Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen (PC) er dødelig kreft med svært høy dødelighet. Fravær av sensitiv og spesifikk markør (er) er en av de viktigste faktorene for dårlig prognose av PC-pasienter. I pilotstudier ved bruk av lite antall pasienter, utskilte akuttfaseproteiner neutrofil gelatinase forbundet lipokalin (NGAL) og TGF-β familiemedlem makrofag-hemmende cytokin-1 (MIC-1) er foreslått som de fleste potensielle biomarkører spesielt forhøyet i blodet av PC-pasientene . Men fortsatt deres prestasjoner som diagnostiske markører for PC, særlig i pre-behandling pasienter, ukjent. For å evaluere den diagnostiske effekt av NGAL og MIC-1, ble deres nivåer målt i plasmaprøver fra pasienter med forbehandling PC-pasienter (n = 91) og sammenlignet med de i frisk kontroll (HC) individer (n = 24 ) og pasienter med kronisk pankreatitt (CP, n = 23). Den diagnostiske resultatene for disse to proteinene ble videre sammenlignet med den til CA19-9, en svulst markør som vanligvis brukes til å følge PC progresjon. Nivåene av alle tre biomarkører var signifikant høyere i forhold til PC-HC’er. Den midlere (± standardavvik SD) plasma NGAL, CA19-9 og MIC-1-nivåer i PC-pasienter var 111,1 ng /ml (2,2), 219,2 U /ml (7,8) og 4,5 ng /ml (4,1), respektivt. I sammenligne resectable PC til friske pasienter, ble alle tre biomarkører funnet å ha sammenlignbare følsomheter (mellom 64% -81%), men CA19-9 og NGAL hadde høyere spesifisitet (92% og 88%, henholdsvis). For å skille resectable PC fra CP pasienter, CA19-9 og MIC-1 var mest spesifikke (74% og 78% henholdsvis). CA19-9 på et optimalt cut-off på 54,1 U /ml er svært spesifikk differensiere resectable (stadium 1/2) bukspyttkjertelkreft pasienter fra kontroller i forhold til sin kliniske cut-off (37,1 U /ml). Spesielt tilsetningen av MIC-1 til CA19-9 betydelig forbedret evne til å skille reseserbare PC tilfeller fra CP (p = 0,029). Overall, MIC-1 i kombinasjon med CA19-9 forbedret diagnostisk nøyaktighet differensiere PC fra CP og HC’er
Citation. Kaur S, Chakraborty S, Baine MJ, Mallya K, Smith LM, Sasson A, et al. (2013) Potentials av Plasma NGAL og MIC-1 som Biomarker (e) i Diagnostisering av Lethal kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (2): e55171. doi: 10,1371 /journal.pone.0055171
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 02.08.2012; Godkjent: 19 desember 2012; Publisert: 01.02.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. SKB, SC, SK, KM, MJB, MJ og ARS støttes delvis med tilskudd fra National Institutes of Health ( RO1 CA78590, UO1 CA111294, RO1 CA131944, RO1 CA133774, RO1 CA 138 791 og P50 CA127297). SG er støttet med tilskudd fra MDACC McNair Foundation Scholar Award og Cyrus Scholar Award. Forfatterne har ingen andre relevante bevisninger eller økonomiske engasjement i enhver organisasjon eller enhet med en økonomisk interesse i eller økonomisk konflikt med emnet eller materiale diskutert i manuskriptet bortsett fra de som er beskrevet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser. Medforfatter SKB er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Til tross for flere tiår med forskning, prognosen for kreft i bukspyttkjertelen (PC) forblir sturen, med en samlet fem års overlevelse på bare ca 5% [1]. En betydelig bidragsyter til dårlig prognose for PC er det faktum at kreft ofte forblir uoppdaget inntil et avansert stadium. Tilgjengelige teknikker for diagnostisering av PC presentere flere problemer først og fremst deres invasiv art, behov for spesialisert trening, observatør skjevhet og de høye kostnadene til helsevesenet. Videre, har det blitt demonstrert gjennom eksperimenter i dyremodeller som molekylære endringer forut for fremkomsten av forandringer i pankreas-arkitektur (påvist ved avbildningsteknikker) [2]. Derfor har det vært en økende vekt på identifisering av molekylære markører som kan identifisere PC ved en tidlig og potensielt resectable stadium. Kroppsvæsker, slik som blod, urin, galle og bukspytt representerer en lovende kilde av potensielle biomarkører. Foreløpig er den eneste biomarkør som er godkjent for bruk i PC er CA19-9 som er anbefalt å følge utviklingen av PC-en, men ikke for diagnostisk bruk. Vi har tidligere rapportert at neutrofil gelatinase forbundet lipokalin (NGAL), et 24 kDa glykoprotein som er differensielt oppregulert under progresjon av PC-en. Videre, i et lite sett av prøver viste vi at plasma NGAL nivåene var signifikant forhøyet i PC-pasienter sammenlignet med friske kontroller [3]. Nylig, El-Mesallamy et al. observert signifikant økning i NGAL nivåer i PC-pasienter med pre-eksisterende diabetes (142 ng /ml) i forhold til diabetespasienter (66,7 ng /ml) og ikke-diabetiske friske kontroller (37,8 ng /ml). Med sensitivitet og spesifisitet på 75% og 87% i differensiere PC fra ikke-PC tilfeller NGAL kom opp som potensiell adipokin [4]. Makrofag hemmende cytokin (MIC-1), en fjern medlem av den transformerende vekstfaktor β (TGF-β) familie av cytokiner, ble opprinnelig identifisert som et gen uttrykt i sammenheng med makrofagaktivering [5]. I en tidligere studie ble det vist å være forskjellig uttrykt i PC vev og forhøyet i serum av PC pasienter sammenlignet med både friske kontroller og de med godartede bukspyttkjertelen svulster [6]. Videre Ozkan et al., Observerte signifikant forhøyet ekspresjon av MIC-1 i PC tilfeller i forhold til andre pancreatobilary sykdommer og friske kontroller. Den ble funnet å ha tilsvarende følsomhet som den til CA19.9 (81%) i å skille PC fra andre benigne sykdommer [7]. Serum MIC-1 ble funnet å utkonkurrere CA19-9 i CA19-9, i skille pasienter med resektabel kreft i bukspyttkjertelen fra kontroller [8], [9].
I denne studien har vi søkt å utvide funnene fra vår pilotstudie for å undersøke den diagnostiske nytten av plasma NGAL i PC [3]. Gitt deltakelse av både MIC-1 og NGAL i betennelse og det nære forholdet mellom betennelse, hovedsakelig av den kroniske natur, og PC [3], vi lagt MIC-en til panelet av potensielle biomarkører. Plasma CA19-9 ble anvendt som en referanse for å sammenligne den diagnostiske resultatene for både NGAL og MIC-1. Våre resultater tyder på at plasmanivået av både NGAL og MIC-1 ble signifikant forhøyet hos pasienter med PC. I denne studien ble MIC-1 funnet å være svært spesifikk skille pasienter med kirurgisk resectable PC (dvs. tidlig stadium 1/2) fra CP tilfeller. Forbedret diagnostikk effekt av CA19-9 ble observert i differensieringstrinnet 1/2 PC pasienter fra HC’er på et optimalt cut-off 54,1 U /ml (74% sensitive og 92% spesifikke) i forhold til sin kliniske cut-off (37,1 U /ml) (71% sensitiv og spesifikk 67%). Til slutt, multivariat analyse viste at en kombinasjon av plasma MIC-1 og CA19-9 er signifikant bedre enn CA19-9 alene skille resectable PC fra CP (AUC = 0,85 vs. 0,74, p = 0,029).
materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC
Denne retrospektive dobbel senterstudie for plasmamarkører i PC ble godkjent av Institutional Review Boards (IRB) ved University of Nebraska Medical center (UNMC) (IRB nummer 209-00) og University of Pittsburgh Medical Center (IRB antall PRO07030072). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og kontroller før innmelding i studien. Inklusjonskriterier var noen voksen pasient (alder ≥ 18 år) med histologisk verifisert PC som som ble innlagt på University of Pittsburgh i perioden fra 2002 til 2009. Kronisk pankreatitt (CP) ble definert basert på CT-scan resultatene av forkalkninger, unormal pancreatogram eller secretin stimulering test. For denne studien ble 91 PC, 23 CP pasienter og 24 friske kontroller registrert. Baseline demografisk informasjon for alle grupper er beskrevet i tabell 1.
For PC-pasienter, ble en prøve klassifisert som «behandling naiv» hvis prøven ble trukket før en eventuell kreft styrt kirurgisk eller kjemoterapeutiske intervensjon. For diagnostiske analyser, ble bare behandlingsnaive prøver brukes. PC iscenesettelse var basert på en av fire kriterier: 1) patologisk staging etter kirurgi 2) MR /CT /ultralyd staging om dette var den eneste oppsetningen tilgjengelig, 3) endoskopisk staging dersom pasienten aldri gjennomgikk kirurgi eller 4) biopsi av metastatisk sykdom hvis ingen tidligere oppsetningen var tilgjengelig. PC klasse, plasseringen av svulsten, scene, røykestatus, historie av type 2 diabetes og familiehistorie med PC var basert på gjennomgang av sykehus poster.
Fastsettelse av Plasma NGAL og MIC-1 av Sandwich ELISA
NGAL og MIC-1-nivåer i plasma ble målt kvantitativt ved sandwich-ELISA henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av DuoSet ELISA kit (R 0,001 ), og 111,1 ng /ml (P . 0,05) henholdsvis) (tabell 2)
NGAL nivåene var signifikant høyere hos pasienter i alderen 60 år eller mer (p = 0,045). MIC-1 nivåene var signifikant lavere i gang røykere sammenlignet med aldri-røykere (p = 0,021). CA19-9 nivåer på den annen side ble signifikant forhøyet hos hunn PC pasienter og hos pasienter med inoperabel sykdom (stadium 3/4, p = 0,045 og 0,0047 henholdsvis) (data ikke vist).
diagnostisk nøyaktighet av NGAL , CA19-9 og MIC-1
neste søkt å undersøke sensitivitet og spesifisitet av de tre biomarkører for diagnostisering PC. PC pasienter ble delt enten basert på sykdom scenen eller behandling status. Som etter behandling prøvene er ikke diagnostisk relevant, ble bare behandlingsnaive prøver inkludert i disse analysene. For å sjekke diagnostisk effekt av CA19-9, MIC-1 og NGAL, ble disse markørene evaluert ved forhåndsdefinerte cut-off av ≥37 U /ml, ≥1.07 ng /ml, ≥106 ng /ml observert i tidligere studier [ ,,,0],3], [6]. I løpet av denne valideringen ble NGAL funnet å være 92% sensitive mens MIC-1 var mest spesifikke (94%) i å skille tidlig stadium 1/2 pasienter fra friske kontroller (tabell 3). Men den generelle ytelsen av alle merkene var ganske dårlig. Videre vurderte vi deres diagnostiske effekt ved optimal cut-off. For CA19-9, bortsett fra den som vanligvis benyttes cut-off-verdi på ≥37 U /ml, benyttet vi også optimal cut-off (55,1 U /ml), bestemt ved ROC-kurve analyse. I sammenligning av både PC til HC og PC til CP pasienter, bruk av en høyere cut-off av CA19-9 resulterte i høyere spesifisitet med tilsvarende følsomhet i å skille PC fra enten CP eller HCS (figur 1) (tabell 4). For all den videre analysen brukte vi CA19-9 på sitt optimale cut-off 55.1 U /ml. Spesielt CA19-9 på sitt optimale cut-off var 79% sensitiv og 92% spesifikk i særtbehandlingsnaive PC pasienter fra HC’er. MIC-1 var den mest sensitive (81%) og CA19-9 den mest spesifikke markør (92%) skille resektable PC pasienter (stadium 1/2) fra HC’er. For å skille resektable PC pasienter fra CP pasienter, MIC-1 var den mest spesifikke (78%) markør og NGAL var den mest spesifikk markør (100%) i skille stadium 3 og 4 PC gruppe fra CP tilfeller.
ROC-kurve-analyser for vurdering av evnen til CA19-9 til å skille PC-formen HC (panel A) og PC fra CP (panel B) ved dens kliniske cut off (37 U /ml) (rød linje), og optimal cut-off (55,1 U /ml) (blå linje). Med en grenseverdi på 37 U /ml, CA19-9 differensiert behandlingsnaive pasienter PC fra friske kontroller med sensitivitet, spesifisitet på 83% og 67%, mens sensitivitet og spesifisitet på 79% og 92% ble observert ved 55,1 U /ml. Ved PC vs CP pasienter, sensitivitet og spesifisitet på 61% og 83% ble observert ved klinisk cut-off mens ved optimal cut-off 62,2 U /ml følsomhet økes til 79% med spesifisitet på 78%.
diagnostisk nøyaktighet av en kombinasjon av to eller tre Markører til PC Sammenlignet CA19-9 Alene
CA19-9 er foreløpig den eneste FDA godkjent biomarkør som brukes til å hjelpe til diagnose og for å følge utviklingen av PC-pasienter. Etter å ha undersøkt den diagnostiske utførelsen av individuelle markører, ved siden søkte vi å undersøke om du legger enten NGAL eller MIC-1 til CA19-9 (gullstandarden) forbedret evnen til å skille PC tilfeller (resektable eller unresectable) fra CP eller HC’er. Kombinasjons Testene ble bestemt ved hjelp av multivariate analyser av individuelle markører, og de som viser statistisk signifikante forskjeller mellom de respektive pasientgrupper blir brukt videre for analyse. Tilsetning av NGAL og MIC-en forbedret areal under kurven (AUC ± SE) fra 0,8 (0,06) 0,85 (0,05) i trinn 1. sært /2 PC fra HC’er (tabell 5). Tilsetting av NGAL (med eller uten MIC-1) hadde betydelig innvirkning på evnen til CA19-9 å skille PC (enten resectable eller unresectable) fra HC’er. Spesielt tilsetningen av MIC-1 til CA19-9 betydelig forbedret evne til å skille reseserbare PC tilfeller fra CP (AUC 0,74 med CA19-9 alene og 0,85 med kombinasjonen (CI 0,76 til 0,94) (Figur 2) (tabell 5) . Videre tillegg av NGAL forbedret AUC fra 0,89 (0,05) 0,94 (0,03) i sært scenen 3/4 PC fra HC’er.
Kombinasjonen av MIC-1 med CA 19-9 betydelig forbedret følsomhet og nøyaktighet i differensiere resectable PC fra CP (AUC = 0,85 vs 0,74, p = 0,029, CI 0,76 til 0,94) sammenlignet med CA19-9 alene.
diskusjon og konklusjoner
Ledelsen i PC vil ha stor nytte av en tidlig diagnostisk biomarkør. Ulike potensielle kandidater har blitt testet, men ingen har vært konsekvent funnet overlegen CA19-9. Nylig observerte vår gruppe
de novo
uttrykk for NGAL (akronym for nøytrofile gelatinase forbundet lipokalin), en 25 kDa utskilt glykoprotein, i Panin-1s, de tidligste premaligne lesjoner foregående PC. Videre vi bemerket i et begrenset sett med pasientprøver som serum NGAL nivåene var signifikant forhøyet i plasma hos pasienter med CP og PC sammenlignet med friske individer (p = 0,035 og 0,004 henholdsvis) [3]. Koopman et al, hadde rapportert i en tidligere studie som en annen liten cytokin MIC-1 (makrofag hemmende cytokin 1) kunne skille PC-pasienter fra HC’er med en sensitivitet og spesifisitet på 94% og 90% henholdsvis [6]. Som både MIC-1 og NGAL er små, utskilles glykoproteiner, hypotese vi at en kombinasjon av disse to markørene kan diskriminere PC pasienter fra HC’er og CP pasienter. For å undersøke denne hypotesen, sammenlignet vi deres diagnostisk nøyaktighet med at av CA19-9, dagens gullstandarden markør for PC. Resultatene fra vår studie tyder på at NGAL og MIC-1 kan være minst sammenlignes CA19-9 i sin diagnostisk nøyaktighet i bestemte situasjoner. Spesielt har MIC-en sensitivitet og spesifisitet lik CA19-9 (på sitt optimale cut-off) i særtbehandlingsnaive PC pasienter fra CP pasienter (Tabell 4). Videre tillegg av MIC-1 (med eller uten NGAL) forbedret evne til å skjelne mellom resectable (trinn 1 eller 2, p = 0,029) og unresectable (stadium 3 eller 4, p = 0,079) PC fra CP pasienter (tabell 5 )
NGAL og dens murine homolog Ngal har vært foreslått som komponenter i det medfødte immunsystemet [11] – [13].. I våre tidligere studier, observerte vi at overekspresjon av NGAL i PC-celler hemme invasjon og metastasering og hindrer angiogenese [14]. Observasjonen at NGAL nivåer er like i CP og PC-pasienter (tabell 2) antyder at NGAL kan bli utgitt som en del av den kroniske betennelsesreaksjon som følger begge sykdommene.
MIC-1 (også kalt GDF- 15 eller NAG-1) er et medlem av TGF-β familie som først ble identifisert som et protein utskilt fra makrofager som respons på aktivering av immunsystemet [15]. MIC-1 er også abnormt uttrykt ved flere maligniteter (inkludert PC), og har dukket opp som mål for p53 mediert transkripsjon (rollen MIC-1 i kreft anmeldt i [15]). Differential uttrykk for MIC-en ble observert i SAGE (serie analyse av genuttrykk) biblioteker fra seks bukspyttkjertelkreft cellelinjer i forhold til ikke-neoplastiske vev [16]. Koopman og kolleger hadde rapportert tidligere at MIC-1 var betydelig bedre enn CA19-9 i diskriminerende PC fra HCS (AUC 0,99 og 0,78, p = 0,003), men ikke fra CP (AUC henholdsvis 0,81 og 0,74, p = 0,63) [ ,,,0],6]. De observerte at den midlere MIC-1-nivå hos friske kontroller, CP og PC var 0,76 ng /ml, 2,36 ng /ml og 5,4 ng /ml henholdsvis. Videre studier understreket den diagnostiske effekten av MIC-1 tilsvarer CA19-9 [6], [7]. I vår studie, gjennomsnittlig plasma MIC-1-nivå i disse pasientgruppene var 1,5 ng /ml, 1,6 ng /ml og 4,5 ng /ml (tabell 2). I vårt prøvesett, på et optimalt cut-off av 2,3 ng /ml, plasma MIC-1 var 62% sensitiv og 63% spesifikk i diskriminerende PC fra HC’er. På dette cut-off, MIC-1 var 78% spesifikk og 62% sensitiv skille PC fra CP pasienter. Interessant, kombinert bruk av MIC-1 med CA 19-9 forbedret følsomhet og nøyaktighet i differensiere resectable PC (Stage 1/2) pasienter fra CP pasienter (AUC på 0,85, p = 0,029) i forhold til CA19-9 alene betydelig (AUC 0,74), noe som gir en lovende tilnærming til PC diagnose på et tidlig stadium. Betydningen av MIC-1 som en biomarkør for PC må undersøkes i større pasient kohorter.
CA19-9 er en velkjent molekylær markør i PC. Biokjemisk, er det den sialylert Lewis-antigenet tilstede på flere glykoproteiner. Totalt, har en rapporterte sensitivitet og spesifisitet på mellom 70% -80% og 70% -90% henholdsvis [17], [18]. Imidlertid er dens store ulempen at det også kan være positiv i flere gunstige betingelser [1], [19]. I vår studie har vi observert at CA19-9 på vanlig ansatt cut-off av 37 U /ml var 83% sensitiv og 67% spesifikk i skille PC pasienter fra HC’er og 83% sensitive med 61% spesifisitet i differensiere PC pasienter fra CP. Interessant, de optimale cut-offs for CA19-9 som en diagnostisk markør (55 U /ml, 79% sensitive og 92% bestemte i sært PC pasienter fra HC’er og 62,2 U /ml, 79% sensitive og 78% bestemte i differensiere PC pasienter fra CP) var høyere enn den vanlig klinisk anvendte cut-off på 37 U /ml. Disse høyere cut-offs, men som gir tilsvarende følsomhet, økt spesifisitet av CA19-9 (tabell 4). Denne observasjonen tyder på at ingen enkelt cut-off for CA19-9 (eller for den saks skyld andre biomarkør) gjelder for alle situasjoner. I tillegg Morris-stiv et al, observert at forhøyede nivåer av CA19-9 direkte korrelert med graden av galleveisobstruksjon (
r
= 0,911,
P
0,001). Men for ondartede sykdommer CA19-9 nivåene ble forhøyet uavhengig av bilirubin (
r
= 0,117288,
P
= 0,603) [20]. Tilsvarende vurderes vi korrelasjonen mellom serum bilirubin med CA19.9 nivå i både CP og PC tilfeller. Imidlertid ble ikke observert noen sammenheng mellom CA19.9 og bilirubin nivåer for PC (r = 0,179 p = 0,080) og CP tilfeller (r = 0,459 p = 0,042). Større studier i fremtiden vil ta sikte på å vurdere effekten av hver av disse cut-offs skille bestemte grupper.
En begrensning med denne studien er mangelen på informasjon om den prognostiske betydningen av NGAL og MIC-1 i PC. Forhøyede NGAL nivåer har blitt rapportert i tidligere studier å korrelere med redusert overlevelse i eggstokkene [21] bryst [22] og magekreft [23] pasienter mens MIC-1-nivå ikke viser noen sammenheng med overlevelse i spiserørskreft [24], men, når forhøyet i cerebrospinalvæsken, ble forbundet med en kortere overlevelse hos pasienter med glioblastom [25]. I tillegg er involvert studiet 51% av pasientene med PC resectable (trinn 1/2) tumor (tidlig stadium tumor), et scenario ganske forskjellig fra klinikker. Således diagnostiske effekt av disse markørene kan variere i henhold til befolkningen settet. Fremtidige studier vil forsøke å svare på dette spørsmålet for å bedre avgrense klinisk anvendelse av disse biomarkører i forvaltningen av PC.
Styrken vår studie er den strenge design og teknikker som brukes. Spesielt Koopman og kolleger hadde ansatt ELISA å måle både CA19-9 og MIC-1. Imidlertid er klinisk, CA19-9 nivåer er vanligvis målt ved hjelp av radioimmunoassay (RIA). I første omgang prøvde vi å ansette ELISA å måle CA19-9 å prøve og holde vår metodikk som ligner på tidligere studie som mulig. Men vi bemerket at målingene ved hjelp av ELISA manglet reproduserbarhet (data ikke vist). Derfor, vi deretter re-analysert alle prøvene for CA19-9 nivåer ved RIA. Dermed studien var ikke bare en eksperimentell studie, men også bidratt til å validere tidligere studier. Basert på våre observasjoner, vi er enige med ansette RIA teknikk for reproduserbar måling av CA19-9.
I sammendraget, vi har undersøkt om kvantitativ måling av NGAL, MIC-1 og CA19-9 kan være nyttig i diagnostisering av PC. Vi observerte at mens nivået av alle tre biomarkører ble signifikant forhøyet i PC i forhold til HC’er, bare CA19-9 og MIC-1 ble signifikant forhøyet i CP pasientene sammenlignet med HC’er. Logg forvandlet verdien av NGAL var mer spesifikk enn CA19-9 skille scenen 3/4 PC pasienter fra CP tilfeller mens det av MIC-1 var mer følsom (stadium 1/2 PC fra HC’er) eller spesifikke (stadium 1/2 vs CP ) enn CA19-9 i en sub-gruppe spesifikk måte. CA19-9 gir bedre resultat med å skille PC danner CP-pasienter eller HC’er på et høyere cut-off-verdi enn den som vanligvis benyttes cut-off på 37 U /ml. En kombinasjon av MIC-1 og CA19-9 var bedre enn den sistnevnte alene skille resectable PC fra CP-pasienter, mens tilsetningen av NGAL forbedret evne til å skille CA19-9 stadium 3/4 PC tilfeller fra HC’er.
