Abstract
Ondartede plevravæske departementet (OED) kan være nyttig som en modell for å studere hierarkiske progresjon av kreft og /eller intratumoral heterogenitet. For å styrke begrunnelsen for å utvikle OED-modellen til disse formålene, vi setter ut for å finne bevis for tilstedeværelsen av kreft stamceller (CSC) i OED og vise evne til å opprettholde intratumoral heterogenitet i OED-primærkulturer. Våre studier viser at
kandidat
lunge CSC-uttrykk signaturer (PTEN, OCT4, hTERT, Bmi1, EZH2 og SUZ12) er tydelig i celle pellets isolert fra OED, og OED-cytopathology etiketter også
kandidat
-CSC (CD44, cMET, MDR-1, ALDH) subpopulasjoner. Videre, i primære kulturer som bruker MPE som kilde for både tumorceller og svulsten mikromiljøet (TME), er
kandidat
CSC opprettholdes over tid. Dette gir oss muligheten til å leve-sort
kandidat
CSC-fraksjoner fra OED-tumor mix på grunnlag av overflatemarkører (CD44, c-MET, uPAR, MDR-1) eller forskjeller i xenobiotisk metabolisme (ALDH) . Dermed OED-primærkulturer gir en vei for å hente ut
kandidat
CSC populasjoner fra individ (isogen) OED-svulster. Dette vil gi oss mulighet til å teste om disse cellene kan bli diskriminert i funksjonelle bioassay. Tumor heterogenitet i OED-primærkulturer er dokumentert av variabel immunolabeling, forskjeller i koloni-morfologi, og forskjeller i spredning forekomst av celle subpopulasjoner. Sammen er disse dataene rettferdiggjøre den pågående utviklingen av OED-modellen for etterforskningen av intratumoral heterogenitet, tumor-TME interaksjoner, og fenotypiske validering av
kandidat
lunge CSC, i tillegg til å gi retning for pre-klinisk utvikling rasjonelle therapeutics
Citation. Basak SK, Veena MS, Oh S, Huang G, Srivatsan E, Huang M, et al. (2009) Ondartet pleuravæske som en modell for å etterforske intratumorale heterogenitet i lungekreft. PLoS ONE 4 (6): e5884. doi: 10,1371 /journal.pone.0005884
Redaktør: Mauricio Rojas, Emory University, USA
mottatt: 17. desember 2008, Godkjent: 28 april 2009; Publisert: 12 juni 2009
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Midler til studiet tilbys av Veterans Affairs biomedisinsk forskning Fondene. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-mortalitet i verden. Nåværende terapi er relativt ineffektiv, og 5-yr overlevelse er ca 15%. Intratumoral heterogenitet muligens ligger under motstand av lungekrefttilfellene mot nåværende behandlinger; Dermed sto for intratumoral heterogenitet kan være en viktig nøkkel til å utvikle vellykkede behandlingsstrategier for lungekreft. Dessverre er dagens modeller av lungekreft begrenset i omfang til å studere svulst heterogenitet. Ondartet plevravæske departementet (OED) har en unik mulighet til å kultur et bredt spekter av kreftceller fra en enkeltperson, for å avgrense og karakterisere omfanget av intratumoral heterogenitet funnet i avansert lungekreft.
Bakgrunnen for å velge OED, en regionalt avansert stadium av lungekreft som bebuder en dårlig prognose, som en modell for å undersøke intratumoral heterogenitet er todelt. Først en evolusjonær modell av kreft spår at avanserte sykdomstilstander er mer sannsynlig å skildre heterogenitet [1]. For det andre, basert på personlige observasjoner gjort over flere år med å studere OED [2], [3], [4], [5], visste vi at primærkulturer avledet fra OED vises innledningsvis markant kultur heterogenitet på vei til å etablere morfologisk homogen kreft cellelinjer. Men vi hadde ikke tidligere undersøkt biologisk eller tidsmessige bakgrunn av disse observasjonene i en prospektiv måte.
Det finnes ingen etablerte måter å kultur OED med mål om å opprettholde intratumoral heterogenitet. Derfor setter vi ut for å utvikle en primær kultur modell
de novo
. Denne modellen inkorporerer OED-væske komponent og hentet stromale celler i en svulst mikromiljø (TME) som tett simulerer
in situ
miljø. Våre data viser at inkorporering av disse elementene synes å bevare tumor heterogenitet. Ettersom tumor heterogenitet kan oppstå på grunn av en hierarkisk progresjon av transformerte epitel [6], [7], hypotese vi som inngår i blandingen av tumorceller i MPE er celler som kan fungere som kreft stilk eller progenitorceller. Dette manuskriptet gir bevis på konseptet at
kandidat
CSC kan fraksjonert fra OED primærkulturer. Dette bevis begrunner den videre utviklingen av OED modell for undersøkelse av intratumoral heterogenitet og studiet av
kandidat
CSC-fenotyper.
Materialer og metoder
OED isolasjon, bearbeiding og kultur
Alle fag gjennomgikk skriftlig informert samtykke ved en prosess godkjent av Institutional Review board ved Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). Alle fag var veteraner og aktive eller tidligere røykere og OED-prøvene ble kjøpt opp av store volum thoracenteses. Prøver ble behandlet som beskrevet i figur 1. I korte trekk følgende sentrifugering (200 x g, 20 minutter, romtemperatur), cellepelletene ble resuspendert i en Ficoll-tetthetsgradient. OED-supernatant ble sterilfiltrert og brukes for utformingen av
p
rimary
c
ruk
m
edium [PCM; DMEM-H (HyClone, UT) + 30% volum /volum sterilt filtrert MPE-fluidkomponent + Penicillin-G /Streptomycin 1000 U /ml og Amphotericin B 0,25 ug /ml (Omega Scientific, CA)]. Utvelgelsen av den 30% volum /volum brøkdel av OED-fluidkomponent ble empirisk utledet. Fordi de viktigste oppløselige og /eller cellulære komponenter som bidrar til opprettholdelse av tumor heterogenitet i MPE-primære kulturer er (er) ikke er kjent, og siden det er effusjon-til-effusjon variasjon i konsentrasjonen av løselige faktorer, valg av 30 % volum /volum MPE-fluidkomponent var basert på observasjon av primære kulturer ved lysmikroskopi. I korthet overvåket tre forskjellige MPES i primære kulturer inneholdende enten 100%, 70%, 50%, 30% og 10% MPE-fluidkomponent. Vi evaluerte kultur integritet og variabilitet ved mikroskopi, og målte fraksjoner av flytende døde celler (ved trypan blue-farging) i hver tilstand i løpet av flere dager. Det var ingen åpenbare kvalitative forskjeller i kultur integritet eller variabilitet, og ingen kvantitative forskjeller i flytende døde celler blant de 70%, 50% og 30% v /v MPE-væske forhold. De 100% og 10% v /v MPE-tilstander hadde en økning i celledød i to av tre effusjoner. Denne observasjonen, kombinert med den praktiske hensyn som OED-væske komponenten var
begrensende faktor for varigheten av eksperimentering med primærkulturer, ledet oss til å bruke 30% v /v OED i de resterende tilfellene.
MPE ble ekstrahert fra pleuralhulrommet av lungekreftpasienter. De innsamlede OED var
sedimentert (200 × g) Hotell og
cellepelleten
ble skilt fra OED væske. Cellepelleten ble resuspendert i minimum essensielt medium inneholdende MPE-fluid og legges på en
Ficoll-gradient
. De kjernecellefraksjon, som var stort sett fri for erytrocytter i de fleste tilfeller, ble samlet inn fra innskyte av Ficoll-gradient og suspensjonsmedium, og behandles for farging (
H E, IHC
),
molekylære analyser Hotell og
primære kultur
. De primære kulturer opprettholdes i PCM, og er videre analysert for
soft agar-kolonidannelse
,
FACS analyse Hotell og
in vivo tumorigenesis
.
for å etablere primære kulturer, ble de kjerne cellepellet ekstrahert fra Ficoll-gradient, vasket med DMEM-H, og etter aliquoter ble separert for lagring, innledende molekylære analyser og cytopatologi, ble flere primære kulturer podes. Disse ble direkte observert på en daglig basis, og
pcm
ble erstattet på hver 5-7 dager. Kinetiske analyser av vekst primære kulturer ble utført på tre forskjellige prøver MPE. For disse bestemmelser, ble primærkulturer podet parallelt i 48 brønners plater (Corning Incorporated, New York), ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /brønn i 500 ul kulturmedium. Å telle, ble flytende celler i suspensjon oppsamlet først, hvoretter de adherente populasjonene ble forsiktig vasket med fosfatbufret saltvann (PBS), og frittliggende (Trypsin-EDTA, Sigma, MO). De frigjorte cellene ble så tilsatt til den opprinnelige cellesuspensjon, og total levende celler (Trypan blått fargestoff eksklusjons) ble manuelt tellet ved hematocytometer ved angitte tidspunkter. Slike studier ligger til grunn for de rapporterte resultater som OED-primærkulturer vokste til svært variable og langsomme vekstrater.
Antistoffer
Følgende antistoffer ble brukt for immunhistokjemi (IHC) og /eller flowcytometri (FACS ): anti-CD 44 (Musemonoklonalt, Abcam # 16728 for IHC; Mouse anti-human IgG2b CD44-FITC, BD Biosciences # 555478 eller PE-merket mus anti-human CD44, BD Pharmingen # 555479 for FACS), anti-uPAR (Musemonoklonalt, Santa Cruz Biotechnology # sc-13522), anti-ALDH1A1 (Rabbit monoklonalt, Abcam # 52492), anti-CD166 -FITC (Musemonoklonalt; Abcam # 33403); primære umerket anti-cMET (mus lgG2a, Abcam # 49210), primær umerket anti-MDR-1 (mus monoklonalt, Chemicon # Mab4338), og anti-uPAR (Santa Cruz Biotech # 13522). Sekundære antistoffer anvendt for studiet: Geit F (ab «) 2 anti-mus IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratorier # M35018) og geite anti-muse F (ab») 2-IgM (Jackson Immunoresearch )
cytopathology og Immunolabeling
Cell klynger ble undersøkt ved hjelp av fasekontrastmikroskop (Leica -. Leitz DMRBE) på dekket glass, eller ved lysmikroskopi etter fiksering og farging. For de sistnevnte, celler løst i etanol (Fischer Scientific, PA) eller Z-fix (Anatech, MI) ble sedimentert å generere en celle knapp, som ble parafin innebygd. For IHC ble snittene (5 um) deparaffinized og rehydrert i xylen og etanol. Antigen gjenfinning [10 mM sitronsyre (pH 6), 70 ° C, 30 min, to ganger med mellomliggende vannvasking) ble utført, hvoretter objektglassene ble avkjølt til romtemperatur og sekvensielt vasket med avionisert vann og PBS. Endogen peroksidaseaktivitet ble stoppet (PBS + 2% hydrogenperoksyd), og prøvene ble sekvensielt blokkert [1% bovint serumalbumin /PBS, romtemperatur 1 time, etterfulgt av museserum (Santa Cruz Biotechnology) i 30 minutter, romtemperatur] . Vevssnitt ble deretter vasket to ganger med PBS, inkubert med det sekundære antistoff (HRP-konjugert geit anti-mus, Santa Cruz Biotechnology, 30 minutter, romtemperatur), vasket med PBS og utsatt for DAB substratet kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA. ). Negative kontroller vanligvis anvendes det sekundære antistoff alene i fravær av merking med den primære. De fargede seksjonene ble observert under mikroskop (Leica – Leitz DMRBE eller Olympus IX71) og bildene ble analysert ved hjelp av Openlab programvare. De positivt fargede celle områder ble beregnet ved hjelp av Image Pro Plus programvare. Cellegruppene ble manuelt definert ved hjelp fase bilder og uregelmessig AOI verktøy og de resulterende gruppene ble segmentert basert på en empirisk bestemt positiv farging terskel. Prosent av positivt fargede celler ble beregnet ut fra det brøk område av flekker innen totale klyngen området.
Revers transkriptase-PCR (RT-PCR)
RNA ble ekstrahert fra den primære OED og kultur isolerer hjelp Trizol reagent og Fast Track 2,0 mRNA isolert sett (Invitrogen Inc., Carlsbad, California). 500 ng av mRNA var omvendt transkribert ved hjelp av RT kit (Invitrogen, Inc., Carlsbad, California) etter produsentens anbefalinger. To pl alikvot av det syntetiserte cDNA ble anvendt for PCR for amplifisering av PTEN, OCT4, Bmi1, hTERT, SUZ12 og EZH2 gener. Primerne som ble brukt var som følger:
PTEN
Forward – 5 «GGACGAACTGGTGTAATGATATG 3», foreta omvendt 5 «TCTACTGTTTTTGTGAAGTACAGC 3»,
Oct4
videresending 5’CAACTCCGATGGGGC CCT 3 «, og omvendt -5 «CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3»
Bmi1
Forward – 5 «AATCTAAGGAGGAGGTGA 3», foreta omvendt 5 «CAAACAAGAAGAGGTGGA 3»,
hTERT
Forward -5 «GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3», foreta omvendt 5 «CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCTTCA 3»,
SUZ12
Forward – 5 «GATAAAAACAGGCGCTTACAGCTT 3», og Omvendt 5 «- AGGTCCCTGAGAAAATGTTTCGA – 3»,
EZH2
Forward 5 «TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3», Omvendt 5 «TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC 3». For
PTEN
forsterkning, forholdene var som følger: initial denaturering ved 94 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 32 sykluser ved 94 ° C for1 minutt, 57,5 ° C i 1 minutt, og 72 ° C i tre min. En endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter ble anvendt. Amplifikasjonsbetingelser for
Oct4
var en innledende denaturering i 5 minutter ved 95 ° C, etterfulgt av 32 sykluser ved 95 ° C i 30 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 5 minutter. Amplifikasjonsbetingelser for
Bmi1
: innledende denaturering ved 94 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 32 sykluser ved 94 ° C i 1 minutt, 53 ° C i 1 minutt, 72 ° C i 1 minutt, og en endelig forlengelse i 7 minutter ved 72 ° C. For
hTERT
forsterkerBetingelsene var: en innledende denaturering ved 94 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 32 sykluser ved 94 ° C i 50 sekunder, 52 ° C i 50 sekunder, 72 ° C i 1 min, og en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. For SUZ12 og EZH2 forsterkning: innledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sekunder; 55 ° C i 30 sekunder; 72 ° C i 30 s, og en 7 minutters endelig forlengelse ved 72 ° C. PCR-produktene ble separert på 8% TBE (50 mM Tris-borat pH 8,0, 1 mM EDTA)-geler, etterfulgt av etidiumbromidfarging. Geler ble analysert ved hjelp av Kodak 1D programvaren.
Flowcytometri og Aldefluor analysen
FACS analyser av primære dyrkede OED celler ble utført ved hjelp av standard mutichannel FACS analyse med FACSCalibur cytometer (Becton Dickinson, San Jose , CA) og FCS Express analyseprogramvare (De Novo Software, Ontario, Canada). Både ikke-adherente og adherente celler ble samlet opp og slått sammen. Celler i primærkultur ble løsnet ved hjelp av behandling med trypsin /Versine, vasket med PBS som inneholder 2% BSA, og direkte merket med fluorokromkonjugerte tagget primære antistoffer, eller umerket primære antistoffet med fluorokromkonjugerte merket sekundære antistoffer (som angitt nedenfor). Både primære og sekundære antistoffkonsentrasjonene ble konsekvent hevdet at 1 mikrogram /1 × 10
6 celler; Cellene ble merket i 45 minutter ved romtemperatur og i rekkefølge vasket tre ganger i PBS inneholdende 2% FBS, resuspendert i PBS og holdt på is før FACS-analyser. Den Aldefluor (Stemcell Technologies, Durham, NC, USA) analysen, som måler aldehyd dehydrogenase (ALDH) aktivitet ble utført i henhold til produsentens retningslinjer. MPE-celler fra primære kultur ble suspendert i Aldefluor analysebuffer inneholdende ALDH-substrat, BODIPY-aminoacetaldehyd (BAAA; 1,5 mM) og inkuberes i 50 min ved romtemperatur. For å bekrefte spesifisiteten, ble en parallell prøve inkubert under identiske betingelser, men i nærvær av et 10 gangers molart overskudd av ALDH-inhibitor, diethylaminobenzaldehyde (DEAB). Dette resulterende reduksjon i fluorescens intensitet ALDH-positive celler ble brukt til å kompensere flowcytometeret analyser.
Resultater
OED-egenskaper, foredling og primær kultur
Å utvikle en modell for å studere lungekreft endophenotypes i primærkultur, vi fraksjonert cellen og væske kamre av MPE (figur 1). De kliniske karakteristika ved effusjoner som ble brukt til å generere dette datasettet var typisk for MPE (tabellene 1 og 2, se nedenfor). Syv av ni effusjon var ondartet på grunnlag av cytopathological diagnose (tabell 1). I to OED endelig cytopathology tolkning fra 100 ml prøve prøven var «svært mistenkelig, men mangelfulle»; disse sakene ble tatt med fordi veksten av svulsten var tydelig i primærkulturer (inkludert
in vivo
i ett tilfelle, data ikke vist). Tidligere studier har indikert at lang pletteeffektivitet og utledning av primære kulturer fra kliniske prøver lungekreft er dårlig, og er avhengig både av dyrkningsbetingelser og vertsrelaterte faktorer, [8], [9], [10], [11]. Imidlertid gjorde disse studiene ikke supplere primærtumor kulturer med komponenter fra
in situ
svulstens mikromiljø (TME), muligens fordi den primære eller eneste mål var å etablere udødelige tumorcellelinjer. Faktisk, for å utlede «ren» tumorcellelinjer i definerte forhold, alle tidligere fremgangsmåter tok forholdsregler for å minimalisere «forurensning» av kulturer med TME-elementer. Derfor, hvis tydelig tumorcelle subpopulasjoner eksistert i enkelte svulster som var avhengig av TME elementer for å overleve, så bruker noen kunstig TME kan ha konferert en vekstfordel til spesifikke tumorcelle undergrupper i et kontinuerlig kultursystem. Dermed er det mulig at kreft cellemodeller ble «valgt for» av kulturen TME som ble brukt til å utlede tumorcellelinjer.
Vi tenkte at den omfattende tilbud av tumorcelle endophenotypes ville være best studert i primærkulturer som innlemmet autolog TME. Således, i et forsøk på å opprettholde intratumoral heterogenitet
ex vivo
, både tumor-kjernedannelse som ledsager cellepopulasjon og den fluidkomponent av MPE ble anvendt for å berike den primære kultur-TME. For å overvinne den tidligere anerkjent ineffektivitet for å etablere primærtumor kulturer, og basert på empiriske observasjoner beskrevet i metodene, valgte vi den «optimale» tilstand som 30% MPE-væske komponent blandet v /v inn basismedium som inneholder antibiotika (primær dyrkingsmedium eller PCM). I
pcm
, både primær kultur og serie passasjer ble påført med høyere mangfold i morfologi, og kulturer syntes å være mer robust (sammenlignet med parallell vekst i foster bovin serum, data ikke vist). Videre er anvendelsen av en 30% volum /volum-fraksjon av MPE-fluid tillatt oss å bevare denne begrensende reagens for lengre varigheter av eksperimentering med primærkulturer. Ved hjelp av denne metoden, vi etablert primærkulturer av OED-svulster fra alle syv forsøk.
Foreløpige analyser indikerte at supernatanten ble høyanriket med inflammatoriske cytokiner, med konsentrasjoner av interleukin (IL) 1, IL 6, CXC chemokine ligand 10 (IP10), CC-kjemokin-ligand 2 (MCP1), og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) som ble estimert til å være 10 ng /ml. Disse og andre faktorer, som trolig stammer fra svulsten, stromal og /eller sirkulerende celler i OED (tabell 2), bidro til en kompleks blanding av cytokiner, kjemokiner og vekstfaktorer i OED-væske komponent. Med hensyn til de cellulære OED-komponenter, med kjerne celletall varierte fra 1,3 x 10
8 til 2,5 x 10
9 celler pr liter effusjon. Den dominerende sirkulerende celletype i TME var lymfocytter (gjennomsnitt ± STDEV: 60 ± 26% av total 681 ± 560 WBC /ul), med betydelig (mer enn 1%) fraksjoner av PMN, makrofager, monocytter og mesothelial celler (tabell 2) i nesten alle effusjon. Derfor, i form av deres sirkulerende celle sammensetning og biokjemi (de var alle eksudat) [12], de effusjon vi studerte var typisk for OED.
Bevis på intratumoral heterogenitet i utvunnet OED-vevsprøver
Figur 2A viser representative H E farget cytopathology etter Ficoll tetthet gradering. Som vist, ble OED tumoren variabelt inneholdt i utydelige klynger av celler av varierende sammensetning, eller så godt organisert sfæroider. Nærmere undersøkelser antydet at begge disse tumorcelle konglomerater selv ble organisert i forskjellige mikroområder. Vi baserte denne mistanken på observasjon at når vi merket prøver for
kandidat
CSC-markører, vi ofte funnet flekker innen diskret foci i aggregatene (figur 2B). For eksempel, farget vi OED patologiprøver for brøk uttrykk for CD44. CD44, celleoverflatereseptoren for hyaluronat [13], hadde vært benyttet som et underlag etikett for å velge CSC. CD44 ble tidligere anvendt alene [14] og i forbindelse med andre celleoverflatemarkører for å sortere CSC fra forskjellige epiteliale kreftformer, både humane og murine modell systemer [15], [16], [17], [18], [19] , [20], [21]. Alle OED prøvene viste en CD44 + fraksjon, som varierte fra anslagsvis 8% til 47% av kjerne celler ved immunhistokjemi (IHC) (figur 2B, figur S1 A og S1c). I tillegg til CD44, cellefraksjoner vises også andre
kandidat
CSC-markører, cMET [22], [23] og MDR-1 [24], [25] (figur 2B). Tidligere har andre forskere har også utnyttet forskjeller i xenobiotisk metabolisme av cellene for å skille CSC fra tumor blandingen. En slik teknikk benyttes i Aldefluor ™ assay (StemCell Technologies), som segregerte
anden
CSC på basis av ALDH1A1 aktivitet [26], [27], [28]. Som CD44, fant vi ut at celler som er merket for ALDH1 ble sett i aggregerte lommer i OED-tumorer (figur 2B, Figur S1b). Merket variasjon av flekker var tydelig selv innenfor en enkelt prøve. Således kunne man finne adskilte lommer av svak, middels og sterk ALDH1 farging (figur 2B). Fremst, disse dataene indikerer at enkelt OED prøvene hadde ulike immunoglobulin og metabolske fenotyper. Dessuten, hvis
kandidat
CD44 og ALDH merkene var gyldige surrogatmarkører for CSC, så CSC syntes å ligge i diskrete beskyttet mikroområder (nisjer) i OED-tumor klynger. Til slutt, selv om den timelige uttrykk og funksjonell sammenheng av disse CSC-etiketter har ennå ikke bestemt, data antydet at cellene uttrykker
kandidat
CSC markører muligens kunne være atskilt fra OED-tumor mix.
(A) Representative cellegrupper og kuler i OED-cytopathology. Representant H E av vevsprøver hentet fra OED viser klynger og organiserte kuler av varierende morfologi, og celle /stromale komposisjoner (20 × eller 100 ×). (B) IHC for kandidat CSC markør uttrykk. Vevsprøver avledet fra OED ble immunolabelled for
kandidat
CSC markører, inkludert CD44 (40 × og 400 ×), cMET (100 × og 400 ×), MDR-1 (100 × og 400 ×), og ALDH -1 (40 × og 200 ×).
OED-svulster uttrykke CSC-markører innblandet i stamcelleekspansjon eller pluripotency programmer
Vanligvis oppstår svulster på grunn av en unormal arrest i løpet av vev-differensiering [29], [30]. En av de første manifestasjoner av differensiering-arrest er at det er en utvidelse av stamceller bassenget. Dermed kan molekylære signaturer av stamceller fungere som
kandidat
CSC-biomarkører. I denne forbindelse har dyrestudier implisert PTEN for riktig vedlikehold og differensiering av den perifere stamceller lunge befolkning [31]. PTEN promoter stanse er dokumentert i human lungekreft [32], impliserer denne veien i sin utvikling og /eller progresjon. Telomerase (hTERT) aktivisering bidrar til lungekreft patogenesen [33], og hTERT er ofte aktivert i lungekreft. Sammen med p16 (INK4A), synes hTERT å være nødvendig for celleudødelig som karakteriserer både stamceller og tumorceller [34], og dens uttrykk kan tyde på en dynamisk endring i brøkdel av de udødeliggjort fenotype [35], [36]. Felles markører mellom
kandidat
CSC og stamceller har også stier som medierer celle selvfornyelse og pluripotency. Oct4 er en embryonal markør som er forbundet med pluripotency, og er ofte brukt til å merke CSC-fenotype [21], [37]. På lignende måte er reguleringen av pluripotent tilstand epigenetiske styrt av strukturelle endringer i kromatin [38], [39], [40]. Transkripsjonen kontroll under pluripotent tilstand påføres ved polycomb gruppen (PCG) av proteiner som arbeider for å endre kromatinstruktur. SUZ12, EZH2, og Bmi1 er komponenter av PCG komplekser, og fordi deres uttrykk i utvikling er karakteristisk for vev stamceller, de har også blitt brukt til å merke
kandidat
CSC-fenotype [6], [7] [41]. For å teste om disse molekylære signalene fra
kandidat
CSC kunne påvises i MPE-tumorer, ble RNA ekstrahert fra de kjernecellefraksjoner og RT-PCR for disse markørene ble utført. Vi fant ut at disse
kandidat
CSC-biomarkører ble uttrykt i ulike OED-tumorer (figur 3). Disse data antydet at lungen CSC-fenotype ble opprettholdt i MPE til tross for den inflammatoriske miljøet av OED-TME, i motsetning til noen konvensjonelle postulerer vedrørende CSC nisje miljø. Kanskje var dette fordi CSC var beskyttet (som beskrevet) fra løselig TME i tumor konglomerater som er dokumentert i OED. Enda viktigere, disse resultatene også sette scenen for dynamisk sporing disse molekylære signaler som eksperimentelle endringer i dyrkningsforholdene blir introdusert i arbeidet med å berike for CSC-fenotype.
Expression profiler av PTEN, Oct4, hTERT, BMI1 , SUZ12, og EZH2 ble studert av revers transkriptase-PCR. RNA ekstrahert fra de kjerne cellepellet av OED ble reverstranskribert og cDNA ble brukt i PCR-amplifikasjon av de respektive gener. PCR-produktene ble separert på 10% TBE-geler, etterfulgt av etidiumbromidfarging, og analysert ved bruk av Kodak-1D-programvaren. PTEN, hTERT, SUZ12, EZH2 ble jevnt uttrykt i all OED, mens BMI1 og Oct4 uttrykk ikke ble påvist i enkeltprøver. Beta tubulin ble brukt som en lasting kontroll.
Bevis på intratumoral heterogenitet i OED-primære kulturer
OED-primærkulturer ble etablert i PCM. I disse forholdene, de primære kulturer vises ulike morfologi (Figur 4A) og variabelt langsomme vekstrater. De primære kulturene typisk tok flere uker å «modne» (som definert ved vekst i kultur fartøyet nærmer seg 70-80% konfluens). I løpet av dette intervallet, ble klynger og kuleformede strukturer som ble observert i den innledende MPE-cytopatologi ikke godt konservert. Likevel er de primære kulturer viste en fenotypisk heterogenitet som tidligere ikke hadde vært undersøkt. I løpet av sin utvikling, ble primærkulturer alltid består av kolonier med varierende morfologi (flytende aggregater som ekskluderer trypanblått, gigantiske cellekolonier, fibroblastoid og brosteinsbelagte klynger), til tross for å være i samme kolbe med en tilsynelatende identisk TME (Figur 4A). Disse koloniene syntes å utvide med varierende priser, noe som tyder på at de hadde ulike proliferative indekser, til tross for å være i en «vanlig» miljø. Vi tenkte at hvis CSC, som vev stamceller, hadde en redusert omsetning, så forskjeller i spredning ville tillate oss å skille fraksjoner beriket for CSC. For å teste om en slik strategi var mulig med MPE- primærkulturer, har vi utviklet en levende celle sortering strategi som brukes carboxyfluoroscein succinimidyl ester (CFSE) i en test-merkeordning for å fraksjonere celler basert på ulike replikering indekser. CFSE er en membran som er gjennomtrengelig reagens som spaltes av intracellulære esteraser for å gi et fluorescerende amin-reaktiv metabolitt som forblir i cytoplasma i flere uker. Hver gang celler gjennomgår inndeling, blir mengden av CFSE tilstede i hver dattercelle halvert. Celler som ikke replikere beholde etiketten. Dermed
hvis
CSC er langsomt replikere,
da
etiketten beholde befolkningen skal bli beriket for CSC. Selv om de cellulære linjene som utgjør etiketten beholde undergruppe må være bedre definert, disse pilot, proof-of-concept studier antydet at OED-tumor fraksjonering basert på forskjeller i sprednings indeksene var mulig (se etiketten bevarende cellepopulasjonen-M1 som framgår over tid i
PCM;
4B). Oppsummert forskjeller i morfologi, spredning, men da overflaten og metabolske egenskaper muligens reflektere diskrete endophenotypes av kreftceller i OED. Selv om de funksjonelle korrelater knyttet til hver av disse funksjonene har ennå å bli ytterligere utforsket, våre resultater tyder på at i OED-primærkulturer, etterforskningen av intratumoral heterogenitet er gjennomførbart.
(A) Morfologiske heterogenitet i primærkultur. Tre forskjellige OED (prøve A, prøve B og Prøve C) dyrket i PCM ble evaluert for koloni morfologi. Hver kolonne (A, B, og C) representerer en distinkt mønster. Representative mikrofotografier av kolonien heterogenitet ved fasekontrastmikroskopi på dagene 3, 15 og 20 av primær kultur (rader 1, 2 og 3, henholdsvis) er presentert. Mikrofotografiene i Rows 1, 2 og 3 er på forstørrelser av 40 ×, 100 × og 400 × hhv. (B) MPE-subpopulasjoner i primær kultur kan bli fraksjonert på grunnlag av forskjeller i proliferasjon: Representative strømnings histogrammer av Day en kontra dag 9 av en CFSE-merket primær kultur. Med utvidelsen, subpopulasjoner som er proliferativ mister CFSE etiketten, og de som er stillestående beholde etiketten. I dette eksemplet,
på dag 1, 96,14%
av tellingene ligger innenfor området styrt av M1; på
dag ni, 8,36%
av tellingene ligger innenfor området inngjerdet av M1.
Rasjonelt fraksjone OED-primærkulturer å sortere den antatte CSC-undergruppe
Med molekylære signaturer som tyder på at CSC er til stede i OED, vi neste testet om vi kunne fange
kandidat
CSC fra OED-svulster. På modning, ble OED-primærkulturer sortert på grunnlag av
kandidat
CSC-markører. Interessant, i hvert tilfelle testet hittil, på overflaten immunfenotypen av celler i primærkultur som er generelt betegnet en tilsynelatende utvidelse i CD44 + fraksjon (figur 5). Mens cellene var nesten jevnt positiv for CD44 ekspresjon, fraksjonene var mer variabelt positivt for cMET, CD166 [42], og uPAR [43] uttrykket (figur 5). I tillegg, ved bruk av en fluorescerende assay som ble rapportert å sortere putative CSC fra lungecancer, brystcancer, og multippel myelom [26], [27], [28] på grunnlag av differensial ALDH-aktivitet, er en liten brøkdel av OED-avledede primære svulster vises ALDH
hi /CD44
+ fenotype (figur 6). Sammen er disse dataene viste at
kandidat
CSC-fraksjoner kan skilles fra primærkulturer av OED-tumor.
