Abstract
Bakgrunn Mål
Dagens behandling mål mot avanserte kolorektal kreft er i hovedsak fokusert på epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signal-, men dens additive effekter med kjemoterapi er fortsatt begrenset. En disintegrin og metalloproteinase (ADAM) spalter proheparin-bindende epidermal vekstfaktor lignende vekstfaktor (EGF-proHB). Og løselig HB-EGF aktiverer EGFR. Parallelt med den karboksy-terminale fragment av proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translocates inn i det indre kjernemembranen, og deretter utøver på regulering av celleproliferasjon ved å binde kjerne promyelocytisk leukemi sink finger (PLZF) protein, en transkripsjonen repressor , og dermed forårsaker sitt atom eksport. Vi antok at hemming av HB-EGF-CTF kjernekraft translokasjon kan være en ny strategi for å forebygge cellevekst.
Metoder
12
O-
tetradecanoylphorbor-13- acetat (TPA) ble behandlet for å aktivere ADAM. Ni-tusen kjemiske forbindelser ble screenet for deres effektiviteter i blokkerer binding av HB-EGF-CTF til promyelocytisk leukemi sink finger (PLZF) med Alphascreen system. De oppnådde kandidater ble så brukt til å blokkere bindingen av HB-EGF-CTF til PLZF i kolon kreftceller, HT29 og HCT116. Celleproliferasjon ble undersøkt med en vekstkurve assay. Den intracellulære lokalisering, og sammenhengen mellom HB-EGF-CTF og PLZF, ble vurdert med immunfluorescens farging, og immunpresipitering og Western blotting, henholdsvis. Effektene av oppnådde kandidater på EGFR fosforylering og om kjernefysisk translokasjon av HB-EGF-CTF og eksport av PLZF løpet av angiotensin II type1 reseptor (AT1R) knockdown ble også undersøkt.
Resultater
Telmisartan og kandesartan ble funnet å være potensielle kandidater. Telmisartan inhiberte TPA-indusert celleproliferering sterkere enn candesartan. Telmisartan, men ikke kandesartan blokkert atomtranslokasjon av HB-EGF-CTF, og binding av HB-EGF-CTF til PLZF, under TPA stimulering. Både telmisartan og kandesartan hemmet ikke TPA-indusert EGFR fosforylering, og telmisartan, men ikke kandesartan, hemmet TPA-indusert kjernefysisk translokasjon av HB-EGF-CTF etter knockdown av AT1R.
Konklusjoner
hemming av HB-EGF-CTF kjernefysisk trans med telmisartan kan være en roman strategi for å forebygge celleproliferasjon
Citation. Ozeki K, Tanida S, Morimoto C, Inoue Y, Mizoshita T, Tsukamoto H et al . (2013) Telmisartan hemmer celleproliferasjon ved å blokkere Nuclear Translokasjon av ProHB-EGF C-terminale fragment i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 8 (2): e56770. doi: 10,1371 /journal.pone.0056770
Redaktør: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kina
mottatt: 1 august 2012; Godkjent: 15 januar 2013; Publisert: 22 februar 2013
Copyright: © 2013 Ozeki et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in Aid for vitenskapelig forskning C (KAKENHI 22590704) fra Japan Society for Promotion of Science (JSP). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende konkurrerende interesse: Yoshimasa Inoue og Eiji Nishiwaki er ansatt av kommersielle selskapet Carna biovitenskap inkorporering. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfattere. Alle forfatterne erklærer at ingen økonomisk interessekonflikt eksisterer i forhold til innholdet i artikkelen.
Innledning
Tykktarmskreft er den ledende dødsårsaken fra gastrointestinal kreft [1]. Foreløpig terapeutiske behandlinger mot avanserte kolorektal kreft er i hovedsak fokusert på design av terapeutiske midler som er rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), det monoklonale blokkerende antistoffer som cetuximab og panitumumab [2], [3]. De additive effektene av disse terapeutiske antistoffer pluss kjemoterapi på avansert kolorektal kreft erholdes, men begrenset, fordi den KRAS mutasjon opphevet disse effektene [3], [4].
N-terminale fragmenter av EGFR-ligander, inkludert heparin- bindende epidermal vekstfaktor lignende vekstfaktor (HB-EGF) som anses å være involvert i hovedsakelig celleproliferasjon i colon cancerceller binder til EGFR og indusere dets fosforylering [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. G-proteinkoblet reseptor (GPCR) agonister (f.eks interleukin-8) og 12-
O
-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) indusert EGFR trans gjennom en disintegrinproteinet og metalloproteinase (ADAM) – spaltet proHB-EGF [10], [11]. Karboksysaltene terminale fragmenter av proHB-EGF (HB-EGF-CTF) produsert av ectodomain shedding translocate inn i det indre kjernemembranen, deretter utøve på regulering av celleproliferasjon ved å binde kjerne promyelocytisk leukemi sink finger (PLZF) protein, en transkripsjonen repressor for derved å bevirke dens atom eksport [12], [13]. Derfor er hemming av kjernefysisk transsignale av HB-EGF-CTF anses å være en ny strategi mot utvikling av tykktarmskreft. Men det er ingen bevis for terapeutiske midler som spesifikt blokkerer kjernefysisk translokasjon av HB-EGF-CTF og binding av at for å PLZF
Dermed Målsettingen med denne studien var å: i.) Skjerm for potent kjemisk forbindelser som er i stand til å inhibere interaksjonen mellom HB-EGF-CTF og PLZF via GST-pull down analysen, overflate-plasmonresonans (SPR) spektroskopi og Alphascreen teknologi, ii) validere de inhiberende virkninger av disse potente forbindelser på celleformering, og iii ) bekrefter viktigheten av å hemme den kjernefysiske translokasjon av HB-EGF-CTF i tykktarmskreft cellevekst.
Materialer og metoder
Material
TPA ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Berverly, MA, USA). Anti-EGFR polyklonalt antistoff, anti-fosfotyrosin monoklonalt antistoff (4G10) og normal IgG ble anskaffet fra Millipore (Billerica, MA, USA). EGFR tyrosin kinase inhibitor AG1478 og anti-PLZF antistoff ble kjøpt fra Calbiochem (LA Jolla, CA, USA). Candesartan ble innhentet fra Takeda Pharmaceutical Company Limited (Osaka, Japan) og telmisartan var en slags begavet fra Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Tyskland). Olmesartan og losartan ble kjøpt fra Daiichi Sankyo Company Limited (Tokyo, Japan) og Merck Sharp Dohme (Whitehouse Station, NJ, USA), henholdsvis. Den anti-HB-EGF-CTF polyklonalt antistoff [12] og metalloproteinase-inhibitor, KB-R7785 [14], ble fremstilt. Det monoklonale anti-FLAG M2 antistoff og peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor (PPAR) γ-antagonist, GW9662 [15], [16], ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
plasmid Forberedelse
Et plasmid koding FLAG-merket PLZF ble generert ved subkloning FLAGG sekvens og menneskelig PLZF cDNA inn pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmider for rekombinant ekspresjon av FLAG-merket PLZF derivater, GST-smeltet EGFR-ligander-CTF, og CFP (cyan fluorescein protein) -tagged PLZF ble utarbeidet [12]. Sink fingre (ZNF) 5-8, og EGFR-CTF ble klonet inn pGEX6P-en (GE Healthcare, Little Chalfont, UK).
Cell Kultur
Menneskelig tykktarm kreft cellelinjer, HT29 og HCT116 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), ble dyrket med McCoy’s5A (Sigma), CaCo2 (American Type Culture Collection) ble dyrket med Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 20% føtalt bovint serum ( FBS). Og SW480 (American Type Culture Collection) ble dyrket DMEM med 10% FBS. HT1080 celler og primære humane keratinocytter ble dyrket [12], [17].
GST Pull-down analyse
GST og GST-smeltet proHB-EGF-CTF, GST transformerende vekstfaktor α (TGF-α) -CTF, GST-amfiregulin (AR) -CTF, og GST-epiregulin (EPR) -CTF ble fremstilt [12]. Etter binding GST og GST-EGFR-ligander CTF til glutation Sepharose-kuler, ble lysater inneholdende forskjellige FLAG-merket PLZF derivater inkubert med 20 ul av perler i 2 timer ved 4 ° C. Etter vasking ble bundet proteiner analysert ved immunblotting ved bruk av et anti-FLAG-antistoff.
overflate-plasmonresonans (SPR) spek
A BIA kjerne S51 SPR system® (GE Health care) ble anvendt for å kvalitativt og kvantitativt analysere samspillet mellom de fire immobilisert EGFR-ligand-CTFs (dvs. HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF, og EPR-CTF) og GST-Zn 5-8 PLZF, som var målt i resonansheter (RU). Det rekombinante biotin-EGFR ligand-CTFs (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan) ble individuelt immobilisert (~1000 RU) gjennom aminogruppe kopling på streptavidin (SA) sertifiserte chips. Forskjellige konsentrasjoner av GST-Zn5-8 ble tilsatt til å kjøre HEPES buffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Overflateaktivt P20) ved en strømningshastighet på 30 mL /min i 2 minutter. Sensor chips ble dissosiert med en 30-sek injeksjon av 10 mM glycin-HCl, pH 1,5. De sensorgrams ble analysert med BIA evaluering programvare (versjon 4.1, BIAcore). De likevekt dissosiasjon konstanter ( «bindende konstant»; KD) av hver reaksjon ble beregnet ved å dividere dissosiasjon priser ( «off rate»; kd) av foreningen priser ( «på rate»; KA) (dvs. Kd = kd /ka) .
Imaging av CFP Fusion Proteiner og kvantifisering av cellulære fraksjoner med Nuclear Lokalisert CFP-PLZF
transient transfektert HT1080 celler, og stabil HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, HT1080 /AR, og HT1080 /EPR-celler ble dyrket i 24 timer og deretter celler ble forbehandlet med 10 mM KB-R7785 i serumfritt medium i 30 min. Cellene ble deretter inkubert i serumfritt medium med 100 nM TPA i 1 time. Subcellulære lokalisering av CFP fusjonsprotein ble undersøkt under en epifluorescence mikroskop (Eclipse TE3000, Nikon, Tokyo, Japan) [12].
Alphascreen Analyser
En Alphascreen system® (PerkinElmer, Shelton, CT , USA) ble brukt til å screene et bibliotek av 9000 kjemiske forbindelser (Carna Bioscience Inc., Kobe, Japan) cyclopaedically for deres effekt i å blokkere interaksjonen mellom biotinylert-EGFR-ligander-CTF og GST-Zn5-8 av PLZF. 5 ul av 1,25 mikrogram /ml rekombinant GST-ZnF5-8 ble inkubert med 2,5 ul 1,25 ug /ml biotin-EGFR-ligander CTF i 30 min, og 2,5 ul av anti-GST-antistoff (1,8 ug /ml) ble tilsatt for i løpet av 1 time. Deretter 5 ul streptavidin-belagt donor og anti-GST-IgG konjugert akseptor-kuler (01:01 blanding) ble inkubert i 2 timer i mørke. Alphascreen signaler (tellinger per sekund) ble analysert med en EnVision mikroplateleser (Perkin-Elmer). Analysene ble utført ved 23 ° C i buffer inneholdende 25 mM HEPES, 1 mM MgCl
2, 20 mM NaCl, pH 7,4, 0,1% BSA.
Cell Proliferation Assay (CCK-8 Kit analyse)
En Cell Counting Kit8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ble brukt for å bestemme celleproliferasjon. I korthet, 2 x 10
5 celler per brønn ble dyrket i 96-brønners kulturplater med 10% FBS i 24 timer. Deretter FBS ble erstattet med serumfritt medium i 72 timer med eller uten 30 mM av 12 kandidatforbindelser og telmisartan eller kandesartan (0,3, 3 og 30 uM), og 30 uM av GW9662 under stimulering med 100 nM av TPA. 10 ul av CCK-8-løsning ble deretter tilsatt til hver brønn, og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 2 timer. Optisk tetthet (OD) ble undersøkt ved en bølgelengde på 450 nm.
Overvåke enkelt cellesvulster
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
2-celler per 10 cm av en tallerken på dag 0 i 10% FBS normal vekst medium. Etter 24 timer (på day1), ble ganske isolerte og morfologisk friske celler merket med fasekontrastmikroskopi. Mediet ble erstattet med 5% FBS-medium (kontroll), med eller uten 100 nM TPA, 10 uM av KB-R7785, 100 nM av AG1478, 30 uM av telmisartan og kandesartan, og 50 ng /ml av rekombinant HB-EGF ( Sigma). Mediet ble byttet hver 48. time med friskt medium. Cell morfologi og tellinger ble scoret hvert 24 timer [18].
immunfluorescens Mikros
Celler som dannet en koloni ble byttet til serumfritt medium i 48 timer og deretter inkubert i 60 min i fem % FBS kondisjonert medium med eller uten 10 mM av KB-R7785, 100 nM av AG1478, 50 ng /ml av rekombinant HB-EGF, 30 uM av telmisartan, og 30 uM av candesartan. Deretter ble cellene behandlet med 100 nM av TPA i 90 minutter, og deretter fiksert med etanol og aceton. Den subcellulære lokalisering av HB-EGF-CTF og PLZF ble analysert med immunfluorescens. Primære antistoffer mot HB-EGF-CTF eller PLZF ble anvendt. De sekundære antistoff Alexa Fluor 594 anti-kanin-IgG eller Alexa Fluor-anti-mus IgG (Invitrogen). Bilder ble oppnådd på et Eclipse 80i fluorescens mikroskop (Nikon).
Immunutfelling og Western blotting
Celler i et subsammenflytende tilstand ble skiftet til serumfritt medium i 48 timer og behandlet med TPA i angitte tider. Telmisartan og candesartan ble tilsatt til cellene i 60 min, før de stimuli. Celler ble lysert med lyseringsbuffer, og supernatantene ble samlet opp og inkubert med 1 pg av humant anti-EGFR eller anti-HB-EGF-CTF polyklonale antistoffer i 2 timer ved 4 ° C med ende-over-ende-rotasjon. Immunutfelling og Western-blotting ble utført [11]. De primære antistoffer ble brukt var 4G10 eller anti-PLZF, og anti-HB-EGF-CTF. De sekundære antistoffene som ble anvendt anti-mus IgG HRP-bundet eller anti-kanin-IgG-HRP-bundne antistoff (Cell Signaling Technology). Membranene ble utviklet på en ECL Western blotting detection system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England).
Dempe den Angiotensin II type 1 reseptor (AT1R) og ADAM12
Celler ble transfektert med 30 mikrometer av AT1R og krafse sirnas (Santa Cruz, Delaware, CA, USA), og med 10 mikrometer av ADAM12 og krafse sirnas (Invitrogen) ved hjelp lipofektamin reagens (Invitrogen). 72 timer etter at cellene ble transfektert, ble ekspresjon av AT1R og ADAM12 (Santa Cruz Biotechnology) analysert ved Western blotting.
statistikker og
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Enveis ANOVA og Tyrkia-Kramers multippel sammenligning prosedyre test ble benyttet for å bestemme statistisk signifikante forskjeller (P 0,05)
Resultater
Tvillingsignalveier av EGFR Fosforylering og HB-EGF C. terminale fragment Nuclear Trans under Cell Proliferation (Sitert fra Ref No. [19] og modifisert.)
12-
O
-tetradecanoylphorbor-13-acetat (TPA) indusert epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) transaktivering gjennom en disintegrinproteinet og metalloproteinase (ADAM) – spaltede proheparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor (EGF-proHB) og regulerer celleproliferering [10]. Parallelt karboksyende-fragmenter (CTF) av proHB-EGF (HB-EGF-CTF) translocate inn i det indre kjernemembranen, deretter utøve på regulering av celleproliferasjon ved å binde kjerne promyelocytisk leukemi sink finger (PLZF) protein, en transcriptional repressor, og dermed forårsaker sitt atom eksport (fig. 1) [19].
Sitert fra [19] og modifisert. TPA fremkaller en ADAM-formidlet kløyving av proHB-EGF, og resulterer i ectodomain utstøtingen av dets N-terminale fragment, og generering av et intracellulært C-terminalt fragment (CTF). Det oppløselige HB-EGF binder til EGFR og induserer en hurtig forbigående fosforylering av EGFR. Denne fosforyleringen resulterer i transkripsjon av en rekke gener. I mellomtiden HB-EGF-CTF blir translokert til kjernen, hvor det senere induserer atom eksport av PLZF. Dette resulterer i progresjonen av cellesyklusen. De potent hemmer blokkerer kjernefysisk translokasjon av HB-EGF-CTF. P indikerer fosforylering. Forkortelser: EGFR; epidermal vekstfaktor-reseptor, TPA; 12-
O
-tetradecanoylphorbol-13-acetat, PKCδ; protein kinase Cδ, ADAM; en disintegrinproteinet og metalloproteinase, HB-EGF; heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor, CTF; C-terminale fragment, MAPK; mitogen-aktivert protein kinase, PLZF; promyelocytic leukemi sink finger.
Vi antok at hemming av kjernefysisk translokasjon av HB-EGF-CTF kan føre til en ny strategi for forebygging celleproliferasjon under tykktarmskreftutvikling.
Men det er foreløpig ingen bevis for potente kandidater som spesifikt blokkerer kjernefysisk transsignale av HB-EGF-CTF.
CTF av EGFR-ligander interaksjon med den spesifikke delen av PLZF (ZnF5-8) Vi brukte HT1080 cellen linjene fordi HT1080 celler uttrykker lite endogene HB-EGF forløpere, og de er nyttige for å analysere bindingssteder mellom HB-EGF-CTF og PLZF, og kjernefysisk eksport av PLZF etter overekspresjon HB-EGF forløpere og PLZF derivater [12]. Vi først sertifisert samspillet mellom de cytoplasmatiske domener av EGFR-ligander og PLZF i HT1080 celler som uttrykker de fire proEGFR-ligander og PLZF før screening potente kandidater. Gitt at PLZF coimmunoprecipitates med et antistoff mot CTF av proHB-EGF i HT1080 celler overekspresjon proHB-EGF og FLAG-merket PLZF [12], en coimmunoprecipitation av PLZF ble utført med antistoffer mot CTF av de fire EGFR-ligander (HB-EGF TGF-α, AR, EPR), i HT1080-celler. Den FLAG-merket full lengde PLZF genet ble transient transfektert inn i celler som stabilt uttrykker proHB-EGF, proTGF-α, proAR eller proEPR (Fig. 2A). PLZF ble uttrykt i disse cellene (fig. 2B, kolonne 1). Etter TPA stimulering i 1 time, FLAG-merket PLZF protein som immunoutfelt med hvert antistoff ble påvist ved immunblotting med en anti-FLAG antistoff (Fig.2B, kolonne 2).
(A) Schema av FLAG-merket full lengde PLZF bestående av FLAG, BTB, Center og ni ZnFs. (B) HT1080-celler som stabilt uttrykker pro-HB-EGF, pro-TGF-α, pro-AR og pro-EPR ble transient transfektert med en ekspresjonsvektor som koder for FLAG-merket PLZF. PLZF protein ekspresjon av cellelysatene (lane1), så vel som, celler behandlet med 100 nM TPA i 1 time, og probet med anti-FLAG-antistoffer etter immunoutfelling med anti-EGFR-ligander-CTF antistoffer (lane2) og en anti-normal kanin IgG (Lane3). (C) GST rullegardin analysen. Cellelysater inneholder FLAG-merket PLZF derivater ble inkubert med GST (spor 2), GST-HB-EGF-CTF (spor 3), GST-TGF-α-CTF (lane4), GST-AR-CTF (spor 5), og GST-EPR-CTF (felt 6) perler i 2 timer, og bundne proteiner ble påvist ved immunblotting med et anti-FLAG-antistoff. (D) Schema av FLAG-merket PLZF derivater. Den bindende egenskaper PLZF derivater til GST-av smeltet HB-EGF-CTF, TGF-α-CTF, AR-CTF og EPR-CTF GST i en pull-down analysen, som oppsummert i de riktige baner av hver struktur. Bindingsegenskaper er basert på estimering av båndet intensitet og står i forhold til styrebåndet og angitt med ++ (mer enn 50%), + (50-10%), og – ( 10%)
.
Deretter bestemmes vi bindings regioner av PLZF til de cytoplasmiske domener av pro-EGFR-ligander i HT1080 i GST pull-down-analyse. En GST pull-down analysen viste samspillet mellom EGFR ligand-CTFs og ZNF 5-8 PLZF. Hver rekombinant GST-smeltet CTF (GST-CTF) trakk ned FLAG-merket PLZF like i cellelysater fremstilt fra HT1080 celler uttrykker FLAG-merket PLZF (Fig. 2C, panel 1). Vi videre undersøkt bindende regioner av CTFs i PLZF. Ulike FLAG-merket PLZF derivater (Fig. 2D) var forberedt og inkubert med rekombinant GST-EGFR ligand-CTFs. Hele sink finger region (ZnF1-9) og ZnF5-8 ble dratt ned like ved GST-TGF-α-CTF, GST-AR-CTF og GST-EPR-CTF samt HB-EGF-CTF, men ikke GST alene (fig. 2C, paneler 3 og 4). Ingen av de fire GST-CTFs trukket ned delesjonsmutant som mangler et sink finger region (BTB + senter) (Fig. 2C, panel 2). Vi testet om sletting mutanter av ZnF6-7 (PLZF /ΔZnF6-7) og ZnF5-8 (PLZF /ΔZnF5-8) binde GST-CTFs. Slettingen av ZnF6-7 opphevet bindingen av PLZF til GST-TGF-α-CTF og GST-HB-EGF-CTF, noe som tyder på at TGF-α-CTF og HB-EGF-CTF samhandle med PLZF via ZnF6-7. I motsetning til dette, PLZF /ΔZF6-7 bindes svakt til GST-AR-CTF og GST-EPR-CTF (fig. 2C, panel 5). Endelig testet vi om ZF5-8 er en kritisk region for å kommunisere med AR-CTF eller EPR-CTF. PLZF /ΔZnF5-8 bundet ingen av GST-CTFs (Fig. 2C, panel 6). Disse dataene antyder at ZnF5-8 regionen er avgjørende for samspillet mellom PLZF og CTFs.
Svak Binding Affinity av HB-EGF-CTF og PLZF var viktig for Nuclear eksport av PLZF
For ytterligere å avklare om de fire CTFs direkte kontakt med PLZF, analyserte vi bindingen mellom CTFs og rekombinant GST-merket ZnF5-8 (GST-ZnF5-8) med en SPR system. GST-ZnF5-8 bundet med immobilisert biotin-AR-CTF og biotin-EPR-CTF (fig. 3A) ved en konsentrasjon på 0,03 til 1,0 pM.
K
D for samspillet mellom GST-ZnF5-8 og biotin-AR-CTF var 76,5 nM, og for GST-ZnF5-8 og biotin-EPR-CTF var 146 nM (tabell 1 ). I motsetning til dette
K
D-verdien for interaksjonen mellom GST-ZnF5-8 og biotin-HB-EGF-CTF ble ikke beregnet på grunn av deres hurtige dissosiasjon. Bindingssignalet fra GST-ZnF5-8 til immobilisert biotin-TGF-α-CTF ble observert, men det var lavere enn for biotin-AR-CTF eller biotin-EPR-CTF. Således dissosiasjonskonstant kunne ikke beregnes på grunn av fraværet av dose-avhengig binding av GST-ZF5-8 ved en konsentrasjon på ≤0.5 uM og interferens med de frie SH rester av de syv cysteinene på TGF-α-CTF (Fig . 3A).
(A) Direkte interaksjon mellom EGFR-ligand-CTF og PLZF (GST-merket-ZnF5-8) med SPR-systemet. Det rekombinante biotin-EGFR ligand-CTFs var individuelt immobilisert ved SA sensorbrikkene. GST-Zn5-8 med konsentrasjoner varierende fra 0,03 til 1,0 mikrometer ble deretter injisert med rennende buffer ved 25 ° C og en strømningshastighet på 30 mL /min i 2 minutter. (B) Den ekspresjonsvektor som koder CFP-PLZF ble ko-transfektert inn i vill-type HT1080-celler og HT1080-celler som stabilt uttrykker enten proHB-EGF, proTGF-α, proAR eller proEPR. Cellene ble dyrket i 24 timer og deretter forbehandlet i serumfritt medium med KB-R7785. Celler ble deretter behandlet i serumfritt kondisjonert medium med TPA, og ble observert den subcellulære lokalisering av CFP fusjonsproteinet. For å bestemme prosentandelen av celler (gjennomsnitt ± SD) som demonstrerer lokalisering av kjerne CFP-PLZF ble cellene tellet i minst to transfeksjoner, og minst 200 celler som uttrykker CFP-PLZF ble undersøkt i hvert forsøk. * P 0,05 for stimulus virkning under TPA behandlingen sammenlignet med ingen behandling, og ** P 0,05 for den hemmende virkning under KB-R7785 behandling sammenlignet med TPA behandlingen. (C) Et skjematisk av high-throughput Alphascreen system. Ved eksitasjon ved 680 nm, blir omgivende oksygen konvertert til singlet oksygen (
1O
2) av et fotosensibiliserende middel tilstede i giver kulene. Dersom akseptor perlene er i umiddelbar nærhet ( 200 nm), for å
1O
2 overfører sin energi thioxene derivater som er tilstede i akseptoren perlene som fører til emisjon av lys ved 520-620 nm. En Komplekset består av streptavidin-belagte donor perler og biotinylated EGFR ligander-CTF. Et annet består av anti-GST antistoff-konjugert akseptor-perler og GST-ZF5-8. Hvis det oppstår tilknytningen mellom EGFR ligand-CTF og ZnF5-8, perlene er nær nok til å tillate deteksjon av et signal. Eventuelle inhibitorer for denne interaksjonen vil øke avstanden mellom perlene, og signalet ville gå tapt. (D) Alphascreen signaler med GST eller GST-Zn5-8 inkubert med forskjellige konsentrasjoner av biotin-HB-EGF-CTF. (E) Alphascreen signaler med biotin-HB-EGF-CTF inkubert med forskjellige konsentrasjoner av GST eller GST-Zn5-8. (E) Bindings evnene til HB-EGF, TGF-α, amfiregulin (AR), og epiregulin (EPJ), for å PLZF med Alphascreen system.
Neste, for å avklare kjernefysisk eksport av PLZF utløses av TPA-induserbare utstøtingen av EGFR-ligander, ble den subcellulære lokalisering av PLZF proteinet undersøkt i løpet av det intracellulære translokasjon av de fire CTFs. Ekspresjonsvektoren som koder CFP-PLZF ble transfektert inn i HT1080-celler og stabilt transfekterte HT1080-celler som uttrykker enten proHB-EGF, proTGF-α, proAR eller proEPR. Det er kjent at villtype HT1080-celler konstitutivt uttrykker mindre HB-EGF og dermed er den nukleære translokasjonen av HB-EGF-CTF ikke observert [14]. CFP-PLZF ble hovedsakelig er lokalisert i kjernen av HT1080-celler og i de fire transfektanter. TPA behandling i 1 time induserte en fordeling av CFP-PLZF gjennom hele cytoplasmaet til HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α, og HT1080 /EPR-celler. Men TPA endret ikke subcellulære lokalisering av CFP-PLZF i HT1080 og HT1080 /AR celler. Forholdet mellom CFP-PLZF lokaliserende i kjernen etter TPA-induserbar avgivelse var signifikant lav i HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α og HT1080 /EPR-celler (fig. 3B). Forbehandling med 10 pM av KB-R7785, et metalloproteinase-inhibitor, effektivt opphevet hyppigheten av CFP-PLZF atom eksport etter TPA-stimulering i HT1080 /HB-EGF, HT1080 /TGF-α og HT1080 /EPR-celler (fig. 3B) . Intriguingly, er frekvensen av den kjernefysiske eksport av PLZF omvendt korrelert med affinitet. Disse resultatene indikerer at affiniteten av CTF-PLZF interaksjon påvirker intracellulær lokalisering og funksjon PLZF.
High-throughput screening analysesystem for hemmere som blokkerer Interaksjon mellom ZnF5-8 av PLZF og AR- eller HB -EGF-CTF Smalere 12 Kandidater og Four ARB
en høy gjennomstrømming screening analysen ble utviklet på en Alphascreen® å screene for inhibitor som blokkerer samspillet mellom ZnF5-8 og CTFs. Den Alphascreen assay utforming bygger på det faktum at et signal kan bli detektert kun når streptavidin-belagte donor og anti-GST antistoff-konjugert akseptor perlene er lukket innenfor en avstand på 200 nm. Perlene ble brakt i tett nærhet for denne reaksjon via spesifikke interaksjoner av ZnF5-8 og CTFs komplekser som er koplet til dem (fig. 3C). Økende konsentrasjoner av biotin-HB-EGF-CTF doseavhengig øket Alphascreen signal, når inkubert med GST-ZnF5-8 (Fig. 3D). Økende konsentrasjoner av GST-ZnF5-8 også en doseavhengig økning i signal når inkubert med biotin-HB-EGF-CTF (fig. 3E). De Alphascreen signaler for interaksjonen mellom biotin-AR-CTF, biotin-EPR-CTF, biotin-TGF-α-CTF, og biotin-HB-EGF-CTF med GST-ZnF5-8 var sammenlignbare med bindingsaffinitetene bestemt med SPR system (fig. 3F).
En analyse med biotin-AR-CTF og GST-Zn5-8 av PLZF kunne tydelig viser hemmende effekter av innhentet kandidater på interaksjon mellom biotin-AR-CTF med GST-Zn5- 8 av PLZF grunn Alphascreen signal av biotin-AR-CTF var høyere enn biotin-HB-EGF-CTF. Basert på deres effekt til å blokkere bindingen av AR-CTF så vel som HB-EGF-CTF og til Zn5-8 av PLZF, ble tolv kandidatene, inkludert no.8016, 7701 og 7804 oppnådd ved screening 9000 kjemiske forbindelser (Fig. 4A ). % Inhibering av 10 uM av no. 8016, 7701 og 7804 på samspillet mellom biotin-AR-CTF og GST-Zn5-8 av PLZF var 30,4, 60,5 og 49,9, henholdsvis. Den inhiberende virkning av forbindelse no.8016 på interaksjonen var ikke den høyeste (tabell 2). Imidlertid No.8016 hemmet celleproliferasjon sterkest blant tolv kandidatene i celleproliferasjonsanalyse (Fig. 4B). Basert på resultatene av celleproliferasjon, valgte vi ikke. 8016 som en kandidat. Den halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) oppnådd med sammensatte no. 8016 var 29,9 mikrometer (Fig. 4C).
(A) Twelve kandidatforbindelse strukturelle formel basert på effekt for å blokkere binding av HB-EGF-CTF eller AR-CTF til Zn5-8 av PLZF med Alphascreen system. (B) Inhibitoriske effekter av tolv kandidatforbindelser for TPA-indusert celleproliferasjon i keratinocytter med en celleproliferasjonsanalyse. 2 x 10
4-celler ble behandlet i det kondisjonerte media med eller uten de tolv kandidatforbindelser under TPA stimulering, og absorbansen ved 450 nm ble bestemt etter 12 timer til 60 timer. ** P 0,05 for de hemmende effekter under 12 kandidater behandling vs. TPA behandling. (C, D) Inhibitoreffektene av kandidatene, spesielt sammensatte no.8016 og telmisartan, på binding av AR-CTF til PLZF. Tomter med den prosentvise hemmingen mot ulike konsentrasjoner av sammensatte no.8016 og telmisartan presenteres med IC
50 målte verdiene av Alphascreen system. (E) hemmende effekter av tre ARB kandidater på bindingen av AR-CTF til PLZF. Tomter med den prosentvise hemmingen mot ulike konsentrasjoner av hver inhibitor og hemming presentert med IC
50 verdier.
Vi så fokusert på den spesifikke strukturformel av bifenyl tetrazol i kandidatforbindelse og ytterligere screenet kjemiske forbindelser, inkludert ARB (dvs. telmisartan, kandesartan, olmesartan, og losartan). Med utgangspunkt i effekten av å blokkere bindingen av AR-CTF til PLZF, IC
50 telmisartan, kandesartan, olmesartan, og losartan ble 27,8, 21,9, 87,7 og 28,4 uM, henholdsvis, og deres kjemiske strukturformel er vist ( fig. 4D og E). Disse funnene tyder på at telmisartan og kandesartan er tilfredsstillende kandidater i å blokkere både HB-EGF-CTF og AR-CTF fra samspill med PLZF.
No.8016 av tolv kandidatforbindelser og Telmisartan hemmet Cell Proliferation
keratinocytt-celler har en rekke endogene HB-EGF-forløpere, og de er nyttige for å analysere celleproliferasjon gjennom HB-EGF-CTF signalering. Vi brukte HT1080 cellelinjene når inhibitorer ble screenet [17]. For å undersøke om kandidatenes forbindelser som blokkerte samspillet mellom CTFs og PLZF også hemmet celledeling, vi testet den hemmende effekten av disse tolv kandidatene og fire angiotensin II type 1 reseptor (AT1R) blokkere (ARB) på TPA-indusert celleproliferasjon av keratinocytt med en celleproliferasjonsanalyse. Celler ble behandlet i kondisjonert media med eller uten 30 mM av de tolv kandidatforbindelser og 30 uM av ARB i opp til 60 timer i nærvær av TPA, og absorbansen ble målt hver 12 timer. Forbindelse no.8016 og telmisartan ble funnet å hemme celleproliferasjon (fig. 4B, 5B og D). Videre absorbansverdier gradvis gjenopprettet av de TPA-induserte nivåer (dvs. uten forbindelse no.8016 og telmisartan), når cellene ble vasket i 12 timer etter inkubering med Forbindelse no.8016 og telmisartan (Fig. 5A og C).
(AD) Inhibitoriske effekter av forbindelse no.8016 (A) og fire ARB (B) på TPA-indusert celleproliferasjon i keratinocytter med en celleproliferasjonsanalyse. 2 x 10
4-celler ble behandlet i kondisjonert media med eller uten no.8016 eller fire ARB i løpet av TPA stimulering, og absorbansen ved 450 nm ble bestemt hver 12 timer til 60 timer. (A, C) Inhibering av celleproliferasjon med no.8016 og telmisartan ble verifisert etter en vask i 12 timer. (D) Cellene ble også observert ved mikroskopi.
