentasjon av hypomethylated repetisjoner i mikro stabile grupper. B) Validering av microarray resultater for LINE gjentas. Merk at CIMP /MSI grupper med høyere demetylering, som bestemmes av sulfitt-pyrosekvensering av LINE-1, presenteres også et høyere antall hypomethylated LINE gjentar av microarray analyse, representert ved en lavere hyper /hypometylering forholdet. C) Unsupervised hierarkisk clustering ble påført på metylering av data fra et sett av 770 repeterende DNA-sekvenser på tvers av seksten kolorektale tumorer som er forbundet med deres normale vises slimhinne DNA. De kolorektal tumorer dendrogram er vist, og prøven ID for hvert tilfelle er inkludert i riktig. Terminal grenene er fargekodet for å representere CIMP /MSI status av svulsten prøven (rød, CIMP + /MSI +, blå, CIMP + /MSI-, grønn, CIMP- /MSI-). Totalt sett prøver av samme CIMP /MSI gruppe gruppert sammen, forsterke de ulike metylering skjebne for repeterende DNA-sekvenser metylering i hver gruppe. LINE, lang ispedd kjernefysiske elementer; SINE, kort ispedd kjernefysiske elementer, LTR, lange terminale gjentagelser; DNA gjentar; Satellitt repetisjoner.
Til slutt, ved hjelp av normaliserte log
2ratio verdier av enkeltsteder, utførte vi unsupervised hierarkisk clustering å avdekke likheter blant de 16 kolorektal kreft tilfeller studert. Det resulterende gruppert bildekart viste en god overensstemmelse med den forventede segregering av de enkelte prøver med kjente CIMP /MSI status (figur 3C), noe som tyder på at metylering skriftene til disse tumorene ikke er begrenset til enkeltkopigener, men også involverer repeterende DNA-elementer.
Hypomety-lering av LINE-1 i kreftcellelinjer viser vev-spesifikk variasjon
for å kontrollere om variasjon i genom-wide metylering er begrenset til primære kolorektal karsinom eller forekommer også i andre tumortyper, vi brukt LINE-en sulfitt-pyrosekvensering metoden til seksti-en kreftcellelinjer fra åtte ulike vev typer (bryst, sentralnervesystemet, tykktarm, leukemi, lunge, eggstokk, prostata og lever). Interessant, fant vi en markant nedgang i LINE-en metylering i de fleste av de undersøkte cellelinjer (figur 4). Total, 50/61 testet cancercellelinjer ble hypomethylated for LINE-1, med en relativ demetylering av 15% eller mer (absolutt metylering densitet lavere enn 60%) sammenlignet med lymfocytter fra perifert blod og normal tykktarmsslimhinne. I likhet med primære kolorektal tumorer, disse kreftcellelinjer viste høy variasjon i LINE-en metylering, fra 6,5% (K562, en CML cellelinje med erytroleukemia funksjoner) til 74,2% (CEM, en akutt lymfatisk leukemi cellelinje). Det er en åpenbar vev-spesifisitet for demetylering; de laveste nivåene av LINE-en metylering ble observert i leveren (24,0%), etterfulgt av CNS (28,9%), bryst (29,8%), lunge (35,1%), prostata (41,9%), eggstokk (49,7%), tykktarm (46,7%) og leukemi (56,1%). Mens en interessant funn, advarer vi generalisering av dataene fordi: (i) LINE-en metylering ble ikke undersøkt for normalt vev unntatt tykktarm og perifert blod; og (ii) et lite antall cellelinjer ble analysert for lever og prostatakreft.
LINE-en metylering variasjon i kreftcellelinjer. DNA-prøver av normal perifert blod lymfocytter, normal tykktarm slimhinne og seksti-en cellelinjer fra åtte ulike vev typer ble undersøkt for LINE-en metylering hjelp bisulfite PCR etterfulgt av pyrosekvensering. Den normale vev presenterte høye nivåer av LINE-1-metylering (over 70% i gjennomsnitt), og en stor variasjon i metylering-nivåer ble observert for kreftcellelinjer, med et minimum metylering tetthet på 6,5% ble observert for leukemicellelinje K562. Tas som en gruppe, ble leukemicellelinjer moderat demetylert (gjennomsnitt 56,1%), etterfulgt av eggstokk, tarm, prostata og lunge-cancercellelinjer (variasjon fra 49,7% til 35,1%). Sentralnervesystemet (CNS), bryst og en leverkreft cellelinjer som ble testet var dypt demetylert (Bellow 30% i gjennomsnitt). Stiplede linjen representerer gjennomsnittet metylering i normale kontroller.
Et annet viktig funn er at noen cellelinjer viser ekstrem hypometylering. Mens leukemi generelt stede LINE-en metylering nivå lik med PBL, 3/15 cellelinjer har mer enn 50% relativ demetylering (K562, HEL og TF-1). En lignende situasjon er observert i andre vev, var «demetylering champions» cellelinjer ble identifisert (SKBR3 i bryst og OVCA420 i eggstokkene). En attraktiv forklaring er at gener involvert i DNA-metylering vedlikehold mangler eller mutert i disse cellelinjene.
diskusjon
DNA metylering spiller en viktig rolle i normale celler, å være involvert i X-kromosom inaktive , innprenting og undertrykkelse av repetitive elementer som retrotransposons og endogene retrovirus [23], [24]. På samme tid, CpG-øyene i promoter-regionen i enkelt-kopigener er metylering-fri, noe som er viktig for å tillate transkripsjon. I kreft, er en omvendt scenario funnet, med løssalgs CpG island hypermethylation og genome-wide hypometylering. Målet med dette arbeidet var å bestemme forholdet mellom disse to unormale hendelser, ved hjelp av kreftcellelinjer fra flere vev-typer og primære kolorektal tumorer som modell.
Mens genome-wide demetylering og løssalgs CpG øya hypermethylation oppstå i kreft, er det dårlig forstått om disse to endringene er koblet sammen. Våre data basert på metylering nivåer av repeterende elementer, ved hjelp av både en spesifikk analyse for LINE-en metylering analyse og en microarray plattform bestående av nesten 800 repetitive DNA-sekvenser fra forskjellige klasser, viser at disse svulstene med de høyeste nivåene av avvikende hypermethylation (CIMP + /MSI + ), viste også de laveste nivåene av genom-wide hypometylering, sammenlignet med normal tilstøtende slimhinne. Faktisk disse svulstene viste hyppig økning i metylering av repeterende elementer, som avslørt av både LINE-en og microarray analyse. Interessant, CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-viste høyere nivåer av LINE-en hypometylering, forsterkende unikt CIMP + /MSI + tumorer. Selv CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-gruppene var like hypomethylated for LINE-en, noe som tyder på at mikro ustabilitet er hoved molekylære endringer forbundet med mangel på LINE-en hypometylering. Disse funnene er konkordant med tidligere rapporter om manglende global hypometylering i mikro ustabile svulster [15]. Konsensus tolkning av disse dataene er at tykktarmssvulster oppstår fra to forskjellige progresjons veier: global hypermethylation med mikro ustabilitet og global hypometylering med kromosom ustabilitet. Imidlertid er det nødvendig å være oppmerksom på at CIMP + /MSI + gruppen er ikke bare preget av mikro ustabilitet, men også for en høyere frekvens av hypermethylated CpG øyer. Faktisk, den utløsende faktor for den observerte mikro ustabilitet er eksklusiv hypermethylation av MHL1 i disse svulstene, og andre gener som p16 og THBS1 er også funnet oftere metylert i CIMP + /MSI + sammenlignet med CIMP + /MSI- [25]. I tillegg microarray analyse av repeterende DNA støttet eksistensen av en gruppe tumorer (CIMP + /MSI +) under sterkt press for å de novo metylering av både CpG island arrangører og repeterende elementer og re-klassifiserte kolorektal tumorer i sine kjente CIMP /MSI grupper . Spesielt CIMP + /MSI-og CIMP- /MSI-var hovedsakelig gruppert hverandre, noe som tyder på at microarray analyse avdekket noen spesielle funksjoner i hver gruppe ikke sett av LINE-en sulfitt-pyrosequecing. For eksempel sinus gjentar viser en gradvis endring i hypermethylation /hypometylering ifølge den CIMP /MSI, med CIMP + /MSI-være en mellomgruppe. Også satellitt gjentar (hovedsakelig representert ved centromeric og pericentromeric gjentar) viste et mer stabilt mønster av metylering og det kanskje knyttet til deres funksjonelle rolle i kromosom segregering under celledeling. I motsetning til Ehrlich et al. [18] fant at hypometylering og hypermethylation er uavhengige i eggstokkreft, basert i egenskap av disse endringene for å forutsi graden av malignitet i ovarietumorer. Men direkte sammenligninger av hypometylering i kreft med og uten høye nivåer av metylering (dvs. CIMP) ble ikke undersøkt. Flere studier er nødvendig for å svare på hvorfor forskjellen repeterende elementer klassene har ulik mottakelighet for DNA hypometylering. Generelt våre microarray data tyder på at noen klasser av repeterende elementer kan være underlagt de samme metylering presset utøves på CpG øyer på CIMP + kreft.
Ved hjelp av LINE-en metylering som et surrogat for global demetylering, fant vi en stor variasjon i metylering nivåer mellom forskjellige kreftcellelinjer, med vev-spesifisitet. Noen vev som bryst, CNS og lunge gjennomgå merket LINE-en demetylering i kreft i en ganske homogen måte. I andre testede vev, som tykktarm og leukemi, noen cellelinjer hadde metylering nivåer som ligner på de utstilt ved normal tykktarm og blod vev, mens andre ble dypt demetylert. Selv om en oppfølgingsstudie blant normale prøver fra de samme studerte vev er nødvendig for å bekrefte denne observasjonen, en analyse utført av Chalichagorn et al. [26] ikke viste en markant forskjell i metylering mellom normale prøver fra ulike vev. I likhet med våre resultater, en tidligere studie av Florl et al. [27] hadde funnet en markant forskjell mellom blære og nyre karsinomer, med bare den første Exhibiting LINE-en demetylering. Den store variasjonen i global hypometylering observert impliserer ikke-stokastiske mekanismer for denne mangelen, og også antyder en selektiv fordel for svulster med alvorlig hypometylering. Faktisk nylige forsøk viser at tumordannelse induseres i mus etter global genomisk hypometylering [28], [29]. Bruke betinget transgen teknologi for å redusere uttrykket av DNMT1, Gaudet et al. [28] observerte spontan dannelse av T-cellelymfom med kjøp av ytterligere genomisk endringer. Holm et al. [29] generert mus som etterligner tap av prege (LOI), antas å skyldes hypometylering, og i disse dyrene ble også observert tumordannelse. Årsakene til slik forskjells demetylering blant kreft i ulike vev er ukjent, og både genetiske og eksponeringsfaktorer kan spille roller i dette. Dyp hypometylering, som observert i cellelinje K562 og andre kunne være relatert til spesifikke tap av funksjon av gener som styrer metylering av repeterende elementer. Kandidat gener er de som koder for proteiner som er beskrevet til å utøve funksjonen som «heterochromatin voktere». For eksempel er LSH protein, et medlem av SNF2 /helifamilie proteiner, som kreves for genome-wide metylering. Knockout mus for Lsh gen vises perinatal dødelighet og viste markert demetylering av repeterende elementer som er uavhengig av endringer i RNA nivåer av DNMT1 [30].
Oppsummert viser våre resultater at genom-wide hypometylering er svært variabel i kreftceller, er som løssalgs CpG island hypermethylation. Begge forandringer kan bli funnet i tumorene, og hver av dem kan fremme tumorigenesis av uavhengige prosesser. Vår studie gir også bevis for en sterk invers sammenheng mellom global hypometylering og mikro ustabilitet i kreft.
