Abstract
Oxysterols er oksidasjonsprodukter av kolesterol. Cholestan-3β, 5α, 6β-triol (forkortet som triol) er en av de mest tallrike og aktive oxysterols. Her rapporterer vi at triol viser anti-kreft aktivitet mot humane prostata kreft celler. Behandling av celler med triol doseavhengig trykt spredning av LNCaP CDXR-3, DU-145, og PC-3 menneskelige prostata kreft celler og redusert kolonidannelse i soft agar. Oral administrering av triol ved 20 mg /kg daglig i tre uker betydelig retardert vekst av PC-3-xenografter i nakne mus. Strømningscytometrisk analyse viste at triol-behandling på 10-40 uM forårsaket G1 cellesyklus-stans mens TUNEL-analysen indikerte at triol-behandling på 20-40 uM indusert apoptose i alle tre cellelinjer. Micro-vestlige Arrays og tradisjonelle Western blotting metoder indikerte at triol behandling resulterte i redusert uttrykk for akt1, fosfor-Akt Ser473, fosfor-Akt Thr308, PDK1, c-myc, og Skp2 proteinnivåer samt opphopning av cellesyklusen inhibitor p27
Kip. Triol behandling også resulterte i redusert akt1 protein uttrykk i PC-3 xenografter. Overekspresjon av Skp2 i PC-3 celler delvis reddet veksthemming forårsaket av triol. Triol behandling trykt migrasjon og invasjon av DU-145, PC-3, og CDXR-3 celler. Uttrykket nivåer av proteiner forbundet med epitelial-mesenkymale overgang samt fokal adhesjonskinase ble påvirket av triol behandling i disse cellene. Triol behandling forårsaket økt uttrykk av E-cadherin protein nivåer, men redusert uttrykk for N-cadherin, vimentin, Slug, FAK, fosfor-FAK Ser722, og fosfor-FAK Tyr861 protein nivåer. Konfokal lasermikroskopi avslørte omfordeling av β-aktin og α-tubulin ved periferien av de CDXR-3 og DU-145-celler. Våre observasjoner tyder på at triol kan representere et lovende terapeutisk middel for avansert metastatisk prostata kreft
relasjon:. Lin C-Y, Huo C, Kuo L-K, Hiipakka RA, Jones RB, Lin H-P, et al. (2013) kolestan-3β, 5α, Undertrykker 6β-triol spredning, migrasjon og invasjon av menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (6): e65734. doi: 10,1371 /journal.pone.0065734
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 28 desember 2012; Godkjent: 27 april 2013; Publisert: 13 juni 2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CS-101-PP-14 (National Health Research Institutes), NSC 99-2320-B-400-015-My3 og NSC 101-2325-B-400-014 (National Science Council) i Taiwan for CPC; DOH101-TD-C-111-004 (Department of Health) i Taiwan for JYC og CPC. CYL støttes av DOH101-TD-C-111-004. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest hyppigst diagnostisert kreft i menn og den femte vanligste kreft sammenlagt i verden. I 2008 ble mer enn 899,000 nye tilfeller diagnostisert (GLOBOCAN 2008 database, versjon 1.2). I vestlige land, er prostatakreft den vanligste ikke-kutan carcinoma av menn. Ifølge statistikken av Surveillance Epidemiology og sluttresultatet (seer) av National Cancer Institute, ble mer enn 240.000 menn diagnostisert med og mer enn 28.000 mennesker døde av prostatakreft i 2012 i USA. Selv om kirurgi er ofte vellykket for orgel-begrenset prostatakreft, er androgen ablasjon terapi primærbehandling ved metastatisk prostatakreft. Dessverre vil de fleste prostatakreftpasienter androgen ablasjon terapi til slutt utvikle tilbakevendende, kastrering-resistente svulster i løpet av 1-3 år etter behandling. Median total overlevelse tid er 1-2 år etter kreft tilbakefall [1], [2]. Ingen effektiv standardbehandling finnes for pasienter som opplever tilbakefall med avansert prostatakreft. Kjemoterapi er ofte brukt til å behandle metastatisk hormon-refraktær prostatakreft 2,3. Men chemotherapies viser generelt liten effekt på å forlenge overlevelse. Derfor er nye behandlinger for avansert prostatakreft nødvendig.
Oxysterols er oksidasjonsprodukter av kolesterol. Oxysterols spille viktige roller i å regulere kolesterol homeostase, blodplateaggregasjon, apoptose, og protein prenylation [4]. Imidlertid er oxysterols assosiert med utvikling av aterosklerose, nevrologisk sykdom, kreft og [4]. Visse oxysterols har vært rapportert å utvise anticancer-effekter, muligens via modulering av kolesterol effluks, Akt, eller lever X-reseptorer (LXRs) [5], [6]. For eksempel, behandling med 22 (R) -hydroxycholesterol, 24 (S) -hydroxycholesterol, 7α-Hydroxycholesterol, 7β-Hydroxycholesterol, 25-Hydroxycholesterol, og 5α, 6α-epoxycholesterol trykkes spredning av humane prostata, bryst, tarm, lunge, og leukemi kreftceller [7] – [14]. Disse oxysterols forårsaket enten G1 cellesyklus-stans [7] – [11] eller apoptose i kreftceller [12] – [14]. Derfor kan oxysterols med cytotoksisk aktivitet være et potensielt terapeutisk middel for avanserte prostatakreft.
kolestan-3β, 5α, 6β-triol (forkortet som triol) er en av de mest tallrike oxysterols. Triol er avledet fra kolesterol ved oksydasjon via dannelse av 5α, 6α-epoxycholesterol og 5β, 6β-epoxycholesterol [15], [16] som mellomprodukter. Tidligere 5α, 6α-epoxycholesterol ble rapportert å utvise anti-kreft-aktivitet [13]. I denne studien undersøkte vi muligheten for triol å undertrykke spredning av avanserte menneskelige prostata kreft cellelinjer både
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi søkte Micro-vestlig Arrays, en nylig utviklet antistoff-basert, med høy gjennomstrømming Western blotting-analyse [17] – [20], for å studere signalproteiner som berøres av triol i avansert prostata kreft celler. Våre observasjoner antydet at triol kan representere et lovende terapeutisk middel for avansert metastatisk prostatakreft.
Materialer og metoder
Material
kolestan-3β, 5α, 6β-triol ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Matrigel ble kjøpt fra BD Biovitenskap (San Jose, CA, USA).
Cell Kultur
Prostatakreft cellelinjer PC-3, DU-145, og LNCaP underlinjer var en gave fra laboratoriet av professor Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, USA). Disse cellelinjer ble beskrevet tidligere [7], [8], [10], [21] – [27]. LnCap CDXR-3-celler ble passert, og opprettholdt som tidligere beskrevet [7], [8], [10], [11], [21] – [23], [27]. DU-145 og PC-3-celler ble opprettholdt i DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), penicillin (100 U /ml ), og streptomycin (100 ug /ml) (komplett medium) som tidligere beskrevet [28]. De PZ-HPV-7-celler ble kjøpt fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC, Hsinchu City, Taiwan) og ble dyrket i et keratinocytt-serumfritt medium (Gibco /Invitrogen) med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vekstfaktor og 50 ug /ml bovint hypofyseekstrakt.
celleproliferasjonsanalyse
celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3 celler /brønn i 100 ul komplett medium i 96-brønners plater. Proliferasjonsanalyser ble utført under vedlikeholdsforhold (DMEM med 10% FBS for PC-3 og DU-145, DMEM med 10% FBS-CS for LNCaP CDXR-3). Relative celleantall ble analysert ved å måle DNA-innhold av cellelysater med den fluorescerende fargestoff Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO, USA) som tidligere beskrevet [8], [10], [11], [21], [ ,,,0],23], [24], [27], [28]. Alle avlesninger ble normalisert til gjennomsnittet av kontroll tilstand (ingen behandling triol) i hvert enkelt eksperiment. Forsøket ble gjentatt tre ganger. Ti brønner ble anvendt for hver betingelse. Middelverdien og standardavvik representerer gjennomsnittet og standardavvik henholdsvis av resultatene fra alle 30 brønner i de tre forsøkene.
celleviabilitet Assay
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 3 x 10
3 celler per brønn i en 96-brønns plate (BD Bioscience). Etter 24 timer ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av triol i 48 timer eller 96 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved en MTT (3,4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2-5-difenyltetrazoliumbromid) analyse [29]. Mengden av formazan ble bestemt ved å måle absorbansen ved 560 nm ved å bruke en Tecan GENIOS ™ plateleser (Tecan gruppe Ltd, Männedorf, Sveits) [29]. Alle resultater ble normalisert til gjennomsnittet av kontroll tilstand (ingen behandling triol) i hvert enkelt eksperiment. Forsøket ble gjentatt tre ganger. ble brukt hver gang ti brønner for hver tilstand. Middelverdien og standardavvik representerer resultatene fra alle 30 brønner i de tre forsøkene.
flowcytometrisk analyse
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5-celler i 10- cm skåler i 10 ml media og dyrket i 24 timer før tilsetning av triol. Etter 48 timers dyrking i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av triolen ble cellene fjernet med trypsin og fiksert i 70% etanol i fosfatbufret saltvann (PBS) over natten ved -20 ° C. Fikserte celler ble vasket med PBS, ble behandlet med 0,1 mg /ml RNase A i PBS i 30 minutter, og deretter suspendert i PBS inneholdende 50 ug /ml propidiumjodid. Cellesykkelprofiler og fordelinger ble bestemt ved flowcytometrisk analyse av celler ved hjelp av en BD FACScan flowcytometer (BD Biosciences). Cellesyklus distribusjon ble analysert ved hjelp av ModFit LT programvare (Verity Software House, Topsham, ME, USA) som beskrevet [10], [23], [24], [26], [27].
Soft agar-kolonidannelse Assay
PC-3 og LNCaP CDXR-3-celler (8 x 10
3) ble suspendert i 0,3% lavtsmeltende agarose (Lonza, Allendale, NJ, USA) inneholdende DMEM med 10% FBS eller 10% trekull-strippet FBS (CS-FBS), henholdsvis, og deretter lagt på toppen av 3 ml av størknet 0,5% lavtsmeltende agarose inneholdende DMEM-medium med 10% FBS (PC-3), eller 10% CS-FBS ( CDXR-3) i 6 cm retter. Celler ble tillatt å vokse ved 37 ° C med 5% CO2 i 14 dager (PC-3) eller 17 dager (CDXR-3). Platene ble farget med 0,005% krystallfiolett i 30% etanol i 6 timer for å påvise cellekolonier.
TUNEL-analysen
Cellene ble dyrket på dekkglass i 24 brønner og ble behandlet med 0, 20, og 40 uM triol i 48 eller 96 timer. Celler ble skylt to ganger med PBS og utsatt for Tunel analysen bruker ApoAlert DNA Fragmentering Assay Kit (katalog nr. 630108 fra Clontech, Mountain View, CA, USA) i henhold til produksjon instruksjon. Tunel-fargede celler ble observert med Olympus konfokalmikroskop på 200 × (FV300, Olympus, Tokyo, Japan).
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health (Taiwan). Protokollen ble godkjent av National Health Research Institutes Institutional Animal Care og bruk Committee (NHRI-IACUC-101046-A). Mus ble holdt under kontrollerte miljøforhold (22 ° C, 12 timer alternerende lys-mørke-sykluser, 50% fuktighet, næring og vann ad libitum). Anestesi (Isofluran 1%) ble gitt for å redusere smerter i mus under inokulering av prostatakreftceller. Dyr omsorg ble utført i henhold til standard etiske retningslinjene (National Institutes of Health «Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr» og klinisk laboratorium dyr medisin (K. Hrapkiewicz, L. Medina, og DD Holmes, 1998, Iowa State University Press). eksperimentet er designet for å minimere antall naken mus brukes.
tumorxenotransplantater i Atymiske mus
forsøk med mus ble godkjent av National Health Research Institutes Institutional Animal Care og bruk Committee ( NHRI-IACUC-101046-A). Mann Balb /c nu /nu mus (NCI Frederick, MD), 6-8 ukers alder, ble injisert subkutant i begge flankene med 5 × 10
5 PC-3 celler suspendert i 0,5 ml av Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA). Overvåking av tumorvekst ble startet en uke etter tumor-inokulering. mus ble delt opp i kontroll- og behandlingsgrupper. 5 mus som bærer 10 tumorer omfattet kontrollgruppen og 5 mus bærer 8 svulster består behandlingsgruppen. Tre uker etter inokulering av PC-3 celler, ble musene i behandlingsgruppen behandles peroralt 5 dager /uke med 20 mg /kg triol. Triol ble administrert i en bærer inneholdende 1% Tween 20, 25% dimetylsulfoksyd i PBS. Mus i kontrollgruppen ble gavaged med bilen bare. Triol behandling ble startet 21 dager etter inokulering av cellene, og fortsatte i 21 dager. Svulster ble målt ukentlig ved hjelp calipers og volum ble beregnet ved hjelp av formelen volum = lengde × bredde × høyde × 0,52 [7], [21] -. [23]
Luciferase-reporter analysen
PC-3-celler ble sådd ut ved 2 x 10
5-celler /brønn i en 12-brønners plate i DMEM inneholdende 10% FBS. 24 timer etter plating, PC-3 celler ble transfektert med PRL-TK-Renilla luciferase plasmid (normalisering vektor, 5 ng /brønn), pSG5RXRα og pSG5LXRα (400 ng /brønn), 4xDR4Δ56cfos pGL3 (reporter genvektor; 500 ng /brønn ) ved hjelp av PolyJet ™ in vitro DNA-transfeksjon reagens (SigmaGen Laboratories, Rockville, MD, USA). 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av triol eller T0901317. Etter ytterligere 24 timer ble cellene lysert i 100 pl passiv lyseringsbuffer (Promega, Madison, WI, USA) og luciferaseaktivitet ble målt ved bruk av en dual-Luciferase-kit (Promega) i et 20/20
n luminometer Turner Biosystems .
Western blotting analyse
Cells prøvene ble lysert i SDS lysis buffer (240 mM Tris-acetat, 1% SDS, 1% glyserol, 5 mM EDTA pH 8,0, 0,1 mM ditiotreitol) som inneholder proteaseinhibitorene 1 mM 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl-fluorid (AEBSF), 0,8 uM aprotinin, 40 uM bestatin, 14 uM E-64, 20 uM leupeptin, 15 uM pepstatin A (Sigma-Aldrich, P8340) og fosfatase hemmere cantharidin, bromotetramisole og mikrocystin LR (Sigma-Aldrich, P2850). Vevsprøver ble fremstilt fra vev homogenisert i 2 x Laemmli-buffer som tidligere beskrevet [7], [21] – [24]. Uttrykk av proteiner inkludert akt1, Skp2, fosfor-Akt Ser473, fosfor-Akt Thr308, PDK1, fosfor-P44 /42 MAPK Thr202 /Tyr204, CDK2, CDK6, fettsyre syntase (FASN), GSK-3α, GSK-3β, Rb , cyclin B1, cyclin D1, fosfor-p38 MAPK Thr180 /Tyr182, fosfor-PDK1 Ser241, fosfor-Rb Ser780, FAK, og MMP9 ble oppdaget ved hjelp av antistoffer fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). E-cadherin, N-cadherin og p27
Kip1 antistoffer var fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Antistoffer for deteksjon av c-myc, caspase 3, caspase 8, caspase 9, PTEN var fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Slug antistoff ble kjøpt fra Abgent (San Diego, California, USA). Vimentin antistoff var fra Thermo (Waltham, Massachusetts, USA). Antistoffene mot akt1, akt2, akt3, Bcl-2, P53, Cdk4, NF-kB, cyklin A, cyclin E1, E2 cyclin, E2F-1, fosfo-GSK-3α Ser21, fosfo-GSK-3β Ser9, fosfo c-myc Thr58 /Ser62, fosfor-PTEN Ser385, fosfor-FAK Ser722, fosfor-FAK Tyr861, og α-tubulin var fra Millipore (Billerica, MA, USA). Antistoffer oppdage α-tubulin, β-aktin, og GAPDH ble kjøpt fra Novus (Littleton, CO, USA). Antistoffer for Skp2, p21
Cip, og p27
Kip var fra Santa Cruz (Dallas, TX, USA). Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin og anti-mus IgG sekundære antistoffer var fra Santa Cruz. Signalet fra pepperrot peroksidase merkede sekundære antistoff ble påvist ved forbedret kemoluminescens reaksjon (ECL western blotting deteksjon kit) (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). GAPDH, α-tubulin, og β-actin ble brukt som laste kontroller.
Micro-vestlig Arrays
CDXR-3 og DU-145 celler ble behandlet med kjøretøy (DMSO) eller 10 mikrometer triol i 48 timer. Micro-vestlige Arrays ble utført for å måle protein uttrykk og modifikasjon som tidligere beskrevet [17], [18], [20], [24].
Skp2 Overuttrykte i PC-3 celler
ektopisk ekspresjon av Skp2 ble oppnådd ved å infisere PC-3-celler med et retrovirus som genereres fra den LPCX plasmid inneholdende vill-type human Skp2-cDNA som beskrevet [10]. Puromycin-resistente kolonier ble ekspandert og undersøkt for økt Skp2 protein-ekspresjon ved Western blot-analyse. PC-3-celler infisert med en tom LPCX retroviruset ble anvendt som kontroller [10]. Cellene ble lysert i Laemmli buffer uten bromfenolblått fargestoff.
Real-Time Kvantitativ Polymerase Chain Reaction
RNA ble ekstrahert fra PC-3 og DU-145 celler behandlet med 0, 10, og 20 mikrometer triol i 48 timer ved hjelp av RNeasy MINIKIT (kat. nr 74104, Qiagen, Venlo, Nederland) etter produsentens anvisninger. Det genomiske DNA ble fjernet ved DNase-on-kolonne behandling som følger med mini kit. RNA-konsentrasjonen ble bestemt spektrofotometrisk ved 260 nm. Like mengder RNA ble brukt i cDNA syntesereaksjoner som bruker Reverse Transciption SystemRevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Sanntids kvantitativ PCR ble utført som tidligere beskrevet [7], [8], [21] – [23], [28] med SYBR grønn system /’reagenser i en optisk 96-brønners plate og sykkelforholdene som består av 2 min ved 50 ° C, 10 min st 95 ° C, 40 sykluser på 15 sek ved 95 ° C og 60 sek ved 60 ° C på en ABI Prism system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvensene av primere for ATP-bindende kassett transporter A1 (ABCA1) var TGTCCAGTCCAGTAATGGTTC (fremover) og AAGCGAGATATGGTCCGGATT (revers). Transkripsjon nivået av ABCA1 ble bestemt i PC-3 og DU-145-celler etter behandling med 0, 10, og 20 uM triol i 48 timer og ble normalisert til GAPDH-nivåene i hver prøve.
Transwell Migration Assay
Migrasjon analyser med PC-3 celler ble utført med en transwell kit fra BD Biovitenskap (katalognummer 353097). PC-3, ble DU-145, og CDXR-3-celler behandlet med 0, 10, og 20 uM triol i 48 timer. Cellene ble deretter fjernet fra vevskulturplater med trypsin, og vasket to ganger med PBS. Triol-behandlede celler (1 x 10
4) i 250 ul DMEM uten serum ble anbragt i den øvre invasjon kammer og det nedre kammer ble fylt med DMEM inneholdende 10% FBS. Den cellemigrering Kammeret ble innsatt i det nedre kammeret og inkubert i enten 6 (PC-3, DU-145) eller 24 (CDXR-3) timer ved 37 ° C. Celler på oversiden av filteret ble fjernet med en bomullspinne. Celler som er festet til filteret ble så fiksert med metanol i 10 min. Celler som er festet til filteret ble deretter farget med Giemsa beis (5%) i 1 time. Filtrene ble de-farget ved vasking med vann og antall celler bundet til filteret ble deretter kvantifisert ved å telle celler i bilder av de fargede filtrene.
Transwell Invasion Assay
An invasjon analysen med PC-3 celler ble utført med Growth Factor Reduserte BD BioCoat Matrigel invasjonen kamre (BD Biosciences) i henhold til produsentens instruksjoner. PC-3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av triol i 48 timer. Cellene ble så trypsinert og vasket to ganger med PBS. Celler fra hver betingelse ble sådd ut ved 4 x 10
4 celler per brønn i serumfritt DMEM i det øvre kammeret, og DMEM-medium med 10% FBS ble plassert i det nedre kammeret av kammeret som en chemo-lokkemiddel. Etter 24 timers inkubasjon ble ikke-invaderende celler på den øvre side av kammeret fjernes og membranene ble fiksert med metanol, vasket og farget med Giemsa-løsning. Invasivitet ble evaluert ved å telle de invaderende celler under et lysmikroskop. Alle forsøk ble utført in triplo.
Wound Healing Assay
CDXR-3-celler ble forbehandlet med 0, 10, og 20 uM triol i 24 timer. Cellene ble deretter fjernet fra vevskulturplater med trypsin, og vasket to ganger med PBS. Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 3,5 x 10
4 celler /brønn i 12-brønners plater. Etter 24 timer ble en sårheling analyse utført ved å skrape cellene med en 200-mL pipette tips. Celler ble observert på 0, 8 og 24 timer etter skraping og fotografert med en levende bilde mikroskop (Leica AF 6000 LX, Leica, Wetzlar, Tyskland). Migrasjonen avstand ble automatisk målt av programmet inne levende avbildning mikroskop.
Konfokalmikroskopi
CDXR-3 og DU-145 celler ble behandlet med 0 eller 10 mm triol i 24 timer. Cellene ble deretter vasket 3 ganger med PBS-buffer i 5 minutter per vask ved romtemperatur (RT), fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur, og renset med PBS 3 ganger i 5 minutter per vask og permeabilisert i 10 minutter ved romtemperatur med 0,1% Triton X-100 i PBS. Cellene ble blokkert for ikke-spesifikk proteinbinding med 2% bovint serumalbumin i PBS i 30 minutter, renset med PBS tre ganger i 5 minutter hver. Celler ble inkubert med β-aktin eller α-tubulin-antistoff i en time. Etter vasking ble cellene inkubert med sekundære FITC-konjugert antistoff i en time. Etter vask ble cellene monteres under glassplater og forseglet med Permount. Bilder av celler ble observert med en Olympus konfokalmikroskop på 400 × (okulær objektivet 10 ×; objektiv 40 ×). (FV300, Olympus, Tokyo, Japan)
Data Analysis
Data er presentert som gjennomsnitt +/- SD av minst tre forsøk, eller er representativt for forsøk gjentas minst tre ganger. Students t-test (to-halet, uparet) ble anvendt for å vurdere den statistiske signifikans av resultater fra proliferasjonsanalyse eksperimenter. En Microsoft Excel-tillegg program ED50V10 ble brukt til å beregne halvparten av maksimal effektiv konsentrasjon (EF
50).
Resultater
Triol Trykt spredning av menneskelige prostata kreft celler
Vi først søkt å bestemme virkningen av triolen behandling på levedyktigheten og spredning av tre som vanligvis anvendes humane prostatacancercellelinjer (Fig. 1). LNCaP CDXR-3 celler er androgen reseptor (AR) -positive, tilbakefall, androgen-uavhengig celler avledet fra foreldre AR-positive androgen-avhengige LNCaP 104-S-celler [27]. DU-145 og PC-3 begge er AR-negative androgen-insensitive celler etablert fra hjerne [30] og bein-[31] avledet metastaser, henholdsvis. En MTT-analysen og en Hoechst fargestoff-baserte proliferasjonsanalyser indikerte at triol trykkes både cellenes levedyktighet og cellulær proliferasjon (fig. 1). Den inhiberende virkning på proliferasjonen var doseavhengig og økt over tid (fig. 1, tabell S1). EF
50 for triol i MTT-assay var lik den EC
50 målt ved hjelp av Hoechst fargestoffbasert assay formering (tabell S1), noe som tyder på at inhibering av celleproliferasjon ble ansvarlig for reduksjon av levedyktige celler forårsaket av triol behandling i alle tre humane prostatakreft-cellelinjer.
LnCap CDXR-3, DU-145, og PC-3 prostata kreft-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av triol i 48 timer (A) (C) eller 96 timer (B) (D). Relativ levedyktighet og relative celleantall av prostata kreftceller ble bestemt ved MTT (3,4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2-5-difenyltetrazoliumbromid) 96-brønn assay (A) (B) og Hoechst fargestoff 33258- basert 96-brønns proliferasjonsanalyse (C) (D), henholdsvis, som beskrevet i Materialer og Metoder. Celleantall ble normalisert til kontroll (dimetylsulfoksyd) for hver cellelinje. Stjerne (*, **, ***) representerer statistisk signifikant forskjell (
p
0,05,
p
0,01,
p
0,001) mellom den behandlede gruppen og kontrollgruppen.
Triol Behandling hemmet Colony Dannelse av PC-3 og CDXR-3 celler i Soft Agar
Behandling av PC-3 og LNCaP CDXR-3 celler med 25 pM og 50 pM triol markert hemmet dannelsen av PC-3 og LNCaP CDXR-3 kolonier i soft agar, noe som bekrefter den anti-kreft-aktivitet av triol. DU-145-celler ble for langsomt i myk agar for å påvise kolonier tilstrekkelig for videre analyse (Fig. 2).
PC-3 (A) og LNCaP CDXR-3 (B) celler ble behandlet med 0, 10, eller 20 uM triol i 14 og 17 dager, henholdsvis. Bildet er et representativt resultat av tre biologiske replikater.
Triol Behandling veksthemming av androgen-insensitive prostatakreft xenografter i hårløse mus
For å finne ut om triol kunne undertrykke tumorvekst
in vivo
, utførte vi en pilotstudie med DU-145 transplantater i nakne mus. Intraperitoneal (i.p.) injeksjon av 1 mg (50 mg /kg) av triol daglig i 14 dager forårsaket en 36% reduksjon i det gjennomsnittlige volum av DU-145-xenografter som vokser i nakne mus (fig. S1). Triol behandling i 14 dager ikke påvirke kroppsvekt av mus (data ikke vist). For å avgjøre om lavere doser på triol kan hemme veksten av PC-3 prostata xenografter. vi oralt administrert triol ved 20 mg /kg fem ganger i uken. Oral administrering av 20 mg /kg triol (5 ganger per uke) fra 3
rd til 6
th uke forårsaket en 65% reduksjon i gjennomsnittlig tumorvolum (p = 0,0002) i behandlingsgruppen sammenlignet med tumorvolum i kjøretøyet kontrollgruppen (fig. 3A). Kroppsvekt på både kjøretøy og triol-behandlede grupper gradvis redusert (fig. 3B). Dette kan skyldes cachetic effekter av PC-3-xenografter. Disse observasjonene bekreftet at oral administrasjon av triol kan forsinke veksten av prostata svulster
in vivo
.
Mann Balb /c nu /nu mus, 6-8 uker gamle, ble injisert subkutant i begge flankene med 5 × 10
5 PC-3 celler suspendert i 0,5 ml Matrigel. Svulster ble målt daglig ved hjelp calipers og volum ble beregnet ved hjelp av formelen volum = lengde × bredde × høyde × 0,52. Overvåking av tumorvekst ble startet en uke etter tumor-inokulering. Mus ble delt opp i kontroll- og behandlingsgrupper. Kontrollgruppen hadde 5 mus som bærer 10 svulster og behandlingsgruppen hadde 5 mus som bærer 8 svulster. Tre uker etter den første inokulering, ble behandlingsgruppe oralt administrert triol daglig i en dose på 20 mg /kg, 5 dager /uke. Mus i kontrollgruppen ble gavaged med bilen bare. Behandlingen startet på dag 22 og endte på dag 42 etter tumorinokulasjon. Tumorvolumer ble vist som gjennomsnitt ± standard feil (A) mens kroppsvekt hos mus ble vist som gjennomsnitt ± standardavvik (B).
Triol Behandling forårsaket G1 cellesyklus arrest i prostata kreft celler
Vi neste utført flowcytometrisk analyse for å fastslå om cellecyklusprogresjonen av prostata kreft celler ble påvirket av triol. Behandling med 10 uM triol i 48 timer førte til en økning i G1 fasecellepopulasjon og en reduksjon i S og G2 /M-fase populasjoner av LNCaP CDXR-3 og DU-145 prostatakreftceller (Fig. 4A, 4B). Triol 10 uM ikke påvirke cellesyklusprogresjon av PC-3-celler. Imidlertid, 20 uM triol forårsaket en betydelig økning i G1 og reduksjon i S og G2 /M populasjoner av PC-3-celler (fig. 4C). Derfor behandling med 10-20 mikrometer triol indusert G1 cellesyklus arrest i LNCaP, DU-145, og PC-3 celler. Vi observerte ikke noen økning i sub-G1 befolkningen i disse tre prostata kreft cellelinjer. For å avgjøre om høyere konsentrasjoner av triol vil øke bestanden av celler i sub-G1, vi behandlet DU-145 celler med 0, 20, og 40 mikrometer triol (fig. 4D). Reduksjon av S-fasen befolkning og induksjon av G1 fase populasjon av DU-145 celler var enda mer betydelig etter behandling med 40 mikrometer triol. Imidlertid var det ingen signifikant økning av celler i sub-G1 populasjonen.
LNCaP CDXR-3 (A) og DU-145-celler (B) ble behandlet med 0 eller 10 uM triol i 48 timer. PC-3-celler (C) ble behandlet med 0, 10, eller 20 uM triol i 48 timer. (D) DU-145-celler ble behandlet med 0, 20, og 40 uM triol i 48 timer. Cellesyklusfordelingen ble bestemt ved flow-cytometri. Stjerne (*, **, ***) representerer statistisk signifikant forskjell (
p
0,05,
p
0,01, og
p
0,001, henholdsvis) mellom den behandlede gruppen og kontrollgruppen.
Behandling med høy konsentrasjon av Triol apoptose i prostatakreftceller
Som propidiumjodidfarging flowcytometrisk analyse er ikke en pålitelig metode å detektere apoptose, vi brukte TUNEL-analyse for å bestemme om triol behandling ved høyere konsentrasjoner indusert apoptose i prostatakreftceller. Vi behandlet CDXR-3, DU-145, og PC-3-celler med 0, 20, og 40 uM triol i 48 eller 96 timer. I samsvar med den strømningscytometri-analyse av data, behandling med triol i 48 timer produserte bare en liten populasjon av apoptotiske celler i alle disse cellelinjer (data ikke vist). Behandling med triol i 96 timer doseavhengig medført økt bestanden av apoptotiske celler i alle tre prostata kreft cellelinjer (Fig. 5). Selv om behandling med 20 uM triol i 96 timer bare svakt økt apoptotiske befolkning, behandling med 40 uM triol resulterte i en signifikant økning i apoptose i alle tre prostatakreft-cellelinjer.
LNCaP CDXR-3, DU-145 og PC-3-celler ble behandlet med 0, 20, og 40 uM triol i 48 timer. Cellemorfologi ble bestemt ved lysmikroskopi. TUNEL assay ble utført som beskrevet i materialer og metoder for å bestemme apoptotisk cellepopulasjon. Grønn fluorescerende lys indikert apoptotiske celler farget med TUNEL analysen. Bilder ble vist på 200 × med Olympus konfokalmikroskop.
Micro-vestlig Array avslørt signalering Proteiner blir påvirket av Triol Behandling
Vi antok at triol kan redusere cellenes levedyktighet gjennom sin effekt på protein signale nettverk. For å fastslå hvilke signaleringsproteiner kan bli påvirket av triol behandling, vi brukte Micro-Western-Arrays (mwas), en high-throughput Western blotting-analyse [17] – [20], [24], for å screene for signaleringsproteiner som påvirkes av behandling med 10 mm triol i CDXR-3 og DU-145 celler. PTEN blir ofte slettet i prostatakreft, noe som resulterer i aktivering av PI3K /Akt signaliserer [32]. PI3K /Akt signalisering spiller en viktig rolle i overlevelse og progresjon av prostata kreft celler [32], [33]. Oppregulering av PI3K /Akt-aktivitet er assosiert med dårlig klinisk resultat av prostatakreft [34]. Vi brukte 48 antistoffer som er i stand til å påvise proteiner som regulerer cellesyklusprogresjon, celleoverlevelse og apoptose, Akt-relaterte signalveier, og flere epitelial-mesenkymale overgang (EMT) markører (figur S2, Tabell S2) for screening del av vår MWA studien (fig. 6). Forskjeller i proteinekspresjon profilen i fravær og nærvær av 20 uM triol er vist i fig. 7. Hver av de tre cellelinjene hadde et unikt protein ekspresjon som reaksjon på behandling triol. Protein profiler av CDXR-3 og PC-3-celler etter behandling med 20 uM triol var mer lik hverandre enn for DU-145-celler.
