Abstract
De mekaniske egenskapene til svulster og svulsten miljø gir viktig informasjon for progresjon og karakterisering av kreft. Tumorer er omgitt av en ekstracellulær matriks (ECM) som domineres av kollagen I. De geometriske og mekaniske egenskaper av ECM spiller en viktig rolle for det første trinnet i dannelsen av metastase, presentert av den migrering av maligne celler mot nye oppgjør samt vaskulære og lymfesystemet. Graden av denne celle invasjon i ECM-er en nøkkel medisinsk markør for kreftprognose.
In vivo
studier viser en økt stivhet og annen arkitektur av svulstvev i forhold til sine friske kolleger. Den observerte parallelt kollagen organisasjon på svulsten grensen og radial arrangement på invasjonen sonen har reist spørsmål om hvilke mekanismer organisere disse strukturene. Her studerer vi effekten av kontraktile krefter stammer fra modell tumor kuler innebygd i en biomimetic kollagen jeg matrise. Vi viser at sammentrekkende krefter som opptrer umiddelbart etter såing og deformere ECM, og dermed fører til strek radielle krefter i matrisen. Avslapning av denne spenning via kutting av kollagen ikke redusere invasjon, som viser en mekanisk forbindelse mellom strekk tilstanden til ECM og invasjon. I sin tur, disse resultatene tyder på at strekkrefter i ECM lette invasjon. Videre samtidig sammentrekning av ECM og tumorvekst fører til kondensasjon og reorientering av kollagen ved den sfæroide overflate. Vi foreslår en tension-basert modell for å forklare kollagen organisasjon og utbruddet av invasjonen av krefter som stammer fra svulsten
Citation. Kopanska KS, Alcheikh Y, Staneva R, Vignjevic D, Betz T (2016) Strekk Forces Stammer fra Kreft Spheroids Tilrettelegge Tumor invasjon. PLoS ONE 11 (6): e0156442. doi: 10,1371 /journal.pone.0156442
Redaktør: Adam J. Engler, University of California, San Diego, USA
mottatt: 28 desember 2015; Godkjent: 13 mai 2016; Publisert: 07.06.2016
Copyright: © 2016 Kopanska et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Data kan nås fra. https://osf.io/up847/
Finansiering: Dette arbeidet har fått støtte under programmet «Investissements d’Avenir» lansert av den franske regjeringen og implementert av ANR med referanser ANR – JCJC SVSE 5 2011 (TB) og LABEX startet CelTisPhyBio ANR-10-LBX-0038 ANR-10-IDEX-0001-02 PSL (TB, KK og DV), Celler-in-Motion Cluster of Excellence (eks 1003 – CIM) Universitetet i Münster, Tyskland (TB), Institut Thématique Multi-organismes kreft – Plan Cancer 2014-2019 og Ecole Doctorale Grenser du Vivant (FDV) – Programbettencourt (RS). Den intra bildebehandling ble støttet av Fondation pour la Recherche MEDICALE (FRM N ° DGE20111123020), den Cancerople-IdF (n ° 2012-2-EML-04-IC-1), Inca (Cancer National Institute, n ° 2011-1 -label-IC-4), og SiRIC (Inca-DGOS- 4654), PICT-IBiSA og Nikon Imaging Center @ CNRS-Institut Curie
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
metastaser er en viktig dødsårsak for kreftpasienter og sluttresultatet av en flertrinnsprosess som involverer lokal tumorinvasjon, spredning av kreftceller til fjerne organer og en tilpasning til ulike vev [1]. Mekanismene for invasjonen har vært mye studert i det siste [2]. Invaderende cellene ofte vise karakteristisk Epitelial å Mesenchymale Transition (EMT) markører, slik som ned- regulering av E-cadherin og oppregulering av vimentin, og mister noen epiteliale egenskaper, for eksempel apical- basal polaritet [3].
tumor mikromiljøet er kjennetegnet ved karakteristiske mekaniske egenskaper sammenlignet med friskt vev. Ekstracellulære matriks (ECM), hovedsakelig bestående av kollagen [4], akkumuleres i svulst stroma og det er ansvarlig for stivheten økning observert i mange tumorer [5]. Tumorprogresjon er også ledsaget av en distinkt kollagen arkitekturer [6], kalt tumor-assosiert kollagen signaturer (kvoter), som er korrelert til pasientens prognose. I utgangspunktet er det en økning i kollagen mengder i det omgivende vev (TACS-1). I de senere tilstander kollagenfibre blir innrettet parallelt med tumoroverflaten (TACS-2) [4-6]. Til slutt, i invasive tumorer, blir kollagenfibre funnet å være på linje vinkelrett på tumorgrense (TACS-3), som også samsvarer med retningen av cellulær invasjon [7]. TACS har blitt beskrevet som et prognostisk markør for pasientens overlevelse [5]. Tilsvarende har en sterk sammenheng mellom metastatisk potens og intra-tumor matrise justering, inkludert radial og parallell justering av kollagenfibre er beskrevet i kolorektalkreft musemodell [8]. En positiv tilbakekobling mellom tumor medierte endringer i kollagenet og kreft, så vel som kreft i forbindelse celletyper er blitt foreslått [9], noe som kan forklare den stabil og reproduserbar forekomsten av disse kollagen konstruksjoner.
modifikasjoner svulsten stroma er kjent for å være et resultat av biokjemiske /enzymatiske prosesser, hvor kreftceller, så vel som kreft i forbindelse fibroblaster (kafeer) spiller en sentral rolle i nedbrytning og remodellering av matrisen [8,10-12]. Denne biokjemiske remodellering er blitt grundig undersøkt, og avhenger av degradering av matriks-metalloproteinaser (MMP) og ECM avstivning av lysyl oksidase (LOX) [10]. Avstivningen av matriksen ble foreslått å være en drivende faktor for invasjon [13], imidlertid nyere studier identifisere matrise porestørrelse på stedet for stivhet som den kritiske egenskapen modulerende kreftcelle invasjon [14,15]. Her tar vi spørsmålet i hvilken grad en ren mekanisk omforming av tumor ECM kan frembringes ved de krefter som påføres av tumorcellene på ECM. Slike trekkrefter på ECM som er laget enten av kreftcellene i seg selv, eller av kreft forbundet fibroblaster (kafeer) er kjent for å bidra til avstivning matriksen og fiberen innretting rundt tumoren [16-23].
på grunn av den romlige kompleksiteten av svulsten 3D miljø, regulering og utfallet av trekkrefter på collagen er vanskelig å studere
in vivo
. Men nyere fremskritt i utviklingen av pålitelige 3D
in vitro
kreft modeller, tillate disseksjon av en mekanisk ombygging prosess. Spesielt har flercellede kreft kuler innebygd i ECM blitt funnet nyttig å studere invasjonen [24,25]. Studier ved hjelp av disse 3D sfæroide modellene viste at cellene aktivt endre den omkringliggende matrise med mekanisk justering og belastning stivne [26]. I hjernesvulst sfæroide systemer, har både kompresjons trykk og spenning på matrisen mikromiljøet blitt vist å være knyttet til tumor s invasive dynamikk [27]. De detaljerte dynamikk og sammenheng mellom den mekaniske ombygging og invasjonen har ennå ikke undersøkt. I tillegg har studier viste at mekanisk trykk og ECM elastisitet regulere vekst av sfæroidene [28,29].
Tidligere studier har vist at enkelte kreftceller utøve trekkrefter på fibrillære matriksproteiner som fører til ECM deformasjon [12]. Analyse av kollagen fiber justering
in vivo Hotell og
in vitro
hadde foreslått at krefter som stammer fra svulsten spheroid er viktig for denne justeringen [7,20,21,23]. Mens kontraktile styrker har blitt observert i én celle sammenheng å omorganisere kollagenfibre [12,30], fremveksten av en svulst i stedet foreslår å skyve på ECM på tumoroverflaten, som effektivt komprimerer kollagen matrise. Derfor kan to bidragene fra kompresjons isoleres, en skyvekraft på grunn av tumorvekst og en trekkraft som utøves av kreftcellene på ECM. På tumoroverflaten kollagen kan spenne, men også i stykker eller brytes ned. Effekten av sammentrekningsevne i andre cellesystemer, som fibroblaster har blitt godt undersøkt, hvor det ble vist at kollagen sammentrekning skaper mønstre av spenning og fibrer «innretting, noe som letter cellevandring [31-33]. Betydningen av spenning i celle migrasjon er også levert av studier på dyrking fibroblaster i flytende, lav spenning 3D gels samt forankret (behersket), høyspent geleer [34,35].
Hovedformålet med arbeid presentert i denne artikkelen er å studere effekten av den tumor-mediert ECM sin kontraksjon, og å vise at spenning er generert og påvirker celle invasjon.
Resultatene
Tre-dimensjonal modell av kreft celle invasjon
for å studere invasjonen av kreftceller i ECM vi brukte en tidligere beskrevet 3D kollagen invasjonen analysen som ble tilpasset våre eksperimenter (S1 A og S1B figur) [25,36]. Spheroids avledet fra murine tykktarmskreft cellelinje CT26 [37], transfektert til å stabilt uttrykke cytoplasma GFP, blir registrert ved å spinne disk mikroskopi for å visualisere invasjon. CT26 celler er kjennetegnet ved en mesenchymale fenotype, særlig ved manglende E-cadherin uttrykk [37]. Derfor har de en meget høy invasiv potensial og som møter de en gunstig miljø (ECM) de migrerer ut av den sfæroide. Flercellede sfæroider ble samlet ved hjelp av en klassisk agarose pute protokoll og innleiret i kollagen type I festet til overflaten av fatet (S1B Fig). Kollagen gel ble polymerisert ved romtemperatur (≈22 ° C) for å tilveiebringe matrisearkitektur kan sammenlignes med
in vivo
. Geraldo et al. viste at kollagen polymerisert
in vitro
i romtemperatur ligner fibrene syntes
in vivo
i dyremodeller med et nettverk bestående av en blanding av noen tynne bunter og mange tykke bunter som varierer fra 0,72 opp til 1,56 mikrometer tykkelse. I motsetning til dette, kollagen polymerisert i 37 ° C viste ingen likheter med animalsk vev [38]. I vår studie fysiologisk mer relevant polymerisering tilstand ved romtemperatur ble valgt (S1C figur og S1 Movie) [25]. Dette er videre støttet av
in vivo
studie i mus tykktarmskreft, der vi observerer organisasjonen lik den rekonstituerte systemet som brukes her.
Fig 1A viser representative confocal fluorescens bilder (3D projeksjon) av en GFP-CT26 spheroid, der cellene spre fra spheroid i ECM, derav hermet invasjon.
(A) Radial profil spheroid er GFP fluorescens i løpet av 72 timer med invasjonen i kollagen type I. Ulike soner av spheroid kan skilles: mørkt område, som tidligere er beskrevet som nekrotisk kjerne (stiplet linje), proliferative kanten (stiplet linje) og invasjon (line og skyggelagt område). Sett inn: representant bilde av spheroid (GFP) 24 timer etter seeding. Skala: 100 mikrometer. (B) Morfologi endring over tid av forskjellige størrelser kuler seedet inn i kollagen type I. Spheroids ble avbildet i lyse felt og fluorescens (GFP). Skala: 200 mikrometer. (C) Vekst kinetikk kuler i tre forskjellige innledende størrelser ( 300 mikrometer, 350-400 nm og 400 mikrometer). Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik fra n = 6-12 fra tre uavhengige eksperimenter.
Spheroids økning i størrelse (figur 1B) som et resultat av celleproliferasjon. Som vist ved Alessandri et al. [36], er kjernen i CT26 sfæroider nekrotisk, i likhet med andre sfæroide systemer. I kontrast, celler ved felgen løsner og invadere i kollagen. I radiale profiler av GFP fluorescens kan observeres den tidsavhengige utvikling av ulike soner. Ved t = 0h (figur 1A, gul) fluorescensen i det indre sfæroide er bare litt mindre enn på grensen. Men etter 24 timer tre soner er åpenbar, (fig 1A, red): Den nekrotiske kjernen (det mørke området på innsiden av spheroid, lav signalintensitet), den proliferative rim (signal intensitet topper), og invasjon sone (skravert område). Disse funksjonene ligne morfologi
in vivo
svulster [24].
For å velge den optimale opprinnelige størrelsen på kulene som vil inneholde tre forskjellige soner, analyserte vi vekst (figur 1C) og invasjonen av kuler av tre forskjellige diametre, nemlig 450 um, 350 um og 250 um (figur 1B). Den mørke området i mindre kuler (250 um) blir synlig etter ca tre dager når den sfæroide har nådd 300 mikrometer i diameter (figur 1 B), mens større sfæroider utvikle kjernen allerede etter en dag av dyrking i kollagen. For å teste om den opprinnelige størrelsen av sfæroider påvirker invasjon, kvantifisere vi invasjonen området for kuler av forskjellige innledende diametre og finner ingen betydning avhengighet av den relative invasjon område på det første sfæroide størrelse (p-verdi 0,05) (data ikke vist ). Som de små kulene viser kontinuerlig vekst og gi enklest mulig tilgang for 3D bildebehandling, vi utelukkende bruker kuler mellom 300-350 nm i opprinnelig størrelse for denne studien.
Kreftceller kontrakt kollagen nettverk
For å studere dynamisk omorganisering av kollagen matrise under invasjonen vi ført live bildebehandling med en tidsoppløsning på 1t over 24 timer (S2 Movie). Den sfæroide innledende størrelse øker over tid (figur 2A, lyse felt og GFP) og 9 timer første cellene er observert å forlate spheroid (utbruddet av invasjon) (figur 2A hvit pil). Fordelingen av invaderende celler etter 24 timer er ensartet rundt den sfæroide.
(A) Bilde sekvens av CT26-GFP (grønt) celle invasjon i TAMRA-merket kollagen type I (red). Celler innlede invasjonen (hvit pil) etter ca 9 timer (utbruddet av invasjon). Skala: 50 mikrometer. (B) Kymographs av kollagen og celler fra bildesekvensen (S2 Movie). Bilder ble tatt hver time i 24 timer. Scale 50 mikrometer og 3 timer. (C) Forstørrelse av den eske region som viser bevegelse av de kollagenfibrene mot den sfæroide. Den kymograph illustrerer de to motvirker bevegelser av kompresjon på grunn av sfæroide vekst (i nærheten av celleklump, blå pil og blå linje), og den kollagen sammentrekning i invasjonen sonen (striper mot den sfæroide, gule pilen og gul linje). (D) Zoom inn confocal bilder av CT26-GFP flercellet kreftcelle celleklump med celler invaderende (grønn) i kollagen type I nettverket (rød) viser kollagen organisasjon: parallelle fibre (hvit pil) og radiale fibre (gul pil). Scale 20 mikrometer. (E) Collagen fiber orientering i) Fargekodede orientering kartet. ii) Kvantitativ orientering måling (table-vinkler) på utvalgte Rois (sirkler). Spheroid overflaten orientering: 45 °, orienterings normal til overflaten: -45 ° (F) Kollagen signaturer som finnes i en enkelt NiCd /p53
– /- mus intestinal tumor er avbildes ved hjelp av intra to-foton mikroskopi. i) TACS-en, krøllete kollagen struktur; ii) TACS-2, rett og på linje kollagen, parallelt til tumoren kant og iii) TACS-3, kollagen innrettet perpendikulært til tumoren kant. Epiteliale kreftceller (atom GFP, grønn), kollagen (SHG, magenta). Pilspisser peker tydelig kollagen organisasjon. Skala barer, 50 pm.
I kollagen er å polymerisere i nærvær av den sfæroide, kan vi observere gjennomtrengning av gelen i et første cellelag (Figur 2A og 0H). I tillegg er bildene representerer maksimal projeksjoner av 40μm tykk z-stabler, som også ville føre til en viss overlegg. Over tid endrer kollagen organisering som en funksjon av avstanden til den sfæroide. Nemlig, blir kollagenfibre innrettet parallelt med kanten av sfæroide i umiddelbar nærhet (hvit pil figur 2D) og virker radialt innrettet lenger bort fra overflaten (gul pil figur 2D). Denne oppstilling ble kvantifisert ved å måle den vinkelmessige orientering ved forskjellige posisjoner (figur 2E). Det bør bemerkes at bare få celler har nådd regionen med innretting vinkelrett på overflaten. Dette utelukker at omstillingen er på grunn av massiv omlegging av kollagen av tumorceller, for eksempel ved dannelsen av hulrom i kollagen under overføringen. Våre funn av denne variabelen ordningen bekrefter tilsvarende
in vivo
og
in vitro
rapporter [6,39]. Den tidsavhengige organisasjonen vist i figur 2A tillater overvåking kollagen endringer i løpet spheroid vekst og invasjon. Vi observerer (Fig 2A) at kollagen er oppusset i løpet av 24 timer, endring fra en isotrop organisasjon ved 0h til den beskrevne parallelle innretning på overflaten, og at forekomsten av radial bunter i det omkringliggende ECM. Mulig parallell innretting av fibrene under kollagen polymerisasjonen fase ble ikke observert, men kan være utenfor oppløsning av den gjeldende data. Uskarpe områder som blir observert rundt den sfæroide kan være knyttet til den enzymatiske nedbrytning av celler eller celler i forskjellige stillinger z. Tidligere forsøk har vist at skyvekreftene i økende sfæroide alene allerede kan føre til parallell innretting ved den sfæroide overflaten [40].
kymograph (Fig 2B og 2C) viser en rik skyve /trekke oppførsel. Mens kollagen i nærheten av den sfæroide overflate er skjøvet utover av den sfæroide vekst, 30 um bort fra denne sonen skyve vi observere en trekking av kollagen mot den sfæroide, noe som resulterer i en total sammentrekning av kollagen ECM rundt den sfæroide. Den kymograph (figur 2C) viser de to antagonisering bevegelser av kompresjon på grunn av sfæroide vekst (hvit pil), og den kollagen sammentrekning i invasjonen sonen (gul pil). Denne noe motstridende virkemåten for samtidig å skyve (på grunn av sfæroide vekst, blå linje, figur 2C) og trekker (av cellekrefter, gul linje, figur 2C) skaper en kompresjonssone ved den sfæroide overflaten hvor kollagen omstilles tangentielt til den sfæroide ( fig 2). Videre er de trekkrefter deformere kollagen radialt, og således iboende skape en foretrukket innretning av fibrene vinkelrett på sfæroide overflate (Fig 2D) som er meget lik den fiberinnrettings observert
in vivo plakater (figur 2F). Slik atferd er også kjent fra skåret kollagenfibre
in vitro product: [30].
Cell-indusert kollagen sammentrekning går forut for invasjonen
kymograph basert inspeksjon antyder at kollagen sammentrekning starter umiddelbart etter såing den sfæroide i ECM, mens cellene som invaderer bare senere. Å studere timingen av sammentrekning og invasjon vi tallfeste sin tid avhengighet. Invasjon blir målt basert på fluorescerende bilder av GFP positive CT26 celler (figur 3A), ved å kvantifisere det område av celler som vises løsrevet fra den sfæroide og normalisere det med det området som dekkes av den sfæroide (S2 Fig). Kollagen sammentrekning deteksjon (figur 3B) er basert på en tidligere beskrevet korrelasjonsalgoritme anvendes for å lyse felt bilder [41], som blir validert ved å spore fluorescerende perler innbakt i kollagen-gel (S3-S5, S8 og S9 figurene).
(A) Valg av bilder som viser celle invasjon (grønn) i kollagen i løpet av 48 timer. På ca 9-12 timer cellene begynner å forlate spheroid (utbruddet av invasjon). (B) Start lyse felt bilde av spheroid i kollagen ved 0 timer og hastighets kart kollagen sammentrekning. Pilene viser retningen på sammentrekning og fargekode refererer til hastigheten på sammentrekning (rød-høy og blå-lav). De mørke blå feltene maskere bevegelse av celler og vekst av celleklump, som ikke er tatt hensyn til ved beregning kartet fortrengning hastighet. For kvantifisering gjennomsnittlig forskyvning hastigheten ble beregnet fra 100 pm området utenfor den sfæroide antydet med stiplede linjer. (C) Hastigheten av kollagen kontraksjon (um /h) over en periode på 66 timer. Forskjellige faser kan skilles for sammentrekning hastighet: Ia- initiering med økt akselerasjon, Ib- redusert akselerasjon og II-nedgang, adskilt ved den stiplede linjen. Invasion utbruddet er angitt med gul skyggelegging. (D) blå linje viser den kumulative av den gjennomsnittlige kollagen deformasjon (på figur 3C) og invasjon område (rød). Invasjonen området ble normalisert for hver prøve til den opprinnelige sfæroide området. Skala: 150 mikrometer (lyse felt og GFP) og 300 mikrometer (hastighetskart). Alle verdier er gjennomsnitt ± standard feil (n = 19) fra fem uavhengige eksperimenter.
Den resulterende hastighetskart sekvens (Fig 3B) visualiserer kontraktile lufthastighet som farge-kode, mens pilene gi retning av strømningen. Allerede 3 timer etter såing, oppdager vi en kontraktile kollagen strøm (lys blå til grønn skyggelegging) mot sfæroide (svarte piler). Sammentrekning avtar radialt og viser noen tangentielle variasjoner. Sammentrekning sone rundt den sfæroide utvider seg over tid og sammentrekning hastighet typisk topper ved omtrent 30 timer etter poding, etterfulgt av en gradvis reduksjon.
kontraksjonen er kvantifisert ved å beregne middelverdien sammentrekning hastighet i et område fra 100 um rundt den sfæroide overflate for hver ramme (figur 3B hvit sirkel). Figur 3C viser den resulterende tidsavhengig kontraksjon hastighet i gjennomsnitt over flere forskjellige kulene (n = 19). De samlede reproduserbare egenskaper tyder på at den sfæroide modellsystemet kan brukes til å studere variasjonen av invasjon og mekaniske interaksjoner mellom den sfæroide og modellen ECM.
Tre faser kan skilles fenomenologisk (figur 3C). I den første fase (Ia) sammentrekning blir initiert umiddelbart etter prøvepreparering med en veldefinert sammentrekning hastighet. Sammentrekning akselererer med en lineær økt hastighet inntil 12 timer post-seeding. Den andre fasen (Ib) starter med en endring i økt hastighet og varer til ca 30 timer, da sammentrekning hastighet topper. I visse tilfeller kan den til og med sammentrekning platåer til en stabil, lavere hastighet i løpet av den annen fase (se fig S3). Etter å ha nådd sammentrekning hastighet topp på omtrent 30 til 33 timer observerer vi en generell nedbremsing av kontraksjonen ned til en nesten vekst stopp med en slutthastighet på bare 0,1 + – 0,02 um /h ved utgangen av omkoding (66 h) ( fase II). Ved å sammenligne tidsavhengigheten av den totale kollagen deformasjon med invasjon område (fig 3D) har vi funnet at den sammentrekning forut invasjon i gjennomsnitt ved ca. 9-12h, hvilket bekrefter resultatene av kymograph i figur 2. angrep av invasjonen vises bare når den gjennomsnittlige kollagen deformasjonen når 2-4 mikrometer (fig 3D). Interessant, ved begynnelsen av fase II (33h), observerer vi en mild akselerasjon av invasjon (figur 3D) som forekommer på tidspunktet for sammentrekning hastighetstoppene. Videre viser disse resultater at invasjonen område fortsetter å øke i fase II, selv om den kollagen sammentrekning bremser ned (fase II), noe som tyder på at det ikke er kollagen bevegelse som påvirker invasjonen.
Collagen sammentrekning skaper spenning i nettverket
Collagen sammentrekning antyder at cellene på det ytre laget av den sfæroide trekke på fibrene. Vi ønsker å finne ut om kollagen bevegelsen var et resultat av cellenes aktive trekkrefter, eller simpelthen på grunn av viskøs strømning på grunn av kollagen fordøyelse ved den sfæroide overflaten. Betydningen av trekkraft var tydelig når seeding to kuler i umiddelbar nærhet. I dette oppsettet ser vi at cellene migrerer overveiende over området mellom kuler. Dette vandringsmønster tilsvarer også til mønsteret av de forventede strekkrefter (S4 Fig), som ble observert i andre modellsystemer [31-33,35,42]. I slike multi-sfæroide eksperimenter, er den observerte radial justering vanligvis mer markert enn i enkelt spheroid analyse.
For å estimere de elastiske strekkrefter innenfor kollagen vi ablated kollagen 48h post-seeding ved hjelp av en 800 nm pulset laser ( fig 4A og S6 Movie). På dette tids-punktet kollagenet strømningen i stor grad har stoppet, noe som betyr at systemene har enten avslappet enhver mekanisk spenning ved viskøs strømning, eller at en mekanisk likevekt etableres hvor trekkrefter fra cellene blir balansert ved mekanisk spenning i kollagen. Kollagen er avbildet før og etter ablasjon med en tidsoppløsning på 10 sek. Vellykket ablasjon blir bekreftet ved refleksjon microcopy på samme oppsett, som ikke er avhengig av en fluorescens-signal, men nærværet av de kollagenfibre.
(A) For å studere tilstedeværelsen av spenningen i det øyeblikk da sammentrekning har nesten stoppet, kollagen fibrene ble kuttet 48 timer etter seeding av en CT26 GFP spheroid i kollagen: (i) representative bilder av ablasjon område på 0 og 30 andre etter klipping. Hvite pilen indikerer plasseringen av den sfæroide. Plassen gir ablated området og den stiplede linjen representerer linjen valgt for kymograph i iii. (Ii) co-lokalisering av kollagenfibre før og 30 sekunder etter ablasjon utført ved siden av den sfæroide (hvit pil). Rød og grønn farge er påført til refleksjon fluorescens før og etter snitt henholdsvis visual flytting av kollagenfibre. Skala: 20 mikrometer. (Iii) Kymograph ramme sekvens fra S6 Movie. Den røde linjen viser utviklingen fiber dementi. Stammen er definert som u = L
d /L
0, og er i eksemplet angitt 0.23. Skala: 15 mikrometer (lang bar) og 10 sekunder (korte bar). (B) Kontroll eksperiment i kollagen uten spheroid. Ingen spenning er observert, så det er ingen tegn til tilbaketrekking etter kuttet. Skala: 15 mikrometer (lang bar) og 10 sekunder (kort bar)
Vi observerer en innledende rask fiber forskyvning rett etter klipping (fig 4A ii og S6 Video), etterfulgt av en kontinuerlig forfallent. avslapning prosessen. Fibers flytte til motsatt retning som angitt på kymograph (fig 4A iii). Kontroll geler uten sfæroider viser ingen tegn til spenning og avspenning (figur 4B). Den observerte bevegelse viser direkte at nettverket er på dette tidspunkt fremdeles-punktet under mekanisk spenning. Dette tyder på at kontraksjonen er forårsaket av krefter som frembringes av den sfæroide. Videre er det faktum at den tilbaketrekkingen etter at kuttet er innrettet i retning av den sfæroide viser at cellene på den sfæroide trekk i kollagen, som direkte forklarer den observerte kollagen strømmer. Stamme (figur 4A iii) ble beregnet ved å dividere lengden deformasjon
L
d
ved snitt (i um) ved avstanden fra snittet ved hvilken ingen bevegelse av kollagen ble målt etter kuttet også i mikrometer (
L
0
). Den gjennomsnittlige belastningen etter kuttet ble funnet å være u = 11 + – 5,3% (gjennomsnitt + – SEM n = 14)
Invasion er lokalt trykkes i fravær av spenning
For å finne ut. en mulig sammenheng mellom strekkreftene anvendt av spheroid til kollagen og kreftcelle invasjon, vi asymmetrisk avslappet spenning ved macrosurgery eksperimenter. Dette ble utført ved en rekke av snitt eksperimenter på kollagen geler med integrerte sfæroider, hvor gelene er asymmetrisk skjæres på den ene side av den sfæroide (S5 figur) rett etter kollagen blir polymerisert (figur 5A). I løpet av kollagen sammentrekning, er bygget opp av mekanisk spenning i den retning som vender mot kutt undertrykket på grunn av den frie grense. Invasion og sammentrekning overvåkes i løpet av 72 timer (S7 Movie) og en asymmetri av invasjon kan observeres (fig 5A, 72h). Mens på den side av kuttet kollagen fremdeles kontrakter, observerer man en hemming av celle invasjon på begge, siden som vender mot kutt (lyseblå skraverte område figur 5B) og den motstående siden som vender mot innsiden av gelen (lyserød skraverte området fig 5B). Men på de to sidene vinkelrett kuttet, er invasjon tilrettelagt (hvitt område figur 5B). Dette ble kvantifisert ved å måle den gjennomsnittlige fluorescensintensitet fra cellene utenfor den sfæroide som en funksjon av vinkel. Mens ved 0h, blir ingen sterk avvik av fluorescens tydelig, allerede etter 24 det er en svak økning i kantene av kuttet område, som blir meget dominerende etter 72h som kvantifiseres ved den av to topper i fig 5B. Ettersom de sammentrekkende krefter som ikke er balansert i retningen av kuttet, observerer vi en samlet bevegelse av den sfæroide bort fra skjæringen, som i sin tur reduseres spenningen bygges opp på siden motstående kuttet. Interessant, ser vi også en nedgang på invasjon i retning motstand mot kutt (Fig 5B lys rød). Reduksjonen av invasjonen er kvantifisert ved å sammenligne invasjon i retningen av kuttet, og resten av den sfæroide (figur 5C, n = 54 kuler)
(A) Kollagen (z projeksjon, 4x objektiv).: rød TAMRA kollagen ble polymerisert og kuttet med skalpellen på den ene side. Venstre Bildene viser invasjonen av GFP-positive celler (grønn) på 0, 24 og 72 timer etter seeding. Den stiplede linjen viser en kant av kuttet kollagen og pilen viser retningen av kollagen sammentrekning. Rett: Fluorescerende bilder av vinkel unwinded sfæroide hvor hver horisontale linje svarer til den radielle fluorescensintensiteten profil. Y-aksen av disse bildene svarer til de forskjellige vinkler. Piler viser området av invasjonen på siden av kuttet. Den svarte stiplede linjen gjør venstre grense av det område som brukes for å beregne den gjennomsnittlige fluorescens som er vist i B. (B) Gjennomsnittlig fluorescensintensitet av celler som strekker seg over det første sfæroide overflaten som en funksjon av vinkel Θ. Dette brukes til å estimere utvekst av celler fra den opprinnelige sfæroide størrelse. De ulike fargene representerer gjennomsnittlig intensitet etter 0 (rød), 24 (grønn) og 72 timer (fiolett) av invasjonen. Den skyggelegging av grafen viser den side som vender mot kutt (lys blå), den motstående siden som vender mot innsiden av gelen (lys rød) og de to sider vinkelrett på snittet (hvitt område). Den stiplede linje representerer den utvekst i kuler innstøpt i uskåret kollagen til de tilsvarende tider. (C) Invasion område kvantifisering på siden av kuttet (etter 0 timer) og gjennomsnittlig invasjon område på uskåret side. Invasjon område ble kvantifisert som i figur 3 (gjennomsnitt ± standardavvik, n = 54 av seks uavhengige eksperimenter). (D) Skisse av spenning avhengige invasjonen modell.
Diskusjoner
I likhet med de fleste bevegelige celler, kreftceller gjelder fysiske krefter på deres omkringliggende matrisen [9,43] og dynamisk oppussing ECM. Begge egenskapene tyder på at de kan aktivt endre deres miljø og disse endringene kan bedre forholdene for kreftcelle invasjon [16].
Mens effekter mellom trekkende celler og ECM har allerede tidligere blitt undersøkt på celle-nivå det bør påpekes at studier på spheroid nivå tillate å få innsikt i mulige kollektive effekter. Den store kropp på enkeltcelle arbeidet anvendes for å forstå kraft og strekkelementer i slike mekanisk isolerte systemer. Enkeltceller har vist seg å gjelde sammentrekkende krefter og strekk på kollagen som resulterer i både mekanisk og biokjemisk remodellering, lik den sfæroide. Men på grunn av de begrensede krefter enkeltceller påvirkningen på globale ECM arkitekturen forblir liten sammenlignet med effekten av kreft sfæroider. Unntak fra dette er frittflytende, lav spenning gels hvor matrisen ikke er i stand til å motstå trekk kraften av individuelle fibroblaster.
