Abstract
Nyrene er et målorgan for toksisitet av flere xenobiotics og er også svært utsatt til utviklingen av ondartede svulster. I begge tilfeller,
in vitro
studier gir innsikt i mobilnettet skader, og representerer adekvate modeller for å studere enten mekanismene bak de toksiske effektene av flere nephrotoxicants eller terapeutiske tilnærminger i nyrekreft. Utviklingen av effektive metoder for etablering av humane normale og tumor nyrecellemodeller er derfor avgjørende. I denne studien er en teknisk enkel og hurtig protokoll for isolering og kultur av humane proksimale tubulære epitelceller og humane renale tumorceller fra kirurgiske prøver presentert. Tumor og normalt vev ble behandlet ved hjelp av samme metode, basert på mekanisk dekomponering av vevet etterfulgt av enzymatisk fordøyelse og celle rensing ved sekvensiell sikting. Den generelle prosedyren tar omtrent en time. De resulterende cellepreparater har gode viabilities og yield. Etablering av primærkulturer fra alle prøvene ble oppnådd vellykket. Opprinnelsen av primære dyrkede celler ble etablert gjennom morfologisk vurdering. Normale celler renhet ble bekreftet av immunfluorescens farging og revers transkripsjon-polymerase chain reaction analyse for uttrykket av spesifikke markører
Citation. Valente MJ, Henrique R, Costa VL Jerónimo C, Carvalho F, Bastos ML, et al . (2011) En rask og enkel prosedyre for opprettelse av humant normalt og kreft i nyre primære cellekulturer fra kirurgiske prøver. PLoS ONE 6 (5): e19337. doi: 10,1371 /journal.pone.0019337
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 23 desember 2010; Godkjent: 28 mars 2011; Publisert: 04.05.2011
Copyright: © 2011 Valente et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
menneske~~POS=TRUNC proksimale tubulære epitelceller (HPTEC) tilsvare de store celletype i menneske cortical tubulointerstitium og, viktigst av alt, å det viktigste målet for et stort antall xenobiotics, fra narkotika av misbruk mot antibiotika, antineoplastiske midler, metaller og mykotoksiner [1] – [5]. Primære kulturer av HPTEC kan gi et godt karakterisert
in vitro
modell, fenotypisk representant for HPTEC
in vivo
. Dette
in vitro
systemet er godkjent for undersøkelse på nyrecellefunksjonen, transportprosesser, og cellulære mekanismer for proksimale tubulære skade av xenobiotics, uten innblanding av andre faktorer som er knyttet til
in vivo
eksperimenter . For dette formålet, er det viktig å få høyanriket HPTEC preparater fra nyrevevet. Flere teknikker er blitt beskrevet for isolering og kultur av HPTEC. Disse fremgangsmåter har vært basert på tidkrevende teknikker som isopyknisk sentrifugering med Nycodenz eller Percoll [6] – [9], eller til og med kompliserte mikrodisseksjon protokoller med eller uten enzymatisk fordøyelse [10], [11]. De store svakheter ved disse metodene inkludere lave utbytter og arbeidskraft intens prosedyrer.
I tillegg til xenobiotisk-indusert toksisitet, er det nyre også utsatt for utvikling av godartet (f.eks oncocytoma) eller ondartet (for eksempel nyrecelle karsinom, RCC) svulster. RCC utgjør 85% av nyrekreft hos voksne, og mer enn 3% av voksne maligniteter. Med over 30 000 nye tilfeller diagnostisert hvert år, er det den sjette største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, som er ansvarlig for omtrent 12 000 dødsfall per år [12], [13]. Ifølge sin histologisk utseende, kan RCC deles inn i undergrupper: konvensjonell eller klart celle, papillær, chromophobe, og unclassifiable RCC [14], [15]. Klarcellet RCC er den vanligste formen for nyrekreft. Det er stammer fra den proksimale rørformede epitel, og står for 80 til 85% av nyrecelletumor [12], [15]. Papillær RCC er den nest mest vanlige subtype av nyrekreft, med en prevalens på om lag 10% av nyre ondartede svulster, og er preget av tumorceller arrangert i en papillær konfigurasjon [16], [17]. Chromophobe er en uvanlig subtype av RCC, med en prevalens på ca 5% av nyre ondartede svulster. Som klarcellet RCC, utvikler det i nyrebarken [18], [19].
RCC etiologi er ennå uidentifiserte, utvikle enten som en sporadisk form eller som en arvelig sykdom, og uansett subtype er, det er beskrevet som meget resistente til konvensjonelle radio, lekkasje fra kjemiske og immunterapiregimer [12], [15], [20]. Derfor forblir oppdagelsen av nye strategier for terapeutisk intervensjon en prioritet. I denne forbindelse har cellekultur av humane renale tumorceller (HRTC) vist seg å være en tilfredsstillende in vitro modell for studiet av terapeutiske tilnærminger i RCC [15], [21] – [23]. Dessuten, ved siden av studier i tumorcellekulturer, er det nødvendig å teste giftigheten av potensielle terapeutiske midler i de normale celler motstykke. Derfor er det viktigste målet med denne studien å presentere en enkel og rask metode for etablering av menneskelige nyre primærkulturer, både normal (HPTEC) og tumor (HRTC), hentet fra samme organ.
Fremgangsmåten måten~~POS=HEADCOMP presentert heri er blitt tilpasset fra tidligere etablerte metoder [6], [9], [24] – [26] og anvendt for å behandle normale og tumorvev. Den er basert på mekanisk dekomponering av vevet etterfulgt av enzymatisk fordøyelse og celle rensing ved sekvensiell sikting. Denne teknikken gjør det mulig for separering av en cellulær fraksjon som er sterkt anriket på HPTEC eller HRTC fra henholdsvis normale nyrebarken og tumoral nyrevev, med langt høyere utbytte og celleviabilitet enn andre etablerte isoleringsprosedyrer. Den generelle prosedyren er teknisk enkelt, slik at det er enkel implementering i cellekultur laboratorier.
Materialer og metoder
Material
Følgende materialer ble hentet fra GIBCO ™ Invitrogen (Barcelona, Spania) med mindre annet er angitt
Celledyrkningsmedium medium~~POS=HEADCOMP:. Dulbeccos modifiserte Eagles medium med næringsblanding F-12 (DMEM /F-12) og Glutamax-i ™ supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS ), penicillin /streptomycin (50 U /ml /50 ug /ml), Fungizone (2,5 ug /ml), og humant transferrin (5 ug /ml).
Hanks bufret saltoppløsning (HBSS) uten CaCl
2 og MgCl
2
kollagenase løsning.: oppløse 50 mg kollagenase type 2, 315 U /mg (Worthington, Lakewood, NJ) i 25 ml ikke-supplert kulturmedium og filtersterilisert med 0,22 mikrometer filter. Brukes frisk
0,05% Trypsin-EDTA løsning
Fryse løsning:.. 90% FBS og 10% dimetylsulfoksyd
Inkubasjon fartøy. Autoklaveres 250 ml PYREX® glass kappe kolbe (Vidrolab 2, Gandra, Portugal) med en magnetisk bar i den. Temperaturen av kollagenase løsningen i reservoaret opprettholdes ved 37 ° C ved å sirkulere varmt vann gjennom kappen av kolben
kollagen belagt kolber (Fig. 1):. 75-cm
to plastkultur kolber belagt over natten ved 37 ° C med en 40 mikrogram /ml oppløsning av kollagen G fra bovint kalvehud (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) i PBS.
Sterile celle siler med siktstørrelser på 100, 70, og 40 mikrometer (BD Falcon ™, BD Biosciences, USA).
0,4% trypanblått løsning (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).
AccuGENE® 1X PBS (Lonza Laboratories, Verviers , Belgia)
immunocytokjemisk flekker.. monoklonalt anti-pan cytokeratin antistoff, geit anti-mus IgG-FITC antistoff, og Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)
RT-PCR-analyse. RNeasy Mini RNA isolering kit (Qiagen, USA) og RevertAid ™ H Minus First Stand Synthesis Kit (Fermentas, Danmark)
Etikk erklæringen
denne studien ble godkjent av den portugisiske Oncology Institute-Porto Ethics Committee. Alle intervjuet pasientene ga skriftlig informert samtykke.
Tissue Collection
Menneskelig nyre vevsprøver ble hentet fra en totalt 6 pasienter (3 hanner og 3 tisper) gjennomgår radikal nefrektomi for nyrecellekreft på Portugisisk Oncology Institute-Porto (IPO-Porto). Pasient gjennomsnittsalder var 62 ± 5 år gammel. Vevsprøver (omtrent 10 g hver) ble oppsamlet fra områder makroskopisk identifisert som normalt (i cortex) eller tumoral umiddelbart etter prøven utvinning, av en ekspert uropathologist. Naturen av disse områdene ble senere bekreftet av histopatologisk evaluering av speil prøver. Vev ble plassert i adskilte sterile 50 ml rør med iskald kulturmedium og deretter overført til en cellekultur laboratorium på is.
Alle prøver gjennomgikk etterfølgende rutinemessig vev behandling (formalin fiksering og forankring parafin). Histopatologisk analyse av seksjoner for å vurdere den type nyrekreft, sortering og iscenesettelse ble utført ved Avdeling for patologi, IPO-Porto.
HPTEC og HRTC Isolation Protocol
Nedsatt celle isolasjon fant sted innenfor 30 minutter av nyrevev samling. Alle påfølgende prosedyrer ble utført i et vev-kultur-strømningshette under sterile betingelser. For å unngå celle krysskontaminering, anbefaler vi å håndtere normale og vevsprøver i to individuelle vev-kultur hetter. Hvis dette ikke er mulig, da, de følgende retningslinjer skal forsterkes: kun en kirurgisk prøve bør brukes i en vev-kultur hette til enhver tid (i løpet av denne tid beholde den andre vev på is i en steril beholder), hetten skal rengjøres før innføringen av de andre kirurgiske prøven, og flasker eller alikvoter av medium skal være dedikert for bruk med normale eller tumorceller.
i laboratoriekultur kabinettet, overføre vev til en 60-mm Petriskål. Bruk pinsett og saks, dissekere av (i) fiber kapselen og tilstøtende medulla fra kortikale vev og (ii) noe fett, blodpropp og bindevev fra tumorvev.
Skjær vevsprøve i små biter med skalpeller.
Overfør vevfragmenter til en steril 50-mL sentrifugerør, skylle dem kraftig med iskald HBSS (inneholder EGTA at løsne celle knutepunkter via kalsium-chelaterende virkning) og dekanter supernatanten. Gjenta dette siste trinnet til oppløsningen er klar for blod.
Hell av supernatanten, overføre fragmenter til et rent 60-mm petriskål og fint hakke vevet inn i ca 1 mm
3 stykker med skalpeller.
Suspender små fragmenter i 25 ml forvarmet ikke-supplert kulturmedium og kombinere det med collagenase-løsning (1 mg /ml sluttkonsentrasjon) i inkubasjonen fartøyet. Inkuber i 20 minutter ved 37 ° C med forsiktig omrøring.
Før spaltet vev på den første sikt (100 mikrometer) i en 50-mL sentrifugerør. Den samme prosedyre blir deretter påført de følgende sikter (70 og 40 um). Sikting gjennom en 100-um sikt tillater fjerning av en hvilken som helst ufordøyd fibrøst vev, mens funksjonen av de 70 og 40-um-sikter er å fjerne forurensende rørformede fragmenter og glomeruli, respektivt.
Vask cellene ved sentrifugering siktet (400
g
, 5 min ved 4 ° C), og resuspender pelleten i HBSS. Gjenta denne fremgangsmåten to ganger til, og deretter cellepelleten suspenderes i kulturmedium med kosttilskudd. Bestemme celleantall og levedyktighet i et Neubauer hemocytometer ved hjelp av trypan-blå løsning.
Figur 1 viser en skjematisk representasjon av den samlede fremgangsmåte.
Cell Culture protokoll
Seed de isolerte cellene på kollagen-belagte 75 cm
2 kulturflasker ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /cm
2 og inkuberes i en fuktig atmosfære med 95% luft /5% CO
2 ved 37 ° C. (Merk: RPMI 1640 medium med kosttilskudd kan brukes alternativt til å vokse HRTC)
Endre medium 24 timer etter første seeding og 48 timers intervaller etterpå
Tillat at cellene til å vokse frem. ~80% samløpet før de blir dyrket eller fryst.
Når dyrket som beskrevet ovenfor, cellene nå samløpet i ca 10-13 dager etter såing.
Cell subkultur Protocol
Fjern cellekulturmediet og vaskes cellemonolaget med enten forvarmet HBSS eller PBS, og 1 ml av trypsin-EDTA for å svekke celle adhesjon til kolber overflaten.
Tilsett nok trypsin-EDTA-oppløsning for å dekke kolben overflate og inkuber ved 37 ° C i 3 min. Observere cellene under en omvendt optisk mikroskop for å sikre tilstrekkelig celle løsgjøring.
Avslutt trypsin handling ved å tilsette 10 ml vekstmedium supplementert og resuspender frigjorte celler ved gjentatte ganger å pipeting over overflaten av kulturen kolben.
Overfør resuspenderte celler til et sentrifugerør, skylle kolben med medium og tilsett skylt celler til et sentrifugerør. Seed cellesuspensjonen inn i nye 75-cm
2 kolber på en 01:03 subkultur forhold.
Under disse forholdene, HPTEC utover den første passering rekkevidde løpet i 3-5 dager, og HRTC i 7 dager.
Cell Kryopreservering, Tine og
replating Protocol
etter trypsinering, overføre frittliggende cellene til et sentrifugerør og pellet cellene ved sentrifugering (400
g
, 5 minutter ved 4 ° C).
Resuspender pellet fra hver kolbe i 3 ml iskaldt oppløsning.
overfør 1 ml cellesuspensjon til 2 ml cryovials og fryses umiddelbart ved -80 ° C .
å reseed suspensjonene blir cellene raskt tint ved tilsetning av forvarmet supplementert medium og overført til en 15-mL sentrifugerør.
pellet cellene ved sentrifugering ved 400
g
, i 5 minutter
. Det resuspenderes i varmet dyrkingsmedium, og overført til 75 cm
2 kolber, en hetteglass per flaske.
HPTEC og HRTC er vellykket cryopreserved fra både isolerte celler og cellesuspensjoner oppnås etter trypsinering, opprettholde en normal vekst etter tining.
Morfologisk Evaluering
Ettlagskulturer avledet fra alle 12 primære isolater (6 normal, 4 klare celle RCC og 2 chromophobe RCC) og de tilsvarende første tre passeringer ble undersøkt ved lysmikroskopi etter en invertert optisk mikroskop. En udødelig proksimale tubuli epitel cellelinje avledet fra normalt voksent menneske nyre, HK-2 cellelinje (ATCC, CRL-2190), ble også undersøkt for sammenligning.
immunocytokjemisk Farging for Cytokeratin
Å undersøke epitelisk opprinnelse erholdt normale og tumornyreceller, ble reaktiviteten til anti-cytokeratin antistoffet vurdert i suspensjoner fra passasjer 1 til 3. To udødeliggjorte cellelinjer avledet fra normalt (HK-2) og tumor (A-498) humant nyre ble anvendt som positive kontroller
i korthet HPTEC eller HRTC ble dyrket til omtrent semiconfluence på 24-brønners plater (initial densitet: 1,0 x 10
5-celler /brønn)., vasket med sterilt PBS, fiksert for 20 minutter i 4%
p-
formaldehyd, og permeabilisert i 5 minutter i 1% Triton X-100-løsning. Etter blokkering med 1% bovint serumalbumin, 0,4% Triton X-100 og 4% natriumazid blandingen, cellene ble inkubert over natten ved 4 ° C med muse-monoklonalt anti-pan cytokeratin antistoff (1:100), og deretter med geit anti-mus-IgG-FITC-antistoff (1:100) i 2 timer ved romtemperatur. Etter skylling med PBS, ble kjernene motfarget med 5 ug /ml Hoechst 33258 i 5 minutter og deretter vasket med PBS igjen. Bilder ble tatt med en fluorescens mikroskop (Nikon, Eclipse E400). Passende negative kontroller ble inkludert for å garantere positiv antistoffreaksjon.
revers transkriptase-PCR (RT-PCR) Analyse for spesifikke markører
suspensjoner (ca 3,0 × 10
6 celler hver) av første passasje normale celler fra 4 donorer ble analysert ved RT-PCR for å bekrefte opprinnelse og renhet av isolatene. Derfor ble det mRNA-ekspresjon av tre karakteristiske proteiner evaluert: uromodulin (distale tubulære celler), aquaporin 3 (kollektor kanalsystem celler) og aminopeptidase A (proksimale tubulære celler). I korthet, RNA ble ekstrahert fra alle prøvene med RNeasy Mini RNA isolering kit, og konsentrasjonene ble bestemt ved bruk av en ND-1000 Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, USA). cDNA ble fremstilt fra RNA ved bruk av RevertAid ™ H Minus Første stativ Synthesis Kit og deretter amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av de tidligere publiserte primerne sekvensene og de respektive varmebehandlingsbetingelser [27]. Glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble brukt som husholdningsgenet, en blanding av nyreceller som positiv kontroll for alle proteiner ble analysert, og vann som negativ kontroll. RT-PCR-produkter ble lastet på nondenaturing 2% agarosegeler, farget med etidiumbromid og visualisert under en UV transilluminator.
Resultater
Histopatologi
HRTC kulturer ble avledet fra RCC klare celle (4 tilfeller) eller chromophobe (2 tilfeller) subtyper. De klare celle RCC saker ble komponert av celler i acinar eller alveolar ordning, som viste den karakteristiske optisk klart cytoplasma med forskjellige cellemembraner, variabel kjernefysisk størrelse og så iøynefallende den nucleoli (Fig. 2A). De chromophobe RCC sakene ble preget av store celler, med litt eosinofil cytoplasma, fremtredende cellemembraner og uvanlig form kjerner (Fig. 2B). Begge sakene farget diffust i cytoplasma med Hale kolloidalt jern flekken.
(A) Clear nyrecellekarsinom, og (B) chromophobe nyrecellekarsinom.
Kjennetegn på Primær Cell kulturer
Tabell 1 oppsummerer de viktigste egenskapene til hver donor, og de tilsvarende isolater. Metoden gir preparater av nyreceller med gode celle viabilities (96,5 ± 1,4% og 89,7 ± 4,1% for normale og tumornyreceller, henholdsvis) og gir (18,7 ± 6,9 × 10
6 HPTEC /g kortikal vev og 3.1 ± 4,7 × 10
6 HRTC /g tumorvevet). Tidsbruk fra første samling av de nyreprøver til seeding av isolater, tok ca 1 time.
Etablering av primærkulturer ble vellykket oppnådd fra alle tolv vevsprøver (6 fra normal cortex pluss 4 fra klarcellet RCC og to fra chromophobe RCC). Alle ble holdt i kultur i minst tre passasjer. Primære isolerte celler, normal og tumor-avledet, nådde samløpet innen ca 10 dager. Etter den første gangen, normal nyre epitelceller viste en større tilbøyelighet til å spre
in vitro
enn kreftceller. Alle primærkulturer (første og subkulturer) var fri for fibroblastisk gjengroing.
Under fasekontrastmikroskopi, sammenløpende primærkulturer av normale nyreceller viste en svært homogen morfologi. HPTEC i kultur utstillings en brostein utseende (fig. 3A), karakteristisk for epitelceller som de HK-2-celler (fig. 3B). Dannelse av typiske domer (hemicysts) var synlig når de HPTEC Kulturene blir sammenflytende høyt, som indikerer transepitelial oppløst stoff transport av monolagene.
(A) Primær HPTEC, (B) HK-2 cellelinje, (C) primære klarcellet RCC, og (D) primær chromophobe RCC. Forstørrelse:. 400x
HRTC ble effektivt isolert fra klar celle og chromophobe RCC og preget av deres flatet kantet morfologi og nærvær av lipid vesikler i cytoplasma. Disse tumorundertyper kan skilles fra hverandre ved antallet og størrelsen av vesiklene: klare celler presenterer hele cytoplasmaet okkupert av multidimensjonale vesikler (Fig 3C.), Mens i chromophobe celler vesiklene dukket opp i mindre mengder og dimensjon, og cytoplasma er ikke » tom «som i klartekst celle RCC (fig. 3D). Lys mikroskopisk utseende av primære isolater (normale og tumor) og følgende tre passasjene var ikke merkbart annerledes. Cytokeratin ble uttrykt i alle RCC primærkulturer (Fig. 4), som bærer ut sine epitelial opprinnelse.
Hoechst 33258, anti-cytokeratin antistoff flekker, og fusjonerte bilder med dobbel farging av primær kultivert HPTEC, klarcellet og chromophobe RCC celler. HK-2 og A-498-celler ble anvendt som kontroll av humane normale og tumor epitel-nyreceller, respektivt. Forstørrelse:. 200x
For ytterligere å karakterisere de proksimale tubulære celler i primærkultur, ble uttrykket av spesifikke markørproteiner evaluert av immunocytokjemisk farging med mus monoklonalt antistoff mot humant cytokeratin og RT-PCR-analyse for uromodulin, aquaporin 3, og aminopeptidase A. Disse cellene uttrykte cytokeratin uniformt, som var lik den i HK-2-celler (fig. 4), noe som bekrefter dens epitelial natur. RT-PCR-analyse av HPTEC primære kulturer fra 4 pasienter ble utført. Alle fire isolatene beholdt molekylære egenskaper av HPTEC, som viser høy ekspresjon av aminopeptidase A, den karakteristiske proteinet av proksimale tubulære celler (Fig. 5). Videre cellene hadde svært uke eller manglet uttrykk for distal rørformet og samlekanal markører, uromodulin og aquaporin 3, henholdsvis.
Uromodulin (distale tubuli markør), aquaporin 3 (samlekanal markør), og aminopeptidase A (proksimale tubuli markør) i primær kultivert HPTEC avledet fra 4 givere og HK-2 celler. RNA isolert fra en blanding av renale celler ble anvendt som en positiv kontroll, og vann som negativ kontroll. Uttrykk for glyceraldehydes-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble brukt som en vaktmester-genet.
Diskusjoner
Flere
in vitro
nyre forberedelsene har vært brukt for fysiologiske og toksikologiske studier, inkludert isolerte dynket nyre, nyre skiver, nevronet segmenter, cellelinjer, og primærkulturer [28]. Blant disse, cellekultur tilbyr fordelene ved tilgjengelighet av større antall celler, og anlegget for å utføre flere og gjentatte forsøk over lengre tidsperioder. Bruken av etablerte cellelinjer for toksikologiske studier kan utgjøre mange begrensninger i forhold til primærkulturer. Faktisk, kan verdien av toksikologiske studier utført på i det vesentlige transformerte cellene bli tvilsom. Det er vel kjent at immortaliserte cellelinjer gjennomgå dedifferentiation (dvs. tap av den opprinnelige cellen spesifisitet) som et resultat av langvarig passasje
in vitro product: [29], og har egenskaper som ikke er til stede i deres vev sted på grunn av deres immortalisering. Derfor kan en endret cellulær respons overfor giftstoffer bli sett. I motsetning til dette primære kulturer beholde mange av fenotypiske egenskapene til det opprinnelige vev, inkludert normale fysiologiske funksjoner, og derfor kan være svært relevante modeller for genet oppdagelse, target validering, medikamenttesting, og utvikling av biomarkører. I tillegg benytter flere givere for prøver av vev for å generer uavhengige isolater av primære celler tillater forskerne å demonstrere konsekvente reaksjoner mellom individer.
Selv om flere forfattere tidligere har rapportert metoder for isolering og primærkultur HPTEC [6], [9], [11] og HRTC [12], [14], utbredt anvendelse av disse humane kulturpreparater har vært hemmet av små utbytter og nedsatt cellelevedyktighet.
i denne studien, beskriver vi en optimalisert metode for etablering av humane primære cellekulturer fra både normale og tumorvev, høstes fra pasientens prøven umiddelbart etter radikal nefrektomi prosedyre. Av notatet er at prøvetaking så snart etter reseksjon som mulig er en viktig faktor for å oppnå cellesuspensjoner med høy levedyktighet som det er en klar nedgang i mengden av hell dyrkes materialet de lengre vevet restene
ex vivo product: [ ,,,0],24].
Gitt at proksimale tubuli plassering er begrenset utelukkende til nyrebarken, ble kulturer etablert ved hjelp av celler isolert ved progressiv enzymatisk dissosiasjon fra den ekstreme ytre cortex av den normale humane nyre. Hakking prøven i små biter gir god fjerning av røde blodlegemer under innledende vasketrinnene og maksimerer enzymatisk fordøyelse. Passende valg av enzymet, inkubasjonstid, temperatur og konsentrasjon for optimal fordøyelse er nødvendig for å oppnå den beste vev dissosiasjon uten overdreven ødeleggelse. Collagenase fordøyelsen er kjent for å være mindre skadelig for epitelceller enn er fordøyelsen med andre enzymer (som trypsin) og under vilkår som er fastsatt i vår protokoll gir cellesuspensjoner med høyere avkastning og viabilities enn de som er fastsatt for tidligere isolasjonsprosedyrer. Sekvensielle filtrerings av kollagenase fordøye gjennom en rekke sikter med avtagende maskestørrelser fjerner rørformede fragmenter og glomeruli, og etterlater materiale som gir utvekst av renale epitelceller med en proksimal fenotype mest sannsynlig på grunn av deres høye proliferative potensial. I tillegg er den første medium endringen, 24 h etter plating, minimaliserer festing av andre ikke-epiteliale celler.
En prosedyre bør være relativt enkel og hurtig å minimere membranskade i løpet av isolasjon og tiden som er nødvendig før cellene kan bli anvendt i eksperimenter. Dette oppnås i foreliggende fremgangsmåte da det ikke er tidkrevende trinn som Percoll tetthetsgradient-sentrifugering [6], [9], eller et kompleks mikrodisseksjon [10], [11] eller immunomagnetiske teknikker [30]. Prosedyren tar nesten en time å utføre, og dermed muliggjør en raskere etablering av primære cellekulturer i forhold til forrige HPTEC eller HRTC kultur protokoller.
Etablering av primærkulturer ble vellykket oppnådd fra alle kirurgiske prøver. Totalt 12 forskjellige nyre primære kulturer ble oppnådd. Blant disse kulturene, seks var fra normal cortex, fire fra klarcellet RCC og to fra chromophobe RCC. I vår fremgangsmåte, tumor primære kulturene ta lengre tid for å nå den subconfluence utover den første delte enn de normale cortex primærkulturer. Den normale cortex primære kulturer presentert en homogen morfologi, mens de primære tumor kulturene hadde en mer heterogen morfologi. Den normale nyrecellekulturer viste en epitelial morfologi som var forenlig med rapporterte egenskaper for HPTEC [9], [24], [25]. Optisk mikroskopisk analyse opp til den tredje passasje viste at dette differensierte morfologi ikke endret på subkultur. Vi ville ikke prøve å sjekke levetiden primære normale eller kreft kulturer fordi det er velkjent at en variant av fenotype oppstår ved høyere passasjer [26], [29], [30]. Den vekstmønster og morfologi av HK-2 celler ikke skiller seg fra primær kultivert HPTEC, som vurderes ved lysmikroskopi. Viktigere, fibroblast forurensning ble ikke observert i våre kortsiktige primærkulturer, men kan være et problem etter lengre primære kultur eller flere subkulturer. For å overvinne dette problemet, har det vært anbefalt substitusjon av L-valin av D-valin og L-arginin med L-ornitin i HPTEC medium [6] eller ved bruk av hormon supplert serumfritt kulturmedium [9].
Forekomst av spesifikke markører ble etablert for å karakterisere HPTEC primærkulturer. Spesielt ble det epithelial arten av de HPTEC kulturer bekreftet ved immunocytokjemi med positiv farging for cytokeratin og den proksimale rørformede opprinnelse ved hjelp av RT-PCR med klart uttrykk for den proksimale tubuli børstegrense enzym aminopeptidase A. Videre er disse cellene viste meget svak eller fraværende uttrykk av den ytre rørformede og samlekanal markører, uromodulin og aquaporin 3, henholdsvis. Disse resultatene tyder på at våre foretrukne HPTEC Kulturene stammet fra proksimale tubuli-celler, uten vesentlig forurensning av celler fra andre deler av nevronet. Dermed vår metode gjør det mulig å isolere og vokse sterkt differensierte primærkulturer, som uttrykker spesifikke proksimale tubulære proteiner.
cytologisk homogenitet av våre HPTEC primærkulturer ble evaluert av immunocytokjemisk farging for cytokeratin opp til tredje passering, og i alle forekomster reaksjonene var homogen i intensitet og hadde identiske profiler.
Cell karakterisering utført i denne studien bekrefter andre studier som viser at HPTEC kulturer beholde de differensierte egenskapene til PTC for opptil tre passasjer [9], [31] . Dette
in vitro
modellen kan benyttes for studier om nyreskade, inkludert xenobiotisk-indusert toksisitet i HPTEC, derfor eliminerer behovet for ekstrapolering fra dyr cellekulturer og mer representativ for nyreceller
in vivo
enn etablerte nyrecellelinjer.
av notatet er at disse nyreceller av proksimale tubuli kan dyrkes i permeable membranfilter støtter, noe som resulterer i celler som morfologisk og funksjonelt bedre representerer deres
in vivo
kolleger. -Celler dyrket i disse membran bærere brukes til å studere proksimale transportsystemer, så vel som effekten av forskjellige xenobiotika ved både de apikale og basolaterale side av den proksimale rørcellen [32].
Fremgangsmåten ble også effektivt påført til isolering av HRTC fra to morfologisk og genetisk distinkte undergrupper av RCC, nemlig klart celle og chromophobe RCC. Begge typer utvikle seg fra humane renale kortikale celler. Imidlertid er klare celle RCC antas å stamme fra epitel proksimale tubuli convoluted, mens chromophobe RCC ser ut til å stamme fra kortikale delen av samlekanal [33]. Mens primærkulturer av normale epitelceller av proksimale opprinnelse presentere en svært homogen morfologi, ble betydelig morfologisk heterogenitet blant klare celle RCC kulturer notert. Dette resultatet er i overensstemmelse med tidligere rapporter som viser variasjoner i størrelse og form [34]. Cellene presenteres de forventede histologiske egenskapene som er beskrevet i tidligere studier [18], [19], [35].
Metoden viste seg å være teknisk enklere, raskere og med en høyere rate av suksess for etablering av svulst primære kulturer fra kirurgiske prøver enn den etablerte for tidligere isoleringsprosedyrer [12], [14]. Primære kulturer fra RCC kreft er nyttige verktøy for å studere biokjemiske og molekylære endringer knyttet til neoplastiske status. I tillegg til utvikling av RCC-kulturer, sammen med deres tilsvarende normale motstykker, kan gi en mer realistisk modell for utvikling og testing av nye terapeutiske modaliteter.
Som konklusjon, presenterer vi en nyttig og enkel metode for vellykket etablering av primærkulturer avledet fra friske humane normale kortikale og tumorvev. Den kombinerer forskjellige teknikker som allerede er beskrevet i litteraturen, og resulterer i en optimalisert isolasjonsmetoden, noe som ga cellepreparater med god levedyktighet og utvinning.
