Abstract
Formål
Radikale endringer i både uttrykk og Glykosyleringsmønsteret av transslimstoffer har blitt observert i ulike kreftformer. Vi og andre har vist at MUC1 og MUC4, to transslimstoffer, spille en sentinel rolle i cellesignalering hendelser som driver flere epiteliale kreftformer. I denne studien undersøkte vi uttrykket profilen til MUC1 og MUC4 i den ikke-neoplastisk blære urothelium, i forskjellige ondartede svulster i blæren og blære carcinoma cellelinjer.
Materiale og metode
immunhistokjemi ble utført på vevssnitt fra urinblæren biopsier, reseksjon prøver og microarray (TMA) med monoklonale antistoffer spesifikke for MUC1 og MUC4. Vi har også undersøkt deres ekspresjon i blærekarsinom cellelinjer ved hjelp av RT-PCR og immunblotting.
Resultatene
MUC1 uttrykkes på den apikale overflate eller i paraply celler av den vanlige ikke-neoplastisk blære urothelium. Sterk uttrykk for MUC1 ble også observert i urothelial karsinom (UC). MUC1 flekker økt fra normal urothelium (n = 27, 0,35 ± 0,12) for å urothelial karsinom (UC, n = 323, H-score, 2,4 ± 0,22, p≤0.0001). I motsetning til MUC1, ble MUC4 uttrykt i alle lagene av ikke-neoplastisk blære urothelium (n = 14, 2,5 ± 0,28), både i cellemembranen og cytoplasma. I forhold til ikke-neoplastisk urothelium, var tapet av MUC4 ekspresjon observert under urothelial karsinom (n = 211, 0,56 ± 0,06). Men ble observert på nytt uttrykk for MUC4 i en undergruppe av metastatiske tilfeller av urothelial karsinom (gjennomsnittlig H-scorer 0,734 ± 0,9).
Konklusjon
uttrykk for MUC1 er økt, mens det av MUC4 redusert i UC i forhold til den normale ikke-neoplastisk urothelium. Uttrykk for både MUC1 og MUC4, men er betydelig høyere i uroteliale karsinom metastatisk tilfeller sammenlignet lokalisert UC. Disse resultatene tyder differensial uttrykk for MUC1 og MUC4 under utvikling og progresjon av blære carcinoma
Citation. Kaur S, Momi N, Chakraborty S, Wagner DG, Horn AJ, Lele SM, et al. (2014) Altered Uttrykk av transmembran slimstoffer, MUC1 og MUC4, i blærekreft: Patologiske implikasjoner i Diagnose. PLoS ONE 9 (3): e92742. doi: 10,1371 /journal.pone.0092742
Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA
mottatt: 13 januar 2014; Godkjent: 25 februar 2014; Publisert: 26 mars 2014
Copyright: © 2014 Kaur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (RO1 CA 138 791, U54 CA163120, UO1 CA111294, og P50 CA127297). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft (BCA) er den femte vanligste kreftformen i USA sto for nesten 72 570 nye tilfeller og 15,210 kreftrelaterte dødsfall i løpet av 2013 [1]. Den urothelial karsinom (UC) er den vanligste histologiske typen BCA som står for 90% av de nydiagnostiserte tilfeller. UCS ved diagnosetidspunktet varierer fra overflatiske lavgradige papillær lesjoner (assosiert med bedre prognose) til svært invasive maligne karsinomer (svært aggressiv med lav overlevelse). Omtrent 70-80% av nylig diagnostiserte UCS er «ikke-invasiv muskel» karakterisert ved at sykdommen er begrenset til blæren mucosa eller lamina propria (trinn Ta /T1 i henhold til TNM-klassifikasjon) [2]. Om lag 10% -30% av disse svulstene avansere til «muskel-invasiv sykdom» ( «high grade» UC) (scenen T2 /T3) [2]. Lav grad av papillær kreft er vanligvis ikke-invasiv (bare 15% invadere blæreveggen) og således mottagelig for kirurgisk reseksjon. Imidlertid er de tilfellene av høy klasse invasivt karsinom forbundet med høy sannsynlighet for metastasering og dødelighet [3], [4]. Cytologi og cystoskopi med vev biopsi være de mest nøyaktige metoder tilgjengelig for å oppdage BCA til dato. Cytologi er meget spesifikt for høyverdig urothelial karsinom, men ikke for lav grad av urothelial karsinom.
I de senere år, avvikende forandringer i ekspresjon og glykosylering av slimstoffer har blitt rapportert i inflammatoriske, premaligne og maligne tilstander [5 ] – [10]. Slimstoffer er glykoproteiner som kjennetegnes ved tilstedeværelse av høye grad av O- og N-glykosylering sammen med sterkt gjentatte korte strekninger av aminosyrerester (betegnet som «tandemrepetisjoner») [9]. Disse er i stor grad delt inn i to kategorier nemlig membranbundne slimstoffer og skilles /gel danner slimstoffer. Viktigere, MUC1 og MUC4 representerer de godt karakteriserte trans-membran slimstoffer som spiller viktige roller i mobilnettet fysiologi. I kraft av deres struktur og biokjemisk sammensetning disse slimstoffer deltar i smøring og hydratisering av celleoverflater, beskyttelse mot mikroorganismer (bakterier og virus) og nedbrytende enzymer [11]. Variasjon i uttrykket og glykosyleringsmønster av MUC1 og MUC4 har blitt observert i flere epitel-maligniteter, inkludert pankreatisk, bryst, tykktarm, prostata og lungekreft [7], [9], [12], [13]. De har vist seg å spille en avgjørende rolle i tumorvekst, intracellulære og ekstracellulære signalering, tumor-stromal interaksjoner, metastase, og motstand mot kjemoterapeutiske midler, og i immunovervåking [7], [11], [12], [14]. Tilgjengeligheten av svært spesifikke reagenser (
f.eks.
Monoklonale antistoffer), noe stand til å gjenkjenne endrede glykoformer har gjort slimstoffer attraktive mål for tidlig diagnose av epiteliale kreftformer. Altered uttrykk og lokalisering mønster av MUC1 er observert under utviklingen av ondartede svulster i blæren [15] – [18], men til dags dato er det en mangel på informasjon om status for MUC4. Vurderer sine beskyttende og smør roller er det viktig å vurdere sine funksjoner i sunn blæren og endring i deres uttrykk under utvikling og progresjon av urothelial carcinoma.
I denne studien undersøkte vi uttrykket mønstre MUC1 og MUC4 i ikke-neoplastisk blære urothelium og ondartede svulster i blæren vev på microarray (TMA) og seksjoner vev fra urinblæren biopsier og resected prøver. Videre ble det korrelasjon mellom ekspresjonen av disse slimstoffer og tumor karakter (grad 1-4) undersøkt for å definere den diagnostiske og fysiologiske betydning av TM muciner under patogenesen til UC.
Materialer og metoder
tumorcellelinjer og vevsprøver
Arkiverte formalinfikserte BCA vevsprøver ble hentet University of Nebraska Medical Center vev bank. Gjennomgangen styret fant denne studien, med sin avidentifisert database, for å være unntatt fra Institutional Review Board vurdering. Blære TMA ble kjøpt fra USA Biomaks for MUC1 farging (cat # BL802), Accumax for MUC4 (cat # A215II) og blære TMA (2004) (en slags gave fra Dr. Henry Frierson fra University of Virginia Charlottesville VA). IHC farging ble utført ved hjelp av mAb HMFG2 (anti-MUC1 antistoff, en slags gave fra Dr. Gendler, Mayo Clinic), og mAb8G7 (anti-MUC4 antistoff, genereres mot tandem repeat peptid, STGDTTPLPVTDTSSV i vårt laboratorium og reaktiv med både native protein og peptid) [19]. Blære carcinoma cellelinjer [T24 og HT1376, (avledet fra blæren overgangsordning celle carcinoma), TCCSUP (avledet fra en anaplatic overgangsordning celle carcinoma) scaber (avledet fra blæren plateepitelkarsinom) ble opprettholdt i American Type Culture Collection (ATCC) spesifisert kultur media supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY). Vekst media ble endret annenhver dag, og cellene ble trypsinert ved 70% konfluens.
Immunohistochemistry (IHC)
For å analysere MUC1 og MUC4 uttrykk i ondartede svulster i blæren, IHC ble utført som beskrevet tidligere på TMA og vevssnitt av prøver fra urinblæren [7]. Biopsi og reseksjon prøver av urothelial karsinom ble anmeldt av patologer (DRS. S Lele, AH Horn, og DG Wagner på UNMC) for å bekrefte diagnoser og også velge representative blokker for immunhistokjemiske analyser. For vev IHC, ble 4 mikrometer tykke seksjoner kuttet fra parafin-embedded tissue blokker med vev mikrotom og ble fulgt til de ladede glass. Blære TMA og seksjoner vev ble inkubert over natten ved 56 ° C, etterfulgt av deparaffinization hjelp gjentatte vasker xylen (5 min hver), etterfulgt av rehydrering av vev med gradert alkohol. Etter rehydratisering, ble vevene inkubert med metanolisk løsning av 3% H
2o
2 for bråkjøling av endogen peroksidaseaktivitet. Varmeinduserte antigen gjenfinning ble utført for oppvarming av prøven i 0,01 M sitrat (pH 6,0, 95 ° C) buffer i 15 minutter i mikrobølgeovnen. Etter antigen gjenfinning, ble seksjonene blokkert med hesteserum (ImmPRESS Universal antistoff kit, Vector Laboratories) i 3 timer ved romtemperatur. Platene ble videre inkubert med anti-MUC1 (HMFG2 ved 1:05 fortynning av supernatant anriket i PBS), MUC4 antistoff 8G7 (1:2000 fortynning av en 1,8 mg /ml lager i PBS) [20] over natten ved 4 ° C. Etter fire vaskinger med PBS-T (PBS inneholdende 0,05% Tween 20), ble seksjonene inkubert med anti-muse-sekundært antistoff (ImmPRESS Universal antistoff kit, Vector Laboratories) i 30 minutter. og deretter, farge ble utviklet ved tilsetning av 3,3′-diaminobenzidin-løsning (DAB substrat kit, Vector Laboratories). Rødbrunt bunnfall indikert positiv immuno-reaktivitet. Lysbildene var kontra farget med Gills hematoksylin (Vector Laboratories), dehydrert i gradert etanol etterfulgt av xylen og montert med VECTA-mount montering medium (Vector Laboratories). Alle lysbildene ble analysert ved hjelp av et Nikon Eclipse E400 mikroskop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).
Hver vev kjernen ble evaluert av uropathologists på UNMC å vurdere tilstedeværelse av tumor og scoring av farging. I korte trekk, hver flekk på vevet matrise ble gradert på grunnlag av intensiteten av fargingen på en skala fra 0 til 3 (0-ingen farging, 1-svak farging, 2-mellomproduktet flekker, og 3-sterk farging). Prosentandelen av positive celler med en gitt intensitet for hver prøve ble bestemt ved patologer. H-stillingen [Område: 0 (ingen farging i en hvilken som helst celle) til 3 (alle celler farging med det høyeste (3) intensitet] ble beregnet som summen av produktet av fargeintensitet (område: 0-3), og andelen celler farging (område~~POS=HEADCOMP: 0-1; 0-ingen celle farget og 1-100% celle farget). per H-poengsum samlings reaktivitet tilsvarer H score på ≤0.1, mild reaktivitet (H poengsum 0,1, men mindre enn eller lik 1,0), moderat reaktivitet (H poengsum 1.0 men ≤2.0) og intens reaktivitet (H poengsum . 2.0) Ved vev biopsier grunn av begrenset antall hver vevstype (godartet, carcinoma in situ og karsinom) til stede på lysbildet ble scoret på intensitet~~POS=HEADCOMP skår bare. i metastatisk tilfeller seksjonene ble scoret for H-scoring lik vev flekker.
Statistiske analyser
data ble analysert ved hjelp av MedCalc for Windows versjon 9.6.4.0 programvare. for formålet med analysen ble hver flekk ansett som en enkelt prøve. Intensitet av slimstoffekspresjon ble betraktet som avhengige variabler, men den type patologi [UC, skvamøst cellecarcinom (SCC), adenokarsinom eller papillær karsinom] , grad av kreft ble betraktet som kategoriske variabler. En p-verdi på 0,05 ble betraktet som signifikant
Isolering av Total RNA og revers transkriptase-Polymerase Chain Reaction
Cellular RNA fra dyrkede celler ble hentet av RNeasy kit i henhold til produsentens instruksjoner (. Qiagen, Hilden, Tyskland). Total RNA ble kvantifisert ved hjelp av en ultrafiolett spektrofotometer (Peqlab ND-1000, Peqlab, Erlangen, Tyskland) og kvaliteten og integriteten til prøvene ble vurdert på en 1,5% agarosegel. 2 mikrogram av total RNA fra hver BCA cellelinje ble reverstranskribert ved bruk av første-tråd cDNA syntese kit (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) ifølge produsentens instruksjoner. Den kvantitative sanntid PCR ble utført for MUC1, MUC4, og β-aktin ved hjelp av følgende primerpar: MUC1 (forover primer 5′-GAACTACGGGCAGCTGGACATC»-3 «og revers primer 5′-GCTCTCTGGGCCAGTCCTCCTG-3»), MUC4 (forover primer 5 «-CGCGGTGG TGGAGGCGTTCTT-3′ og revers primer 5»-GAAGAATCCTGACAGCCTTCA-3 «), og β-aktin forover primer (5′-TGGACATCCGCAAAGACCTG-3′) og revers primer (5»-CCGATCCACA CGGAGTACTT-3 «) (IDT Cor -. alville, IA, USA)
Western-blot analyse
Totalt protein ble hentet fra BCA cellelinjer, løst og analysert ved immunoblotting henhold til standard protokoll. I korte trekk ble cellene vasket to ganger med kald PBS, skrapet i RIPA-buffer (100 mM Tris, 5 mM EDTA, 5% NP40, pH 8,0) inneholdende proteaseinhibitorer cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og tillatt å lysere etter minst 30 minutter på is med intermitterende virvling. Celler ble utsatt for ytterligere lysering av en fryse-tine syklus og sentrifugert ved 14,000g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanter ble forsiktig fjernet og proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved Bio-Rad-protein DC estimering kit. For mucin immunoblotting, ble elektroforese utført på 2% SDS-agarosegel ved hjelp av like mengder proteinprøver under reduserende forhold. For β-aktin, ble SDS-PAGE (10%) drives under tilsvarende forhold. Proteiner ble overført til PVDF-membraner og probet med anti-MUC1 (1:05 fortynnet mAbHMFG2 supernatant i PBS) og MUC4 (1:1,000 fortynning av mAb8G7) antistoffer. Etter inkubasjon med mus pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK), ble signal oppdaget med en elektrokjemiluminescens reagenssett (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).
Resultater
I denne studien, vi utforsket uttrykket profilen til transslimstoffer (MUC1 og MUC4) i urothelial karsinom vevssnitt og tre vev TMA. Videre ble uttrykk nivåer av disse slimstoffer vurderes i blære carcinoma cellelinjer.
MUC1 Expression Analyser under ondartede svulster i blæren
MUC1 uttrykk i den ikke-neoplastisk blære urothelium.
Flertallet av de ikke-neoplastiske blære vev flekker fra TMA (16/27 eller 59%) var negative for MUC1 uttrykk (H poengsum = 0). Minor fokal farging ble observert i noen tilfeller 4/27 (15%). I de gjenværende flekker, ble mild positivitet observert (7/27 midlere H-ballen 0,58 ± 0,29 på en skala fra 0-3) (Fig. 1A). Overall, mener H-score på alle sakene sammen ble funnet å være 0,15 ± 0,1 (tabell 1). I flertallet av tilfellene, ble intens farging MUC1 begrenset til paraplyceller med svak farging i resten celler av urothelium (Fig. 1A, pilspiss). Men i noen tilfeller ble en intens farging MUC1 (4/27 eller 15%) observert overflatiske lag av urothelium (fig. 1B, vist ved pil). Generelt, farging var meget intens i overfladiske paraply celler enn i de andre lag /celler i urothelium. Et lignende funn ble notert for vevssnitt innsamlet ved UNMC som avslørte moderat til intens farging for MUC1 (N = 3, midlere intensitet 1,7 ± 0,58, betyr H-vurdering 1,7 ± 0,58) som var begrenset til overfladiske lag eller paraplyceller.
Blære svulstvev seksjoner eller flekker ble undersøkt med anti-MUC1 mAb (HMFG2) etter ikke-spesifikk blokkering med hesteserum. Alle seksjonene ble undersøkt under mikroskop og immunoreaktiviteten ble evaluert ved rødbrun farging. Representative mikrofotografier er vist for MUC1 farget ikke-neoplastiske blære urothelium (A og B) og lav grad av papillær karsinom (C), blære karsinom in situ (D), og høy grad av invasiv kreft (E 15% invadere blæreveggen) og dermed mottakelig for kirurgisk reseksjon. For MUC1, ble papillær karsinom tilfeller begrenset til vevssnitt alene, så ingen vev plass i TMA samsvarer invasiv eller non-invasiv papillær karsinom. Moderat til intens MUC1 farging ble observert i både lav og høy grad av papillær karsinom urothelial fra vevssnitt (midlere intensitet 2,9 ± 0,1 og bety H-vurdering 2,1 ± 0,83 på en skala fra 0-3, fig. 1C). Intens farging av MUC1 ble observert på den luminale overflaten til uroepithelium i lavgradig papillær karsinom urothelial. Beising intensitet og prosent positivitet økte fra celler i basale lag for å apikale lag av uroepithelium (fig. 1C, vist ved pil). Videre er overflatelaget celler viste mer intens farging i forhold til cellene under uroepithelial lag, noe som viser en ikke-ensartet celle til celle fargemønster (fig. 1C). Ved carcinoma in situ, intens farging MUC1 (midlere intensitet 2,9 ± 0,1 og bety H-ballen 2,48 ± 0,74) ble observert (N = 10) på vevssnittene (Fig. 1D).
MUC1 uttrykk i grunnskolen og metastatisk urothelial carcinoma.
i uroteliale karsinom tilfeller MUC1 flekker varierte fra ingen reaktivitet (N = 38 eller 12%), fokus reaktivitet (N = 12 eller 4%, mener H-scorer 0,057 ± 0,01 ) til moderat (N = 147 eller 46%, betyr H-ballen 1,02 ± 0,05) og intens immunoreaktivitet (N = 117 eller 37%, betyr H-score på 2,86 ± 0,02) (fig. 1E og 1F). I invasive tilfeller ble MUC1 farging observert i foci (enkel eller reir av celler) som er tilstede i den papillære kjernen eller i lamina propria (Fig. 1E og 1F), fordelingen av MUC1 være både membran og cytoplasmatiske.
MUC1 uttrykk ble observert hos 66% (8/12) av metastaser fra en primær UC til ulike steder
dvs.
. bukveggen, rygg, bein, hjerne og lymfeknuter (Fig. 2E og F). Ved metastatisk vevssnitt (n = 28), absolutt uttrykk for MUC1 ble observert i alle metastatisk tilfeller med gjennomsnittlig H-score på 1,91 ± 0,15 og midlere intensitet på 2,72 ± 0,45. I samsvar med disse resultatene ble det ikke MUC1 ekspresjon observert i normal lymph node område mens metastatiske celler i lymfeknuten ha positiv reaktivitet (fig. 2E). Den observerte MUC1 uttrykk kan kategoriseres i tre ulike mønstre luminal membranfarging (i paraplyen celle laget) bare, luminal pluss cytoplasma farging (i mellom og basale lag), eller farging av bare isolerte celler eller cellegrupper.
Representative mikrofotografier vist for MUC1 flekker i plateepitelkarsinom (A), keratin perler (B), adenokarsinom (C) mucinous adenokarsinom (D), metastase til ben (E), metastatisk urothelial carcinoma in lymfeknute (F). Sterk membran uttrykk for MUC1 ble observert plateepitelkarsinom (A) og også i keratin perler innenfor plateepitelkarsinom (B). Både mucinous adenocarcinoma (C) og adenokarsinom viste svak farging (D) for MUC1. Sterk ekspresjon av MUC1 ble observert i metastatisk karsinom i urothelial ben (E) og lymfeknute (F). Høy effekt syn viste at MUC1 er lokalisert til både cytoplasma og membranen i den metastaser (innfelt av E F)
MUC4 uttrykk i ikke-invasiv og invasiv papillær urothelial karsinom og urothelial carcinoma in situ (CIS)..
Selv om begrensede tilfellene (N = 6) av ikke-invasiv papillær karsinom var til stede i vev flekker, flertallet av dem var helt negative (N = 4, intensitet-stillingen 0), mens andre har delvis positivitet (N = 2, mener intensitet-poengsum 2.5). Invasiv papillær karsinom (N = 2) viste fullstendig tap av MUC4 uttrykket (Intensitet-poeng = 0). Videre ble fullstendig tap av MUC4 uttrykk observert i både ikke-invasiv (Fig. 3C) og invasive tilfeller av papillær karsinom (N = 10, mener intensitet 0,8 ± 0,41, gjennomsnittlig H-scorer 0,31 ± 0,39). MUC4 ekspresjon ble betydelig nedregulert i CIS fra TMA (N = 4, betyr H-stillingen 0, tabell 3), så vel som i tilfelle av vevssnitt (N = 10; midlere intensitet 0,3 ± 0,1; p = 0,02 og bety H-stillingen 0,12 ± 0,06) sammenlignet med den ikke-neoplastiske urothelium (fig. 3D). Overall, tap av MUC4 uttrykk ble observert under invasive og ikke-invasive papillær karsinom.
MUC4 uttrykk i invasiv urothelial karsinom og metastasering.
I flertallet av tilfellene ble det observert brenn uttrykk for MUC4 i urothelial karsinom (N = 122 eller 58%, mener H-score, mener intensitet 0), mens andre tilfeller viste mild positivitet (N = 89 eller 42% tilfeller, mener H-scorer 0,68 ± 0,14, mener intensitet 0,91 ± 0,19). Totalt sett, tap av MUC4 ekspresjon ble observert i både lav og høy grad av invasive urothelial karsinom (Fig. 3E og 3F). MUC4 ekspresjon ble betydelig nedregulert i carcinoma celler sammenlignet med ikke-neoplastiske urothelium (bety H-stillingen i den ikke-neoplastiske blære urothelium og UC å være 2,54 ± 0,21 [p 0,0001], og 0,47 ± 0,05 henholdsvis) (data fra TMA). Interessant, i forhold til urothelial karsinom som mangler ekspresjon av MUC4, høyere prosentandel av metastatiske tilfellene ble funnet å være positive for MUC4. Blant alle (N = 28) metastatisk tilfeller, 57% tilfeller (N = 16) viste svak til mild MUC4 farging (gjennomsnittlig H-scorer 1,27 ± 0,27) (fig. 4D-F), mens ingen som samlings uttrykk ble observert hos 43% av tilfellene (N = 12; bety intensitet = 0 og mener H-scorer 0,025 ± 0,02). ble observert både cytoplasma og membran farging av MUC4 i ulike metastatisk tilfeller (4D-F).
Representative photomicrographs vist for MUC4 flekker i plateepitelkarsinom (A), adenokarsinom (B), mucinous adenokarsinom (C) og metastatisk urothelial karsinom lymfeknute (D E), og metastatisk urothelial karsinom lunge (F). Plateepitelkarsinom tilfeller viste moderat uttrykk for MUC4 mens MUC4 ble funnet å være fraværende i adenokarsinom. Focal til moderat uttrykk for MUC4 ble observert i metastatisk urothelial karsinom til de ulike organene. Høy effekt syn viste at fargemønster er både membran og cytoplasma under metastaser.
Som det fremgår av tabell 4, ble det ikke observert signifikant forskjell i H-score på MUC4 flekker fra klasse 2 (0,66 ± 0,17) til grad 4 tumorer (0,58 ± 0,19).
MUC4 uttrykk i plateepitelkreft (SCC) og adenokarsinom i blæren.
av de 51 SCC stedene som ble undersøkt (i TMA), fokus positivitet ble observert i 38% tilfeller (N = 19, mener H-scorer 0,061 ± 0,009), mild positivitet i 42% tilfeller (N = 21, mener H-scorer 0,59 ± 0,09) og intens reaktivitet i 20 % tilfeller (N = 10, mener H-scorer 2,24 ± 0,13) (fig. 4A). Membranøs sterk farging ble observert i flertall av celler med få celler som viser cytoplasmisk farging. I MUC4 positive tilfeller, alle invasive foci av SCC i lamina propria viste uniform farging (fig. 4A). Ingen signifikant co-forhold kan vurderes mellom MUC4 uttrykk og karakteren av plateepitelkarsinom grunn av begrenset informasjon om tumor grad av tilfellene. Selv om antallet vevssnitt var begrenset til adenocarcinoma (N = 8), ingen eller fokal MUC4 reaktivitet ble observert (gjennomsnittlig H-ballen 0,4 ± 0,22) (Fig. 4B). Tilsvarende mucinkjertler adenokarsinomer ble også funnet negativ for MUC4 uttrykk (Fig. 4C).
Uttrykk for MUC1 og MUC4 i blære carcinoma cellelinjer
Etter å ha analysert uttrykket av slimstoffer i ulike blære patologier ved immunhistokjemi, ble ekspresjonen av MUC1 og MUC4 analysert på mRNA og proteinnivåene i forskjellige blærekarsinom cellelinjer (fig. 5, panel A-C). Panelet inkluderte fire blære carcinoma cellelinjer-T24, TCCSUP, HT1376 og scaber. Kvantitativ RT-PCR for MUC1 og MUC4 avslørte at alle cellelinjene unntatt T24 uttrykt MUC1 og MUC4 (figur 5A . B). Immunoblotting studier ved hjelp av anti-MUC1 antistoff (HMFG2) og anti-MUC4 antistoff (8G7) indikerte differensial uttrykk for MUC1 og MUC4 i TCCSUP, HT1376 og scaber cellelinjer (Fig. 5C). Ingen ekspresjon av MUC1 og MUC4 ble observert i T24 blærekarsinom cellelinje. Videre ble forskjellige glykoformer av MUC4 observert i squamous cell carcinoma-cellelinjen i sammenligning med TCC cellelinjer.
Kvantitativ RT-PCR-analyser av MUC1 (A) og MUC4 (B) viste at alle blærekarsinom-cellelinje, bortsett T24 uttrykker MUC1 og MUC4. Høyeste uttrykk for både MUC1 og MUC4 ble observert i tumorcellelinje HT1376. For uttrykk analyser av mucin MUC1 og MUC4 på proteinnivå, ble proteinlysatene fra alle blære carcinoma cellelinjer løst på 2% agarosegel og undersøkt med anti-MUC1 (HMFG2) og anti-MUC4 (8G7) antistoffer (panel C) . β-actin løst på 10% SDS-PAGE ble brukt som en startkontrollen (felt C). Ingen ekspresjon av hvilken som helst mucin MUC1 og MUC4 ble observert i T24, mens andre cellelinjer uttrykte begge slimstoffer. (D) Plate representasjoner av MUC1 og MUC4 uttrykk under blæren kreft progresjon. Det ble ikke observert signifikante endringer i uttrykk for både MUC1 og MUC4 under progresjon av urothelial karsinom. Progressiv økning i MUC1 uttrykk ble observert gjennom ulike stadier og grader av blærekreft mens uttrykk for MUC4 falt med sykdomsprogresjon. I en undergruppe av metastatiske tilfeller av urothelial karsinom, ble uttrykket av MUC4 oppdaget.
Totalt mucin MUC1 og MUC4 analyser i blærekreft TMA og vevssnitt indikerte at uttrykket av MUC1 økes samtidig som av MUC4 redusert i UC i forhold til den normale ikke-neoplastisk urothelium. Uttrykk for både MUC1 og MUC4, men er betydelig høyere i urothelial carcinoma metastatisk tilfeller sammenlignet med lokaliserte UC (Fig. 5D).
Diskusjoner
Aberrant uttrykk, lokalisering og glykosylering av slimstoffer er karakteristisk hendelsene i flere maligniteter (bukspyttkjertelen, eggstokkene, prostata og mage, lunge og bryst). Blant forskjellige familiemedlemmer, blir MUC1 og MUC4 involvert i tumorvekst, intracellulære og ekstracellulære signalering, tumor-stromal interaksjoner, metastase, og motstand mot kjemoterapeutiske midler, og i immunitet [10], [12]. Omfattende informasjon om uttrykket av disse slimstoffer mangler i urothelial karsinom. Denne studien undersøkte uttrykk for TM slimstoffer MUC1 og MUC4 i blæren vev microarray §§ vev og blære carcinoma cellelinjer. Mens avvikende endringer ble observert i uttrykk og lokalisering mønster av MUC1 mellom godartede og ondartede tilfeller ble betydelig nedregulering av MUC4 observert under urothelial karsinom i forhold til normal og /eller godartede blæren vev.
MUC1 er en membranbundet
O
-glycoprotein som er uttrykt på basalnivået i de fleste epitelceller [21]. Deregulert ekspresjon av MUC1 er et fremtredende trekk ved ulike typer av kreft og inflammatoriske sykdommer.
