Abstract
Nylig, rettet mot kreftstamceller (cscs ) metabolisme blir en lovende terapeutisk tilnærming for å forbedre kreft behandlingsresultatene. Imidlertid er kjennskap til den metabolske tilstand av cscs i småcellet lungekreft likevel mangler. I denne studien fant vi at cscs hadde signifikant lavere oksygenforbruk rente og ekstracellulære forsuring rente enn ikke-stilk kreftceller. I mellomtiden, denne undergruppe av celler konsumert mindre glukose, produserte mindre laktat og vedlikeholdt lavere ATP nivåer. Vi har også avslørt at cscs kunne produsere mer ATP gjennom mitokondrisk substrat-fosforylering nivå i løpet av åndedrettshemming sammenlignet med ikke-stilk kreftceller. Videre var de mer følsomme for undertrykkelse av oksidativ fosforylering. Derfor oligomycin (hemmer av oksidativ fosforylering) kan alvorlig svekke sfære dannende og tumor-initiering evner cscs. Vårt arbeid antyder at cscs representerer metabolsk inaktive kreft subpopulasjoner som opprettholder i en tilstand som viser lav metabolsk aktivitet. Imidlertid kan mitokondrisk substrat-nivå fosforylering av cscs være mer aktiv enn den av ikke-cancerceller stilk. Videre cscs viste fortrinnsrett bruk av oksidativ fosforylering løpet glykolyse for å møte deres energibehov. Disse resultatene utvide vår forståelse av cscs metabolisme, potensielt gi nye behandlingsstrategier rettet mot metabolske veier i småcellet lungekreft
Citation. Gao C, Shen Y, Jin F, Miao Y, Qiu X (2016) Cancer Stem celler i småcellet lungekreft cellelinje H446: større avhengighet av oksidativ fosforylering og Mitokondriell substrat-nivå fosforylering enn Non-Stem kreftceller. PLoS ONE 11 (5): e0154576. doi: 10,1371 /journal.pone.0154576
Redaktør: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, MEXICO
mottatt: 25 mars 2015; Godkjent: 15 april 2016; Publisert: 11. mai 2016
Copyright: © 2016 Gao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. Denne studien ble støttet av forskningsprogrammet av Applied Basic og cutting-edge teknologi i Tianjin i henhold til kontrakt nummer 14JCZDJC35500
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er en type svært aggressiv svulst som utgjør ca 15% av alle lungekreft tilfellene [1,2]. Selv om pasienter med SCLC innledningsvis ha en god klinisk respons på kjemo- strålebehandling, vil de fleste pasienter som behandles med disse metodene tilbakefall etter en kort periode i [3]. Dette kan delvis tilskrives manglende utrydde kreft stamceller (cscs), som har evnen til å fornye seg selv, til å differensiere i flere linjene og å initiere svulster hos immunsupprimerte mus [4,5]. Cscs antas å være mer motstandsdyktig mot radio- og kjemo-terapi enn de ikke-stammen cancerceller [5]. Derfor er det viktig å utvikle lovende terapeutiske strategier rettet cscs ved å overvinne sin legemiddelresistens.
Nylig, synes det stadig klarere at «metabolske omprogrammering» av kreftceller har vært en voksende kjennetegnet av kreft fenotype [6 , 7]. I motsetning til normale celler, kreftceller innta en alternativ metabolismeveien og utviser forbedret glukosemetabolismen og produksjon av laktat selv i nærvær av oksygen [8-10]. Denne fortrinnsrett bruk av aerob glykolyse [11], er kjent som Warburg virkning. Selv om aerob glykolyse er tenkt å være en nær universelt fenomen i kreftceller, metabolske funksjoner i cscs og deres relevans i kreftbehandling forbli fortsatt uenighet [12]. Ciavardelli et al [13] har rapportert at brystkreft stamceller er mer glycolytic enn sine ikke-stilk kolleger. Studien av Liao [14] og hans kolleger har også vist at eggstokkkreft stilk-lignende celler hovedsakelig forbrenne glukose ved anaerob glykolyse og pentose syklus. I mellomtiden, Yuan et al [5] har vist at glioblastom stamceller (GSCs) utviser fortrinnsrett bruk av glykolyse løpet mitokondrie respirasjon. Men Vlashi et al [15] har indikert at GSCs stole mer på oksidativ fosforylering (OXPHOS) enn glykolyse. Lagadinou et al [16] også har vist at cscs viste en større avhengighet av OXPHOS for energiforsyning i leukemiceller. Pasto et al [9] har vist at kreftstamceller fra epiteliale kreftpasienter på eggstokkene viste en metabolsk profil dominert av OXPHOS. Selv om begrensede publiserte data finnes om metabolske egenskaper cscs [17], ingen i SCLC. Derfor, for å designe nye terapeutiske tilnærminger som er rettet mot metabolske veier av cscs i SCLC, er dyp kunnskap om den metabolske tilstand av denne cellen undergruppe haster [7].
For å utforske de metabolske egenskaper cscs, det første oppdraget er berikelse for cscs i SCLC celler. Isolering av cscs både in vivo og in vitro er avhengig av spesifikke overflate biomarkører som letter sortering av kreftceller i fenotypisk forskjellige subpopulasjoner [18]. Urokinase-type plasminogen aktivator reseptor (uPAR) er en glykosylfosfatidylinositol (GPI) -anchored protein [19] og er vanligvis oppregulert i flere typer kreft [20]. Viktigere, har vårt arbeid og andres identifisert uPAR som en formidler av kreft stamcelle funksjon [21,22]. For eksempel, uPAR
+ celler i SCLC-cellelinjer viste multimedikamentresistens og forbedret klonogene aktivitet in vitro sammenlignet med uPAR
– celler [23]. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har også vist at stammen lignende cellepopulasjoner kan bli beriket i uPAR
+ celler [24]. Derfor brukte vi uPAR sortering å berike for cscs i SCLC cellelinje H446.
I denne studien, må vi først sammenlignet den metabolske tilstand av cscs med at ikke-stilk kreftceller og funnet ut at cscs var metabolsk inaktive svulst subpopulasjoner som bodde i en tilstand som viser lav metabolsk aktivitet. Deretter studerte vi de samme veiene som cscs store energiproduserende i SCLC. I motsetning til ikke-stilk kreftceller, cscs viste fortrinnsrett bruk av OXPHOS løpet glykolyse for å møte deres energibehov. I tillegg fant vi også at cscs kunne produsere ATP gjennom mitokondrie substrat-nivå fosforylering.
Materialer og metoder
Cell kultur
SCLC cellelinje NCI-H446 ble innhentet fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse cellene ble dyrket i RPMI-1640 (Biological Industries) supplert med 10% FBS (HyClone Thermo Scientific), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i fuktet luft ved 37 ° C med 5% CO
2.
Strømningscytometri-analyse
cellesortering ble utført på enkeltcellesuspensjon fra H446-celler farget med primært antistoff mot uPAR (mus monoklonalt antistoff, 1: 100, American Diagnostica, nr 3936). Deretter ble cellene vasket og inkubert med FITC-konjugert sekundært antistoff (Dako) i 30 min. Alle prøvene ble målt ved hjelp av en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences) og analysert med Cellquest programvare (BD Biosciences). uPAR
+ celler og uPAR
– celler sortert etter FACS ble brukt i alle våre eksperimenter (S1 fig)
Oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring rente
extra Flux Analyzer. gir mulighet for å analysere oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær surgjøring hastighet (ECAR) av et definert antall celler i sann tid og for å overvåke deres respons til medikamentbehandling [15]. Celler ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
5 celler hver brønn av 24-brønners plater. Den følgende dag ble cellene vasket og nytt medium ble tilsatt. Patronen ble lastet for å dispensere tre metabolske inhibitorer sekvensielt som bestemte tidspunkter: oligomycin (inhibitor av ATP syntase, 1 uM), etterfulgt av FCCP (en protonophore og uncoupler av mitokondriell OXPHOS, 0.3μM), etterfulgt av tilsetning av en kombinasjon av rotenon (mitokondrie kompleks I-inhibitor, 1 um) og antimycin (mitokondrie kompleks III-hemmer, 1 um). Basal OCR og ECAR ble målt, samt endringer i ECAR forårsaket av metabolske hemmere er beskrevet ovenfor. Flere parametere ble trukket fra endringer i OCR, som basal OCR, maksimal mitokondrie kapasitet, og mitokondriereservekapasitet (= [maksimal mitokondrie kapasitet] – [basal OCR]). Som beskrevet tidligere [15,25]
målinger og beregning av bioenergetisk organisasjon
glukoseopptak og laktatproduksjon
for måling av glukoseopptak, sorterte cellene ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
6 /ml /brønn i 6-brønns plater og inkubert i glukose-fri RPMI 1640 i 2 timer ved 37 ° C. Etter tilsetningen av 2- [N- (7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-yl) amino] -2-deoksy-D-glukose (2-NBDG) til en sluttkonsentrasjon på 100 uM, cellene ble inkubert i ytterligere 1 time, vasket to ganger med PBS og analysert ved hjelp av strømningscytometri [26]. L-laktat produksjon ble oppdaget ved hjelp av en L-laktat analysesett (Eton Bioscience, San Diego, USA) som tidligere beskrevet [27] og i henhold til produsentens instruksjoner og L-laktatnivåer ble normalisert til celle tall. De bioenergetiske organisasjoner av cellene ble beregnet som beskrevet i rapporten fra Hao et al, brukte vi følgende: Lac (c) = laktatkonsentrasjonen i kontrollmediet etter 6 timer inkubering; Lac (o) = laktatkonsentrasjonen i mediet etter 6 timer med inkubering med 2 ug /ml oligomycin; Glykolyse% = Lac (c) x 100 /Lac (o); og OXPHOS% = 100 -. Glycolysis% [28]
ATP-analyser
Cellular ATP-konsentrasjon ble målt ved hjelp av ATP-baserte CellTiter-Glo Lysende celleviabilitet kit (Promega, Madison, WI) modifisert fra produsentens protokoll. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater ved forskjellige densiteter. Tre timer senere ble et likt volum av en enkelt ett-trinns reagens leveres av settet tilsatt til hver brønn og rystet i 10 minutter ved romtemperatur. Cellulære ATP-innholdet ble målt ved hjelp av en selvlysende plateleser. For å teste ATP reduserende effekten av de metabolske inhibitorer, ble forskjellige konsentrasjoner av forbindelse tilsatt til cellene sådd ut 1 x 10
4 celler /brønn for ytterligere 3 timer, og cellulære ATP-innholdet ble målt som beskrevet ovenfor.
MTT målings
cellene ble sådd ut i 96-brønn plate med 3000 celler per brønn i 100 pl cellekulturmedium og inkubert ved 37 ° C i 24 timer og deretter behandlet med angitte forbindelser ved forskjellige konsentrasjoner. Etter 72h inkubering ble cellene inkubert med 10 ul MTT (til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg /ml) ved 37 ° C i 4 timer [29]. Mediet ble fjernet, og det utfelte formazan ble oppløst i 100 ul DMSO. Etter risting i 10 minutter, ble absorbansen ved 490 nm oppdages ved hjelp TECAN GENIOS Pro (BioTek Instruments).
Tumor sfære dannende analysen
For å få kuler i kultur, uPAR
+ cellene behandlet med angitte forbindelser i 3 timer. Deretter 1 x 10
3-celler ble sådd ut i serumfritt medium (SFM) (DMEM /F12) supplert med 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) og epidermal vekstfaktor (EGF) (Peprotech), 5 ug /ml insulin (Sigma-Aldrich), 0,4% bovint serumalbumin (BSA, Invitrogen), og 0,02 x B27 (Invitrogen). Kultur medium ble erstattet eller supplert med flere vekstfaktorer to ganger i uken. Det totale antall kreftkuler ble regnet etter 14 dager med kultur.
tumorgenisiteten analysen i nakne mus
Dyreforsøk ble utført på fire uker gamle BALB /CA naken mus kjøpt fra Beijing HFK Bio- Teknologi. Co, LTD (Beijing, Kina). Protokollene ble utført etter godkjenning fra Komiteen for etikk av dyreforsøk i Tianjin Medical University (Permit Number: TMHaMEC2014030). Den sortert uPAR
+ celler ble behandlet med 2 ug /ml oligomycin for 24 timer, vasket, og høstet for subkutan inokulering til venstre flankene av BALB /CA nakne mus. De samme antall kontrollceller ble inokulert på de rette flanker av samme mus subkutant. Hver inokulasjon området ble injisert med 5 × 10
5 celler. Musene ble deretter overvåket i tumordannelse uten videre behandling in vivo. Mus ble observert 2-3 ganger per uke ved laboratoriepersonell og overvåkes for tegn på stress (dvs. endring i utseende, respirasjon, aktivitet, etc.). Tumorene ble målt en gang i uken. Alle dyrene i begge grupper var fremdeles i god tilstand inntil slutten av forsøket. Ingen av dyrene som kreves eutanasi før den eksperimentelle endepunkt. Etter seks uker ble de eksperimentelle dyrene bedøvet med natriumpentobarbital (45 mg /kg, intraperitoneal injeksjon) og avlivet ved cervikal dislokasjon. Tumor volum = 0,5 × lengde × bredde
2
Elektronmikros
uPAR
+ celler og uPAR
-. Celler ble sortert etter FACS som beskrevet ovenfor. Den ultra analyse av sorterte cellene ble utført som beskrevet i rapporten fra Varum et al [30].
Statistisk analyse
Data ble analysert ved hjelp av SPSS for Windows versjon 17.0 programvare (SPSS Inc, Chicago , IL, USA). Hvert eksperiment ble utført minst tre uavhengige forsøk. Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. og statistiske sammenligninger av datasettene ble analysert ved anvendelse av uparede Students t-test eller ANOVA test. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
ekstracellulær flux analyse viste de metabolske forskjeller i cscs og ikke-stilk kreftceller
For å få innsikt i den metabolske profilen. cscs og å sammenligne den med de ikke-stammen kreftceller, vi urfremført ekstracellulære metabolske flux analyse [16]. OCR og ECAR ble målt. Som vist i figur 1A, cscs-anrikede uPAR
+ celler viste en lavere basal OCR, som indikerer lavere mitokondriell respirasjon, sammenlignet med deres uPAR
– motstykker. Når basal ECAR av uPAR
+ celler og uPAR
– celler ble sammenlignet, det uPAR
+ celler var også mindre aktive i forhold til fermentering glykolyse. For å undersøke de metabolske egenskaper til to subpopulasjoner i detalj, har vi brukt et farmakologisk profilering strategi, ved å kombinere anvendelsen av tre metabolske inhibitorer (oligomycin, FCCP, en kombinasjon av rotenon og antimycin) [30]. Behandling av oligomycin resultert i nedgang i OCR av to celle subpopulasjoner. Likevel uPAR
+ celler viste en mindre markant nedgang i OCR sammenlignet med uPAR
– celler (figur 1B). Frakobling av OXPHOS hjelp FCCP økt OCR til maksimum i begge cellepopulasjoner, med en mindre uttalt reaksjon blir observert i uPAR
+ celler (fig 1B og 1C). Forskjellen mellom FCCP OCR og basal OCR er en god indikator for respiratorisk evne (også referert til som den mitokondrielle reservekapasitet) av disse celler [30]. Selv om den basale OCR av uPAR
+ -celler var lavere, den mitokondrielle reservekapasiteten av uPAR
+ -celler var sammenlignbar med den til uPAR
– celler (figur 1C). Selv om den basale ECAR er lav i uPAR
+ celler, er det mulig at uPAR
+ -celler kan oppregulere glykolyse når mitokondriell OXPHOS blokkert [16]. For å undersøke muligheten, målte vi ECAR av disse celler behandlet med OXPHOS inhibitorer, som er en parameter av kompenserte potensialet i glykolysen [16]. Forbløffende nok uPAR
+ celler viste en signifikant redusert kompenserte potensialet i glykolyse når mitokondrie energiproduksjon ble hemmet (fig 1D og 1E). Videre viste resultatene at uPAR
+ celler hadde redusert ATP nivåer i forhold til uPAR
-cellene (figur 1F). Til sammen våre data tyder på at cscs-beriket uPAR
+ celler er metabolsk inaktive cellepopulasjoner i SCLC
(A) Basal OCR og ECAR for uPAR
+ og uPAR
-. Undergrupper . (B) Den OCR etter behandling med inhibitorer som er angitt i uPAR
+ celler versus uPAR
– celler. (C) Maks mitokondrie respiratoriske kapasitet og mitokondrielle reservekapasitet i to subpopulasjoner. (D) ECAR etter behandling med angitt hemmere i uPAR
+ celler versus uPAR
– celler. (E) Den kompenserte potensialet i glykolyse av uPAR
+ celler og uPAR
– celler. (F) ATP-innholdet i uPAR
+ celler og uPAR
– celler. Data er uttrykt som middelverdier ± S.E.M.. av tre uavhengige eksperimenter. T-test ble brukt for å beregne statistisk signifikans. * P 0,05
cscs viste mindre glukoseopptak og laktatproduksjon i SCLC
For ytterligere å undersøke de metabolske forskjeller uPAR
+ celler og uPAR
– celler. , vurderte vi glukoseopptak av to subpopulasjoner. uPAR
+ celler vises mindre glukoseopptak enn uPAR
– celler (figur 2A). Våre ECAR målinger har vist forskjeller i laktat generasjonen mellom uPAR
+ celler og uPAR
– celler (Fig 1A og 1D). I samsvar med disse funnene, uPAR
+ celler viste signifikant reduserte nivåer av laktat produksjon sammenlignet med uPAR
– celler (figur 2B). Det igjen indikerte at cscs var mindre glycolytic enn sine ikke-stilk kreftceller. Glutaminolysis er vanligvis aktiv i tumorceller, derfor har vi målte to-deoxyglucose følsomme laktatproduksjon i uPAR
+ celler og uPAR
– celler. Som vist i figur S2, 2-DG forårsaket en vesentlig reduksjon av laktatproduksjon. Disse resultatene antydet glutaminolysis var ikke så aktiv i liten celle lungekreft cellelinje H446 som i andre tumorceller
(A) glukoseopptak ved uPAR
+ celler og uPAR
-.-Celler ved anvendelse av 2- NBDG. Venstre, histogram fremstilling av 2-NBDG intensitet. Høyre, kvantifisering av 2-NBDG opptak som forskjell i gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) mellom prøver og kontroller. (B) Laktat produksjonsrater av uPAR
+ celler og uPAR
– celler. Data er uttrykt som middelverdier ± S.E.M.. av tre uavhengige eksperimenter. T-test ble brukt for å beregne statistisk signifikans. * P. 0,05
mitokondrie antall og morfologi cscs var forskjellig fra ikke-stilk kreftceller
Redusert mitokondriell respirasjon i uPAR
+ celler kunne tilskrives lavere antall mitokondrier eller umodenhet av mitokondrier i disse cellene sammenlignet med uPAR
– celler. For å undersøke denne saken, utførte vi transmisjonselektronmikroskopi [30] for uPAR
+ celler og uPAR
– celler. Som vist i figur 3, de fleste av mitokondriene i uPAR
– celler ble avrundet til ovale, viser sparsom og uregelmessig cristae og et elektron-Lucent matrise. Men uPAR
+ celler fortrinnsvis besatt aktivert mitokondriene, inkludert gruppering av mitokondrier, fortykket cristae, og «Wagon Wheel» morfologi [17,31]. Dette morfologisk vurdering tilsier at mitokondriene av uPAR
+ celler er mer modne i utseende enn uPAR
– celler. Disse resultatene står i sterk kontrast til den nedre luft aktiviteten til uPAR
+ celler i forhold til uPAR
-. Celler
ultrastructural analyse av sortert uPAR
+ celler og uPAR
– celler ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi. Representative bilder vises på forstørrelse × 10 000 i øverste panelene og × 30 000 i nedre paneler. Piler i nedre panel viser eksempler på mitokondriene. Skala barer: 5 mikrometer (øvre panel) og 1 mikrometer (lavere paneler)
Avhengigheten OXPHOS og mitokondrie substrat-nivå fosforylering variert i cscs og ikke-stilk kreftceller i SCLC
for å utforske den relative betydningen av OXPHOS og glykolyse i cscs, bestemte vi oss for å behandle begge undergrupper med ulike metabolske hemmere og Analyser på nytt ATP nivåer etter behandling [15]. 2-DG var en konkurrerende inhibitor glykolyse, og oligomycin ble brukt til å inhibere ATP-produksjon via mitokondrie ATP syntase. Som vist i figur 4A, ATP-nivåer av uPAR
+ celler i H446 ble redusert med 43,2% og 64,1% av kontrollverdien når de ble behandlet med henholdsvis 2-DG og oligomycin,. I uPAR
– celler, 2-DG forårsaket en 81,9% ATP nedgang, mens ATP dråpe indusert av oligomycin var 54,7% (Fig 4B). Når effekten av oligomycin og 2-DG på ATP-nivåer ble sammenlignet i to subpopulasjoner, oligomycin hadde mer potent effekt på uPAR
+ celler. I motsetning to-DG påvirket uPAR
– cellene mer intensivt enn uPAR
+ celler (S3 fig). Dataene indikerte at uPAR
+ -celler var mer følsomme overfor OXPHOS inhibering sammenlignet med uPAR
– celler. For ytterligere å utforske de viktigste energigenerer veien i cscs, vi beregnet bioenergetisk organisasjoner av glykolyse og OXPHOS [28] i uPAR
+ celler og uPAR
– celler. De bioenergetisk organisasjoner er heterogen og forutsi differensial bioenergetisk avhengighet av glykolyse og OXPHOS for begge subpopulasjoner (S4 Fig). Disse resultatene tyder på at cscs kan avhenge mer på OXPHOS snarere enn glykolyse for å møte energibehovet. Videre observerte vi de to celle subpopulasjoner fremdeles kunne frembringe ATP, selv om behandlet med en kombinasjon av 2-DG og oligomycin. Dette innebar at disse cellene kan stole på andre energi-genererende reaksjonsveier, slik som mitokondrial substrat-fosforylering nivå i løpet av respirasjonsdepresjon.
(A, B) ATP-innholdet av uPAR
+ celler og uPAR
– celler behandlet med 2-DG, oligomycin (OLI) eller en kombinasjon av to-DG og OLI. (C) Effekten av kombinasjonen av 2-DG og OLI for diverse tid på intracellulære ATP-nivåer i uPAR
+ celler og uPAR
– celler. (D) uPAR
+ celler, ikke uPAR
– celler kunne produsere mer ATP gjennom mitokondrisk substrat-nivå fosforylering i henhold hypoksiske betingelser enn normoksisk forhold (E) Tilsetningen av substrater (SUB) kunne avhjelpe ATP uttømming forårsaket av to-DG og OLI i uPAR
+ celler, men ikke i uPAR
– celler. Data er uttrykt som middelverdier ± S.E.M.. av tre uavhengige eksperimenter. T-test ble brukt for å beregne statistisk signifikans. * P 0,05. SUB, underlag (α-ketoglutarate og aspartat). ns, ingen betydning.
Rapporter har antydet at «tvinge» substrat-nivå fosforylering å jobbe overtid kan være en levedyktig strategi for å overleve i den energikrisen indusert av OXPHOS svekkelse i gjær [32,33] . For å optimalisere denne strategien for å SCLC, hemmet vi glykolyse og OXPHOS og dermed tvunget celler til å produsere ATP gjennom mitokondrie substrat-nivå fosforylering. For å oppnå dette, må vi først satt ut for å finne en lav dose av oligomycin og 2-DG fullstendig hemmet OXPHOS og glykolyse aktivitet, henholdsvis det. Ved behandling av uPAR
– celler med forskjellige doser av 2-DG som strekker seg fra 5 til 80 mm i 3 timer, ATP-nivåer av disse celler ble målt. ATP ble ikke ytterligere redusert ved å heve to-DG 20-40 og 80mm, noe som indikerer at 20 mM 2-DG helt redusert ATP produksjon i uPAR
– celler (s5a Fig). På samme måte har vi foreslått at 2 ug /ml oligomycin kunne hemme OXPHOS helt i uPAR
+ celler (S5b Fig). Vi observerte at uPAR
+ celler produsert mer ATP innhold gjennom substrat-nivå fosforylering enn gjør uPAR
– celler (fig 4C). Videre uPAR
+ celler produsert mer ATP gjennom substrat-nivå fosforylering etter hypoksiske betingelser enn i henhold normoksisk forhold (figur 4D). Videre ATP-analyser viste at α-ketoglutarat /aspartat tilskudd til kulturmediet kunne avhjelpe den ATP-nedbryting forårsaket av oligomycin og 2-DG in uPAR
+ -celler. Men dette fenomenet ble ikke observert i uPAR
– celler (figur 4E). Disse observasjonene videre indikert at mitokondrie substrat-fosforylering nivå i uPAR
+ celler kan være mer aktiv enn den i den uPAR
-.-Celler
Oligomycin svekket sfære dannende evne cscs
Våre observasjoner dokumentere at cscs-beriket uPAR
+ celler kan sterkt avhengig av OXPHOS som sin viktigste energigenerer veien. Vi testet om oligomycin kan føre til effektiv avliving av cscs i SCLC, basert på den begrunnelsen at oligomycin ville utarme cellular ATP-innholdet vesentlig ved å hemme OXPHOS. Etter in vitro clonogenicity er ansett som en indikator på den tumor-initiering evne av kreftceller in vivo [5], testet vi effekten av oligomycin og 2-DG på evnen av cscs i H446 for å danne kuler. 2-DG kunne ikke oppheve clonogenicity av cscs, men oligomycin redusert antall og størrelse på kuler i kultur (figur 5A-5C). Tilsetning av 2-DG til kulturmediet viser at inhibering av anaerob glykolyse alvorlig påvirket av veksten av uPAR
– celler, men ikke uPAR
+ -celler. I motsetning til dette, oligomycin betydelig redusert proliferasjonen av begge celleundertyper (figur 5D).
(A) Representative morfologi av kuler opprettholdelse i serumfritt medium ble etablert fra uPAR
+ celler behandlet med oligomycin og 2- DG. (B) Mengde førstegenerasjons kuler generert fra uPAR
+ celler behandlet med 2-DG og oligomycin. Klonogene potensialet av uPAR
+ celler ble redusert med oligomycin behandling. I kontrast, ikke to-DG ikke påvirke klonogene potensialet i cscs. (C) Antall celler pr sfære som genereres fra uPAR
+ celler behandlet med 2-DG og oligomycin på dag 14. (D) Oligomycin hemmer proliferasjon av både uPAR
+ celler og uPAR
– celler, påvirker imidlertid to-DG bare uPAR
– celler, men ikke uPAR
+ celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige eksperimenter. T-test ble brukt for å beregne statistisk signifikans. * P. 0,05
Oligomycin trykt tumor-initiering evne cscs in vivo
For å teste effekten av oligomycin å drepe tumor initiere celler i cscs delpopulasjoner, uPAR
+ celler ble behandlet ved den fremgangsmåte som er vist i fig 6A. Da to grupper av celler ble inokulert subkutant BALB /cA nakne mus, som ble delt inn i to grupper. Musene ble deretter observert i tumordannelse og tumorvekst uten ytterligere behandling [12]. Seks uker senere, gruppen behandlet av oligomycin og kontroll gruppe dannet tumorer (fig 6B og 6C). Gruppen behandlet med oligomycin hadde en signifikant redusert tumorvolum og vekt (125,8 ± 13,67 mm
3, 0,2 ± 0,1 g) sammenlignet med kontrollgruppen (451,5 ± 16,23 mm
3, 0,42 ± 0,15 g) (Fig 6D og 6E). Disse observasjonene tyder cscs opprettholde sine stammelignende egenskaper ved OXPHOS i SCLC cellelinje H446.
(A) Eksperimentell ordningen. (B) Representative fotografi av tumorer som er dannet av celler behandlet med oligomycin eller kontrollceller. (C) Representant fotografi av BALB /cA nakne hannmus med svulst på 42 dager. (D) Tumorvekt av xenograft tumorer volum av gruppen behandlet med oligomycin og kontrollgruppe. (E) Vekstkurve av xenografttumorer volum av gruppen behandlet med oligomycin og kontrollgruppe. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. av seks mus. T-test ble brukt for å beregne statistisk signifikans. * P. 0,05
For klinisk anvendelse, er det bedre å ta de ikke-kreftceller i betraktning. I vår undersøkelse av konsentrasjonen av oligomycin er 2UG /ml, noe som er langt mindre enn den letale dose [34], og alle musene i forsøksgruppen er fremdeles i god tilstand inntil slutten av forsøket. Derfor tror vi at bivirkning av oligomycin er bare litt i vår studie. I tillegg har andre gruppe vist at målrettede anti mitokondriell behandling ved hjelp av oligomycin er effektiv for å stanse MCF-7 celleklump vekst uten tilsynelatende virkning på normal epitelial brystvev ved tilsvarende doser [35]. Men i lys av tid og vår opprinnelige intensjon, vi har en tendens til å illustrere de forskjellige metabolske fenotyper av mesteparten av kreftceller og cscs. Derfor anser vi cscs og ikke-stammen kreft som forskningsobjekter i dette papiret.
Diskusjoner
Til nå har det store flertallet av studier på dette feltet fokusert på bulk tumorceller, som viser økt glykolyse selv i nærvær av oksygen i en rekke forskjellige tumorer [17]. Men det er økende bevis som indikerer at den metabolske tilstand av cscs er forskjellig fra ikke-stammen cancerceller [36-38]. Lite er kjent om de metabolske egenskaper cscs i SCLC så langt. Her viste vi at cscs bodde i en tilstand som viser lav metabolsk aktivitet i SCLC. Våre resultater antydet at cscs-beriket uPAR
+ celler var sovende subpopulasjoner i SCLC. Den cellulære uvirksom kunne bringe fordeler for tumorceller. På den ene side er de fleste av dagens terapier målrette de prolifererende tumorceller. Dermed sovende cscs kan overleve målrettede terapier og være ansvarlig for svulst tilbakefall. På den annen side, gjør dette relativt sovende tilstand sannsynlig cscs vedvare, selv under høyt stressende forhold som for eksempel lavt nærings eller oksygennivå [16]. Den nåværende forskning gir muligheter for å forstå kompleksiteten i tumor dvalen, men mekanismen for denne prosessen må videre etterforskning.
mirnas spille viktige regulatoriske roller i ulike biologiske prosesser, slik som metabolisme [27]. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium i forhold til miRNA uttrykket profiler av cscs og ikke-stilk kreftceller fra H446 bruker miRNA utvalg inkludert 1212 modne miRNAs. I rekken, ble det funnet at 86 mirnas ble uttrykt forskjellig mellom cscs og ikke-stilk kreftceller (P 0,01), inkludert 48 oppregulert mirnas og 38 downregulated mirnas i cscs. Blant 86 forskjellig uttrykt mirnas, 18 av de 48 oppregulert mirnas og 20 av de 38 downregulated mirnas viste minst fire-fold endringer i cscs forhold til ikke-stilk kreftceller [29]. Derfor er vår neste arbeid for å utforske effekten av miRNAs på metabolske tilstand av cscs i SCLC.
I denne studien, viste vi at cscs viste fortrinnsrett bruk av OXPHOS løpet glykolyse for å møte deres energibehov. Så langt vi kjenner til, cscs bor i hypoksiske miljøer [39]. Hvorfor er cscs fortsatt svært avhengige av OXPHOS i hypoksisk mikromiljø? Vi tror årsakene er som følger. For det første har oksygenkonsentrasjonen i et hypoksisk mikromiljøet blitt foreslått å være innenfor omfanget av 8-57μM [4,40-42], som er høyere enn grensekonsentrasjonen for O
2 dissosiasjonskonstant for cytokrom c oksidase [43 ]. Derfor cscs kunne fortsatt tungt stole på OXPHOS selv under hypoksiske forhold. For det andre er det en metabolsk symbiose mellom to subpopulasjoner av kreftceller med forskjellige avhengigheter i reaksjonsveier energiproduserende [44,45]. Glykolytisk kreft s biprodukt laktat kan brukes som et viktig metabolitt for OXPHOS hos kreft undergrupper som er avhengig av mitokondrie metabolisme. Den metabolske symbiose gjør kreftcellene til å gjøre full bruk av tilgjengelige ressurser [45]. For det tredje har Otto Warburg «arbeid vist at svært proliferative celler ofte fortrinnsvis utføre glykolyse løpet OXPHOS [17].
