Abstract
Bakgrunn
Nimotuzumab er et humanisert IgG1 monoklonalt antistoff spesifikt rettet mot EGFR. I denne studien ønsket vi å undersøke de molekylære mekanismene for nimotuzumab i dens virkninger av å styrke kreftcelle Radiosensitivity.
Principal Finne
Lungekreft A549 celler og brystkreft MCF-7 celler ble forbehandlet med eller uten nimotuzumab i 24 timer før stråling for å utføre den klonogene overlevelses analysen og for å analysere celle apoptose ved flow ctyometry. γ-H2AX foci ble påvist ved konfokal mikroskopi for å vurdere effekten av nimotuzumab på strålingsinduserte DNA-reparasjon. EGFR aktiveringen ble undersøkt, og nivåene av DNA-skade reparasjon beslektede proteiner i A549-celler ved forskjellig tidspunkt og i varierende doser etter eksponering nimotuzumab og strålebehandlingen ble undersøkt ved Western blot. Forbehandling med nimotuzumab redusert klonogene overlevelses etter bestråling, hemmet strålings-indusert aktivering EGFR og øket strålingsinduserte apoptose i både A549 celler og MCF-7 celler. Den foci av γ-H2AX 24 timer etter stråling betydelig økt i nimotuzumab forbehandlet celler med forskjellige doser. Fosforylering av AKT og DNA-PKCS ble bemerkelsesverdig hemmet i kombinasjonsgruppen ved hver dose punkt samt tidspunkt.
Konklusjoner
Våre resultater viste at mulig mekanisme nimotuzumab styrke kreft Radiosensitivity er at nimotuzumab hemmet stråling-indusert aktivering av DNA-PKCS gjennom å blokkere PI3K /AKT sti, som til slutt rammet DNA DSB sin reparasjon
Citation. Qu åå, Hu Sl, Xu Xy, Wang Rz, Yu Hy, Xu Jy, et al. (2013) Nimotuzumab Forbedrer Radiosensitivity av kreft celler in vitro ved å hemme stråling-indusert DNA Damage Repair. PLoS ONE åtte (8): e70727. doi: 10,1371 /journal.pone.0070727
Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA
mottatt: 04.01.2013; Godkjent: 18 juni 2013; Publisert: 16 august 2013
Copyright: © 2013 Qu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Strålebehandling spiller en stor rolle i behandling av flere kreftformer med. kurativ eller palliativ intensjon. Omtrent 50% av pasienter som lider med kreft trenger strålebehandling gjennom hele behandlingsprosessen. Imidlertid sykdomskontroll og overlevelse av pasienter som mottar radioterapi alene eller i kombinasjon med kjemoterapi forbli dismally lav. Tradisjonelle cytotoksiske midler med radiosensitizing funksjon ofte samtidig øke normalt vev toksisitet, noe som begrenser deres kliniske anvendelse når den kombineres med strålebehandling. Nylig har terapier målrettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) utviste utmerkede anticancer-effekter med mildt skadevirkninger og betydelig forbedret kreft Radiosensitivity i prekliniske og kliniske studier [1], [2]. EGFR målrettet terapi kombinert med strålebehandling har vært ansett som en svært potensiell strategi for behandling av enkelte kreftformer av epitelial opprinnelse
EGFR målrettet behandling består i hovedsak av to tilnærminger:. 1) monoklonale antistoffer (mAb) som er rettet mot det ekstracellulære domenet av reseptoren i den ligandbindende region, nemlig cetuximab, nimotuzumab og panituzumab; eller 2) små molekyler som hemmer EGFR største intracellulært tyrosinkinase-aktivitet, så som gefitinib og erlotinib [3]. De fleste av disse midlene har blitt grundig studert
in vitro Hotell og
in vivo
i egenskap av å styrke svulst Radiosensitivity. Ved å blokkere EGFR aktivering og dens nedstrøms signalering, for eksempel PI3K-AKT og RAS-MAPK trasé, disse anti-EGFR midler forsterke den cytotoksiske virkningen av ioniserende stråling ved å indusere cellesyklus og apoptose og hemmer celleproliferasjon, metastase og tumor angiogenese [ ,,,0],4], [5].
Nimotuzumab er et humanisert IgG1 monoklonalt antistoff som blokkerer EGF, TGF-α og andre ligander fra binding til EGFR, samt hindrer reseptoren fra utsette dens dimerisering motiv [6]. Nimotuzumab festes til EGFR med moderat bindingsaffinitet (Kd: 4,5 x 10
-8 m) sammenlignet med cetuximab, som har en bindingsaffinitet på mer enn 10 ganger høyere [6]. Studier
in vitro
har vist at nimotuzumab binder bivalently (dvs. med begge antistoff armer til to mål samtidig) til EGFR med moderat eller høy tetthet, som er stabilt mønster av feste [7], [8]. I normale vev med lav tetthet EGFR, har nimotuzumab mindre affinitet og binder EGFR med mindre aviditet, som deler de normale vev, inkludert hud og slimhinne, av alvorlig cytotoksisitet. Dette forklarer hvorfor nimotuzumab er preget av svak behandlingsrelatert toksisitet i kliniske programmet mens du viser lignende eller overlegne kreft effekter i forhold til andre anti-EGFR monoklonale antistoffer. Som et lovende terapeutisk monoklonalt antistoff, er nimotuzumab kombinert med stråling blir studert i stor utstrekning i sin effekt ved behandling av kreftformer av epitelisk opprinnelse.
Nimotuzumab har vist seg selektivt å forbedre antitumor effekter av ioniserende stråling av NSCLC-cellelinjer med høy EGFR uttrykket [9]. I tillegg er en in vivo studie i mus xenografter transplantert med en glioma cellelinje viste at både nimotuzumab og cetuximab økt Radiosensitivity av de transplanterte subkutane svulster [10]. I fase kliniske II /III-studier, nimotuzumab kombinert med strålebehandling har oppnådd gode resultat i behandling av lokalavansert hode og nakke kreft [11], [12]. Det er rapportert at cetuximab inhiberer stråleindusert EGFR nukleær translokasjon, og denne fremgangsmåten er forbundet med undertrykkelse av DNA-PKCS aktivitet [13], [14]. Andre studier har vist at tyrosinkinaseinhibitorer forbedre Radiosensitivity ved å undertrykke cellulær kapasitet av strålings-induserte DNA-skadereparasjons [15], [16]. Disse resultatene indikerer at terapeutiske monoklonale antistoff behandling i kombinasjon med strålingsterapi kan påvirke den strålings-induserte DNA-skade respons. Men de underliggende mekanismene som nimotuzumab funksjoner i bestrålingssensibilisering fortsatt unnvikende. I denne studien bruker to dyrkede kreft cellelinjer, rettet vi å undersøke potensialet molekylære mekanismen av nimotuzumab i å forbedre mobilnettet Radiosensitivity av kreft.
Materialer og metoder
Celler, cellekultur og reagenser
Den humane NSCLC-cellelinjen A549 og brystkreftcellelinjen MCF-7 (tilgjengelig fra Heilongjiang Institute of cancer Research, Harbin, Kina) ble holdt i RPMI 1640 (GIBCO) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS ) (NQBB, Australia) under en fuktig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Nimotuzumab ble gitt av Biotech Pharmaceutical Co Ltd (Beijing, Kina).
klonogene overlevelse analyse
eksponentielt voksende celler i 25 cm
2 kolber ble trypsinert, høstet, og telles. De ble seriefortynnet til passende tettheter, og belagt i tre eksemplarer med visse tall (forskjellig celle tall henhold til dosen som bestråles. Eksempelvis 200 celler pr kolbe for 2Gy, 500 celler for 4Gy, 1000 celler for 6Gy, 4000 celler for 8Gy, 10000 celler for 10Gy og 100 celler for kontroll.) i 25 cm
2 kolber inneholdende 5 ml av kulturmedium i fravær eller nærvær av 700 nM nimotuzumab. Tjuefire timer etter inkubering ble cellene eksponert for 2, 4, 6, 8 og 10 Gy av 4mv røntgen generert ved et høyt energi lineær akselerator (Elekta synergi, Stockholm, Sverige) ved en dose på 3 Gy min
1. Cellene ble deretter vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og dyrket i medikamentfritt medium i 10-14 dager under dannelse av kolonier. Deretter ble koloniene fiksert med methanol:acetic syre (10:01, v /v), og deretter farget med krystallfiolett. Kolonier som inneholder ≥ 50 celler ble talt opp. Den overlevende fraksjon ble beregnet som: (gjennomsnittlig antall kolonier) /(antall inokulerte celler x pletteringseffektivitet). Plating effektiviteten ble definert som: (gjennomsnittlig antall kolonier) /(antall inokulerte celler for kontroll, som ikke ble utsatt for bestråling med eller uten nimotuzumab). Dataene ble tilpasset til den klassiske enkelt-treffe multi-target-modell: SF = 1- (1-e
-D /D0)
N for å trekke doseoverlevelseskurven, fra hvilken parametrene (D0, dq, N og SF2) som representerer den indre celledelte radiosensitiviteten ble utledet. Følsomheten enhancement ratio (SER) ble beregnet som: (D
0 av strålebehandlet celler /D
0 av nimotuzumab kombinert med stråling behandlede celler)
Cell apoptose analyse
Celler ble behandlet med eller uten 700 nM nimotuzumab i 24 timer ble utsatt for forskjellige doser av stråling (0, 2, 8 eller Gy), og ble høstet ved 48 timer etter bestråling for celle apoptose analyse. Omtrent 1 × 10
6 celler i hver gruppe ble farget med annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) for apoptose analyse i henhold til produsentens instruksjoner (Beyotime, Kina). Cellene ble så analysert ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS, calibur, BD, USA).
γ-H2AX foci deteksjon av konfokal mikroskopi
-celler dyrket på dekkglass i seks-brønns plater ble behandlet med eller uten 700 nM nimotuzumab i 24 timer. Deretter ble cellene utstrålt ved forskjellige doser (1, 2, 4 eller 8 Gy) etterfulgt av inkubering i 24 timer. Etterpå ble cellene fiksert med iskald 70% etanol i 30 minutter, vasket 3 ganger med PBS og blokkert med 3% BSA og 0,1% Triton-X100 i PBS i 30 min. Etter fjerning av blokkeringsbufferen, ble celler inkubert med 2-4 ug /ml γ-H2AX antistoff konjugert med FITC (Millipore, Billerica, Massachusetts) i blokkeringsbuffer i to timer i mørket. Overdreven antistoffer ble vasket bort med PBS. Til slutt ble 24 h rest γ-H2AX undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi (ZEISS, LSM700, Tyskland). For hvert datapunkt på minst 300 kjerner ble evaluert.
Påvisning av EGFR-fosforylering og DNA-skade reparasjon beslektede proteiner ved hjelp av Western-blot
A549 celler og MCF-7 celler ble behandlet med eller uten 700 nM nimotuzumab i 24 timer og ble utstrålt med 4 Gy x-ray for å oppdage EGFR fosforylering. Behandlede celler ble høstet ved 2 timer etter bestråling. A549-celler ble behandlet som beskrevet ovenfor, ble høstet på 0,5, 1, 2 eller 6 timer etter bestråling for dynamisk analyse av DNA-skade reparasjons beslektede proteiner. Samme mengder av A549-celler med den samme behandlingsregimet ble bestrålt med forskjellig dose (0, 1, 2, 4, 6Gy), inkubert i 2 timer, deretter ble høstet. Deretter ble cellepelletene ble behandlet med lyseringsbuffer (Beyotime, Kina), 1 mM PMSF (Beyotime, Kina) og en protease inhibitor cocktail tablett (Roche anvendt vitenskap, Mannheim, Tyskland) per 10 ml oppløsning ble tilsatt, og totalt protein ble isolert . Like mengder av proteiner (30 ug) ble separert på 8% SDS-PAGE-geler, og deretter overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med 5% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS-T20 i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Etter vasking tre ganger med TBST, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer (Zhongshan, Kina) i 1 time. Blottene ble utviklet av chemiluminescence deteksjon kit for HRP (BI, Isreal) og visualisert med en chemiluminescence bildesystem (FLuorchemFC2, Alpha Innotech, US)
Den primære antistoffer ble fortynnet som følger:. Anti-EGFR og anti -pEGFR (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-DNA-PK (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pDNA-PK (Abcam, Cambridge, UK), 1:500; anti-Ku70 (Epitomic, Burlingame, California), 1:4000; anti-ATM (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-pATM (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-AKT (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-Pakt (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; anti-γ-H2AX (Cell Signaling Technology, Denvers, MA), 1:1000; og anti-β-aktin (Zhongshan, Beijing, Kina), 1:2000.
Statistisk analyse
Data ble analysert ved hjelp av paret t-test og beskrives som gjennomsnitt ± SD. En forskjell ble ansett som vesentlig dersom P . 0,05
Resultater
Nimotuzumab behandling forbedret cellulær Radiosensitivity i klonogene overlevelse analysen
For å undersøke om nimotuzumab forbedret anticancer effekt av ioniserende stråling, utførte vi den klonogene overlevelses analysen med A549 og MCF-7-celler (figur 1; strålebiologisk parametere ble oppsummert i tabell 1). Vi fant ikke at plating effektiviteten av både A549 og MCF-7 celler ble betydelig redusert etter forbehandling med nimotuzumab (P: 0,256 og 0,063 henholdsvis vist som figur 1B). Dose-overlevelseskurvene viste at forbehandling med nimotuzumab trykt den klonogene overlevelse av både A549 celler og MCF-7 etter varierende doser av stråling (figur 1A). Dosen enhancement ratio var 1,36 og 1,47, henholdsvis, noe som antydet at nimotuzumab var mer effektive i radiosensitizing MCF-7-celler enn A549 celler in vitro.
(A) A549 celler og MCF-7 celler ble preinkubert med og uten 700 nM nimotuzumab i 24 timer, og deretter utstråles med doser av ioniserende stråling mellom 2 og 10 Gy. After10-14 dager, koloniene ble farget og telles. Overlevende fraksjonene ble beregnet på grunnlag av kimtall og plating effektivitet. Data ble vist som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk. Kurver ble utstyrt med SF = 1- (1-e
-D /D0)
N. (B) Plating effektivitet av A549 celler og MCF-7 celler. Plating effektivitet = (gjennomsnittlig antall kolonier) /(antall inokulerte celler, som ble forbehandlet med eller uten nimotuzumab). Det var ingen statistisk betydninger mellom nimotuzumab forbehandlet A549 /MCF-7 celler og kontroll, med P:. 0,256, og henholdsvis 0,063,
Nimotuzumab hemmet EGFR aktivering etter stråling
for å bevise kapasiteten til nimotuzumab i inhibering av EGFR-aktivering, ble fosforyleringen av EGFR ved Tyr1173 påvises ved western-blot (Figur 2). Som det viste, stråling med 4Gy indusert aktivert fosforylering av EGFR i både A549 og MCF-7 celler. Med forbehandling av nimotuzumab, er nivået av fosforylert EGFR betydelig redusert etter bestråling.
A549 celler og MCF-7-celler ble forbehandlet med eller uten nimotuzumab i 24 timer før bestråling med 4 Gy. Celler ble høstet og lysert ved 2 timer etter bestråling. Lysatene gått elektroforese og ble inkubert med antistoffer mot EGFR, pEGFR og β-aktin. Kolonnediagrammer nedenfor er kvantifisering av bandene basert på densitometrisk analyse. Hver søyle representerer middelverdi ± SD av relativ tetthetsforholdet til kontrollen. * Indikerer signifikant forskjell (P 0,05).
Nimotuzumab økt celle apoptose indusert av stråling
Cell apoptose priser ble rutinemessig analysert for å vurdere kreft effekter av stråling. I denne studien, apoptose utbredelsen av A549 og MCF-7 ble behandlet med nimotuzumab var høyere enn de i kontrollceller etter å ha mottatt forskjellige strålingsdoser (figur 3). Resultatet indikerte at nimotuzumab økte den cytotoksiske virkningen av ioniserende stråling ved å indusere celle-apoptose.
Celler ble forbehandlet med og uten 700 nM nimotuzumab i 24 timer, og deretter bestrålt med 0, 2 eller 8 Gy. Førti-åtte timer etter bestråling ble cellene høstet og celle apoptose ble undersøkt ved hjelp av strømningscytometri. En representant av tre uavhengige eksperimenter av de to cellene er vist (A, C). Sammenligninger av apoptose forekomst av A549 celler og MCF-7 mellom niomtuzumab forbehandlet og kontrollgruppene er vist (B, D). Hver søyle representerer middelverdi ± SD av apoptose hastighet. * Indikerer signifikant forskjell (P 0,05).
Forbehandling av nimotuzumab økt γ-H2AX formasjon som svar på stråling
Kvantifisering av γ-H2AX formasjon er en viktig indikator for stråling indusert DNA dobbelttrådbrudd (DSB sin). For å evaluere effekten av kombinert behandling med nimotuzumab og stråling i DNA-reparasjon, kvantifisert vi det resterende γ-H2AX foci 24 timer etter bestråling med varierende doser av konfokal mikroskopi. Vi observerte at forbehandling med nimotuzumab alene ikke øker γ-H2AX generasjon i både A549 og MCF-7-celler sammenlignet med kontrollen, mens stråling behandling med forskjellige doser i begge cellelinjer forbehandlet med nimotuzumab venstre mer γ-H2AX dannelse etter 24 timer enn celler med stråling alene (figur 4).
A549 og MCF-7 celler ble forbehandlet med eller uten 700 nM nimotuzumab i 24 timer, og deretter ble utstrålt med en, to, fire og åtte Gy. Tjuefire timer etter stråling cellene fiksert og inkubert med γ-H2AX antistoff konjugert med FITC. Hver søyle representerer gjennomsnitt ± SD av rest γ-H2AX foci per celle. For hvert datapunkt på minst 300 kjerner ble evaluert. * Angir signifikante forskjeller (P 0,05). Bildene nedenfor er representative kjerner med γ-H2AX foci henhold immunfluorescens mikroskopi, behandlet med 1Gy eller 1Gy kombinert med nimotuzumab.
Forbehandling av nimotuzumab regulert DNA skade reparasjon som svar på stråling i A549 celler
Stråling-indusert DNA skade reparasjon er preget av uttrykket av flere DNA-skader reparere relaterte proteiner. Vi undersøkte derfor noen av de relaterte proteinuttrykk og deres aktiverte former under kombinasjonsbehandling med nimotuzumab og stråling i A549 celler.
For det første, vi sammenlignet den kinetiske endring av disse DNA-skade reparasjon relaterte proteiner i nimotuzumab behandlet og ikke- behandlede celler etter eksponering for bestråling (se figur 5). I dette eksperimentet, γ-H2AX i begge cellegrupper viste en trend med tidsavhengig økning. I nimotuzumab forbehandlede gruppe, nivåene av γ-H2AX var betydelig høyere enn de i kontrollgruppen på 1 time, 2 timer og 6 timer (figur 5B). DNA-PKCS, Ku70, ATM og AKT etter stråling endret ikke på hvert tidspunkt i både kontroll og nimotuzumab forbehandlet grupper. Imidlertid ble den fosforylerte form av DNA-PKCS ved Thr2609 og den fosforylerte form av AKT ved Thr308, som aktiveres former av de to proteiner som induseres ved stråling, uttrykt ved lavere nivåer i nimotuzumab forbehandlede gruppe enn de i kontroll ved forskjellige tidspunkter . Dessverre, begge nivåene av fosfo-DNA-PKCS og fosfo-AKT manglet det faste økende tendens i korrespondanse med tiden (figur 5C, D). Den fosforylert form av minibank på Ser1981 viste liten endring i både gruppe, så vel som på ulike tidspunkter (figur 5E).
(A) A549 celler forbehandlet med eller uten nimotuzumab i 24 timer ble bestrålt med 4 Gy . Celler ble høstet og lysert ved indikerte tider. Lysatene på angitte tidspunkter gikk elektroforese og ble inkubert med antistoffer mot γ-H2AX, AKT, Pakt, DNA-PKCS, pDNA-PKCS, Ku70, ATM, pATM og β-aktin. (B-E) Kvantifisering av bånd basert på densitometrisk analyse. Resultatene er relativ tetthetsforhold til den ubestrålt kontroll. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * Angir signifikante forskjeller (P 0,05).
For det andre, for å undersøke om å øke dosen av stråling utløst mer ekspresjon av DNA-skade relaterte proteiner, og hvis nimotuzumab kunne hemme aktiveringen av DNA-PKCS og AKT, strålte vi nimotuzumab forbehandlet A549 celler og kontrollceller med varierende doser. γ-H2AX viste en doseavhengig økning i både kontroll og nimotuzumab forbehandlet gruppe, og nimotuzumab forbehandling førte til en signifikant økning av γ-H2AX (figur 6B). Nivåer av DNA-PKCS, Ku70, ATM, pATM og AKT ikke endre tross for intense stråledose og forbehandling med nimotuzumab (figur 6A, E). pDNA-PKCS og Pakt var åpenbart lavere i nimotuzumab forbehandlet gruppe enn de i kontrollgruppen, men viste ingen signifikant variasjon i hver dose i noen av gruppene (figur 6C, D).
(A) A549 celler forbehandlet med eller uten nimotuzumab ble utstrålt med angitte doser. To timer etter stråleceller ble høstet og lysert. Lysatene gått elektroforese og ble inkubert med antistoffer som er beskrevet i figur 5. (B-E) Kvantifisering av bånd basert på densitometrisk analyse. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * Indikerer signifikant forskjell (P 0,05).
Diskusjoner
Selv om monoterapi av anti-EGFR mAbs viser en begrenset effekt i kliniske studier, deres kombinasjon med strålebehandling og /eller kjemoterapi har vist lovende resultater i behandling av avansert plateepitelkreft i hode og hals, ikke-småcellet lungekreft og tykktarmskreft [17] – [22]. Suksessen til denne kombinasjonsbehandling er sterkt knyttet til de sensibiliserende virkningene av anti-EGFR-mAb overfor ioniserende bestråling og /eller cytotoksiske midler. Nimotuzumab, et humanisert anti-EGFR mAbs, har vist sin unike evne til å generere radiosensitizing effekter mens forårsaker mild toksisitet av normalt vev i kliniske studier [8], [12]. Selv om kreft effekter av nimotuzumab har blitt bekreftet in vitro og in vivo [23], de potensielle molekylære mekanismer nimotuzumab å radiosensibilisere kreftcellene trenger fortsatt å bli utforsket.
I denne studien, fikk vi bekreftet at Radiosensitivity av kreft cellelinjer kan bli styrket ved forbehandling med nimotuzumab. Siden nimotuzumab alene ikke påvirke koloniene formasjon, det spilte en sensibiliserende men ikke tilsetningsstoff rolle når det kombineres med stråling. Som mål for nimotuzumab, aktivering av EGFR indusert ved stråling var tydeligvis inhibert som det var forventet. Videre demonstrerte vi at nimotuzumab øket strålingsinduserte apoptose av de to cellelinjene. Crombet-Ramos
et al product: [23] rapporterte at A431 celler inkubert med imotuzumab for 48 timer ikke vise åpen apoptotiske tegn og konkluderte med at agenten handlet hovedsakelig som cytostatisk stedet for cytotoksiske. I vår studie, men vi fant at nimotuzumab økt apoptose frekvensen av både A549 celler og MCF-7 celler fundamentalt, noe som antydet at nimotuzumab som et terapeutisk middel kan indusere celle apoptose minst in vitro. Som stråling kombinert med nimotuzumab resulterte i en synergistisk effekt på cellulær apoptose større enn summen av apoptose indusert ved nimotuzumab og ved stråling alene (dvs. en 1 + 1 2-effekt), er det bevist at nimotuzumab har kapasitet til radiosensitizing disse kreftcellene . Videre i vår studie, selv om nimotuzumab økt apoptose av kreftceller, det gjorde ikke undergrave kolonier formasjonen. Vi har spekulert i at de klonogene celler av krefttyper var mer motstandsdyktig og vanskelig å bli påvirket av nimotuzumab, og det var de proliferative celler som ble indusert til apoptose av nimotuzumab.
Basert på resultatene ovenfor, vi så fokusert på potensielle molekylære mekanismer for nimotuzumab sin radiosensitizing effekter. Det er velkjent at kreft Radiosensitivity er i hovedsak bestemt av kapasiteten av kreftceller til effektivt å reparere strålingsinduserte DNA-skader. Derfor hypotese vi at nimotuzumab kan radiosensibilisere kreftceller ved å påvirke DSB sin reparasjonsmekanisme. γ-H2AX formasjon er et følsomt markør for DSB lesjoner, og blir rutinemessig brukt for å evaluere celledelt radiosensitiviteten. Mer γ-H2AX foci betyr flere DSB sin venstre ureparert. Den kvantifisert påvisning av γ-H2AX ved immunfluorescens og immunoblot vist at flere DNA DSB sin ble etterlatt ureparert etter stråling i nimotuzumab forbehandlet celler, som til slutt førte til celle apoptose, og viste en lineær sammenheng med stråledoser eller post-stråling tid.
Deretter undersøkte vi hvordan nimotuzumab hemmet stråleindusert DSB sin reparasjon. DNA-PKCS er en kritisk protein som er involvert i ikke-homolog ende-sammenføyning reparasjon av DNA DSB sin. Aktiveringen av DNA-PKCS modulerer direkte reparasjon av stråling-indusert DSB sin. I denne studien, gjorde uttrykket nivået av DNA-PKCS etter stråling ikke endre enten forbehandlet med nimotuzumab eller ikke. Men den fosforylerte form av DNA-PKCS ved Thr2609, som er relatert til DSB reparasjon og celledelt radiosensitiviteten, sterkt forhøyet etter bestråling, noe som indikerer en radioresistent egenskap av A549-celler og betydelig redusert i nimotuzumab forbehandling gruppe. Videre har vi undersøkt en av de regulatoriske subenheter av DNA-PK kompleks Ku70. Men Ku70 endret ikke i noen av gruppene. Samlet våre resultater viser at nimotuzumab hemmet funksjon av DNA-PKCS i DSB reparasjon ved å undertrykke sin aktivering.
Toulany
et al product: [24] rapporterte at EGFR-PI3K-AKT veien ble involvert i reguleringen av DNA-PKCS. De foreslo at enten EGFR tyrosin kinase inhibitor eller AKT inhibitor avskaffet stråling-indusert DNA-PKCS fosforylering på Thr2609 i K-RAS muterte tumorceller. Siden nimotuzumab blokker EGFR nedstrøms signalering, er det mulig at nimotuzumab modulerer fosforyleringen av DNA-PKCS gjennom undertrykke aktivering av AKT. Vi fant at den fosforylerte form av AKT ved Thr308, som er den aktiverte formen i forbindelse med celleoverlevelse, sterkt øket i utstrålte A549-celler, men i likhet med fosfo-DNA-PKCS (Thr2609), ble fullstendig inhibert etter forbehandling med nimotuzumab. Dermed konkluderte vi med at nimotuzumab formidlet dens virkning på DNA-reparasjons trasé via undertrykkelse av PI3K-AKT veien. Tilbake til den celle apoptose analysen bekreftet at inhiberingen av AKT aktivering ved nimotuzumab er relatert til å fremme celle apoptose. Potensialet mekanismen er via hemme aktivering av DNA-PKCS, reparasjon av stråleinduserte DNA DSB sin ble forhindret, som til slutt indusert celle apoptose.
ATM, et viktig protein som deltar i stråling-indusert DNA skade reparasjon, var undersøkt for å finne ut om sitt uttrykk eller aktivitet kan bli påvirket av forbehandling med nimotuzumab. ATM og dens aktivert form, fosforylert form av minibank på Ser1981, endret seg ikke om forbehandlet med nimotuzumab eller ikke. Både DNA-PKCS og ATM phosphorylate γ-H2AX etter ioniserende stråling [24], [25]. I vår undersøkelse, ettersom aktivering av DNA-PKCS etter bestråling ble inhibert ved blokkering av nimotuzumab gjennom PI3K-AKT vei, kan fosforyleringen av H2AX skyldes aktiviteten av ATM.
I sammendrag, vi viste at anti-EGFR mAb nimotuzumab radiosensitizes kreftceller ved å fremkalle mer apoptose og ureparert DSB sin. Den underliggende mekanisme for dette radiosensitizing virkning er relatert til inhibering av DNA-PK involverte DNA DSB reparasjon via blokkering av PI3K-AKT pathway. Siden nimotuzumab er en godkjent anti-EGFR mAb for terapeutisk bruk i kreftbehandling, utforske de presise kreftmekanismer nimotuzumab vil bidra til å øke effekten av denne agenten i klinisk praksis.
