Abstract
V-Raf Murine Sarkom Viral Oncogene homolog B (BRAF) mutert lungekreft er relativt aggressiv og er motstandsdyktig mot tiden tilgjengelige behandlinger. I en fersk fase II studie for pasienter med BRAF-V600E ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), BRAF V600E inhibitor viste tegn til aktivitet, men 30% av denne utvalgte gruppen kommet under behandling, noe som tyder på et behov for å utvikle alternative strategier. Vi testet to ulike alternativer for å forbedre effekten av vemurafenib (BRAF V600E hemmer) i BRAF mutert NSCLC. Det første alternativet var tillegg av erlotinib til vemurafenib å se om kombinasjonen gitt synergi. Den andre var å indusere MEK hemming (nedstrøms RAF) med trametinib (MEK hemmer). Vi har funnet at kombinasjonen av vemurafenib og erlotinib var ikke synergistisk til inhibering av p-ERK signalisering i BRAF-V600E celler. Vemurafenib forårsaket betydelig apoptose, G1 arrest og oppregulering av BIM i BRAF-V600 celler. Trametinib var effektiv som monoterapi i BRAF muterte celler, enten V600E eller ikke-V600E. Til slutt, kombinasjonen av vemurafenib og trametinib skyldes en liten, men signifikant økning i apoptose, så vel som en betydelig oppregulering av BIM sammenlignet med hvert enkelt middel. Dermed antydet at muligheten for å benytte en combi tilnærming for behandling av denne pasientgruppen. Viktigere, trametinib alene forårsaket oppregulering av p-AKT i BRAF ikke-V600 muterte celler, mens denne effekten ble opphevet med kombinasjonen. Dette funnet tyder på at, vil kombinasjonen av en MEK hemmer med BRAF-hemmer være mer effektiv i klinisk setting for pasienter med BRAF muterte NSCLC
Citation. Joshi M, Rice SJ, Liu X, Miller B, Belani CP (2015) Trametinib med eller uten vemurafenib i BRAF mutert ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (2): e0118210. doi: 10,1371 /journal.pone.0118210
Academic Redaktør: Santosh Patnaik, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 10. september 2014; Godkjent: 09.01.2015; Publisert: 23 februar 2015
Copyright: © 2015 Joshi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
et flertall av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er diagnostisert på et senere tidspunkt og tilgjengelige behandlinger, inkludert kjemoterapi og strålebehandling synes å være utilstrekkelig i å slå denne dødelige sykdommen. Tilstedeværelsen av et aktiverende mutasjon i den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) er assosiert med høye responsrater og forbedret progresjon overlevelse (PFS) med anvendelse av EGFR-tyrosinkinase-inhibitorer (TKI) [1-3]. Erlotinib og gefitinib er første generasjons TKI som forårsaker reversibel hemming av tyrosin kinase domene av EGFR. Erlotinib ble først godkjent for klinisk bruk i avansert NSCLC i den andre linjen innstilling på grunnlag av positive resultatene i fase 3 BR 21 prøve [4]. Fase 3-studier, som OPTIMAL (erlotinib versus kjemoterapi som førstelinjebehandling for pasienter med avansert EGFR mutasjon-positive ikke-småcellet lungekreft) [5] og IPASS (Iressa Pan Asia Study) [6], har vist klare forbedringer i responsrater og progresjonsfri overlevelse (PFS) med første generasjons TKI i første linje innstillingen i forhold til tradisjonelle platinumbasert kjemoterapi. Dette har allerede ført til bruk av EGFR TKI som førstelinjebehandling for pasienter med NSCLC skjuler en allergi EGFR mutasjon i motsetning til standard kombinasjonskjemoterapi. På samme måte kan BRAF (v-Raf muse sarkom viral onkogen homolog B1) mutasjon også kjøre svulst utvikling i NSCLC. Mutasjoner i
BRAF
genet har en frekvens på ~2-3% i NSCLC [7,8]. En V600E mutasjon på ekson 15 omfatter ca 50% av alle BRAF mutasjoner mens ikke-V600E BRAF mutasjoner utgjør resten 50% [9].
BRAF mutant NSCLC er antatt å være aggressive og vise resistanceto tilgjengelige behandlinger [10]. Vemurafenib er en oral BRAF inhibitor selektive for V600E mutasjon, og har vist seg å være effektiv i behandling av pasienter med avanserte melanoma den samme mutasjon. Det er bevis for å underbygge at BRAF-hemmere, som brukes alene NSCLC med BRAF-V600E positiv mutasjon, viser bare en beskjeden fordel med ingen komplett respons, 40% delvis respons, og 30% med sykdomsprogresjon under behandling [11]. Effekten av MEK (MAPK /ERK kinase) hemming i BRAF mutant NSCLC har ikke blitt grundig undersøkt og en fersk undersøkelse viste at kombinasjonen av en BRAF-hemmer (dabrafenib) og MEK inhibitor (trametinib) var også effektive i behandling av avansert melanom [12 ]. Trametinib er en muntlig tilgjengelig MEK hemmer nylig godkjent av Food and Drug Administration (FDA) for bruk i behandling av metastatisk melanom hos pasienter med BRAF-V600E og BRAF-V600K mutasjoner, basert på resultater fra en klinisk studie av Flaherty
et al.
, viser en betydelig fordel både i progresjon og total overlevelse [13].
i prekliniske omgivelser, har reseptor-tyrosinkinase (RTK) en dominerende innvirkning på undertrykkelse av fosfoinositid 3-kinase (PI3K ) signalveien. En av mekanismene for resistens for RTK inhibering i KRAS mutant cellelinjer er ved aktivering av Ras-signalreaksjonsveien [14]. En tykktarmskreft cellelinje med en BRAF V600E mutasjon ble vist å flykte vemurafenib hemming ved å aktivere epithelial vekstfaktor reseptor (EGFR); imidlertid, behandling av disse cellene med vemurafenib og en EGFR-inhibitor forhindret vemurafenib motstand og induserte apoptose [15]. Vi hypotese at mutasjon i BRAF sti fører til hyper-aktivering av ERK og dermed ville kombinere EGFR hemming med BRAF hemming være til nytte. Vi har også satt ut for å finne ut om MEK hemmer trametinib ville bevisst BRAF muterte villtype (WT) EGFR NSCLC celler til BRAF hemming av vemurafenib. Vi antok at BRAF-V600E cellene har begrenset følsomhet for BRAF hemmer på grunn av aktivering av MAPK-reaksjonsveien [12]. Derfor trametinib kan forbedre effekten av en BRAF-hemmer i BRAF mutert NSCLC. Motstand mot BRAF-hemmere er mediert gjennom flere mekanismer som induserer aktivering av MAPK veien [16-19]. Trametinib rettet mot MEK, som er nedstrøms av BRAF i MAPK-reaksjonsveien. Derfor, ved å kombinere trametinib med en BRAF inhibitor, enten vemurafenib eller dabrafenib, vil være mer effektive. Vårt mål var å undersøke om trametinib og vemurafenib kan samarbeide for å undertrykke ERK /MAPK signalveien i BRAF mutant NSCLC cellelinjer. Vi sammenlignet effekten av enkeltstoffer, vemurafenib eller trametinib, som for kombinasjonen av vemurafenib pluss trametinib i BRAF mutert NSCLC cellelinjer, HCC364 [V600E-BRAF, WT EGFR] og H1755 [non-V600E, G469A BRAF mutant, WT EGFR ].
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP, reagenser og antistoffer
A549, H460, H1755 ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manasses, VA). Mens ble HCC364 cellelinje hentet fra Dr. Adi F. Gazdar forskningslaboratorium, University of Texas, Southwestern Medical Center (Dallas, TX) [20]. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, streptomycin og penicillin ved 37 ° C med 5% CO
2. BRAF V600E og G469A mutasjoner i HCC364 og H1755 celler henholdsvis ble bekreftet ved hjelp av et øyeblikksbilde fragment analysemetode i henhold til protokoll utviklet av Su et al. (S1 fig.) [21]. Antistoffer ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA). Erlotinib, vemurafenib og trametinib ble hentet fra Selleckchem (Houston, Texas).
Cell spredning og langsiktige vekstanalyser
Celler ble sådd på 1×10
4 celler per brønn i en 96 -Vel vev kultur plate. Dagen etter ble cellene behandlet med erlotinib, trametinib, vemurafenib eller kombinasjoner som vist i figuren legender. Dimetylsulfoksyd (DMSO) ble anvendt som en bærerkontroll. Celleproliferasjon ble målt 48 eller 72 timer etter behandling ved hjelp av en Cell Titer 96 vandig ikke-radioaktivt analyse celleproliferasjon (Promega, Madison WI) i henhold til produsentens protokoll. Relativ levedyktighet ble beregnet for hver brønn ved å trekke bakgrunnen absorbans før normalisering til kjøretøy kontroll behandles brønner.
De langsiktige vekst analysene ble utført ved seeding celler på 1500 celler per brønn på en 12-brønners plate. Legemidlene ble tilsatt direkte til hver brønn neste dag, og friskt medium med medikamentet ble tilsatt etter 4 dager. Etter 7 dager ble cellene vasket med PBS, fiksert i 2% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur (RT), inkubert med 70% etanol i 5 minutter, og deretter farget med 0,1% trypanblått i 60 minutter ved RT. Etter avfarging i PBS tre ganger, ble brønner skannet. Deretter ble fargestoff solubilisert i 1% SDS, og absorbansen ble målt ved 590 nm for tre 100 pl prøver fra hver brønn på en synergi HT plateleser (BioTek, Shoreline, WA). Bakgrunn absorbans fra en brønn uten celler ble trukket fra eksperimentelle verdier, og eksperimentelle verdier ble normalisert til kjøretøy behandling.
Immun analysen
Proteiner ble høstet fra celler i en lysebuffer som inneholder 40 mM Tris.Cl pH 7,6, 1% Triton X-100, 1% deoksykolat, 150 mM NaCl pluss proteaseinhibitorer og fosfatase-inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C i 30 minutter. Totalt protein ble kvantifisert med en BCA kit (Thermo Scientific, Waltham MA), og like mengder protein ble fordelt gjennom 10% SDS-PAGE-geler, elektro til PVDF, og blokkert med 5% NFDM. Blokkerte membranene ble inkubert over natten med primære antistoffer, med passende HRP-konjugert sekundært antistoff, før kjemiluminescens deteksjon.
Flowcytometri
Apoptose ble analysert ved farging celler med FITC-merket Annexin-V ( BD Pharmingen, San Jose CA)) og ViaProbe (7-AAD, BD Pharmagen) før analyse på en Calibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose CA). Celler ble sådd i tre eksemplarer på en 6-brønners plate, og de påfølgende dager ble cellene behandlet med de angitte stoffene. Paclitaxel ble anvendt som en positiv kontroll for apoptose eksperimenter. Tjuefire til 48 timer etter behandling, ble flytende cellene og tilfestede cellene høstet og deretter farget med Annexin V-FITC-og 7-AAD 1x annexin V-bindingsbuffer (BD Biosciences) i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Fluorescens ble målt med en flowcytometer, og resulterende data ble analysert med WinMDI 2.8 programvare (The Scripps Institute, https://facs.scripps.edu/software.html).
Cellesyklus analyse ble utført av etidium bromide farging. Celler ble sådd i tre eksemplarer på en 6-brønns plate en dag før behandling. Etter 24 timer ble kjerner høstet og farget i en hypotonisk lyseringsløsning (7 mM natriumcitrat, 0,2% Triton X-100) med etidiumbromid (50 ng /ml) og RNase A (50 ug /ml) i 30 minutter i mørk. Fluorescens ble målt på en Calibur Flowcytometer. De innsamlede dataene ble analysert ved hjelp ModFitLT 3.2 programvare (Verity Software House, Topsham ME).
Statistisk analyse
Den statistiske betydningen av forskjeller mellom to grupper eller mellom flere grupper ble analysert med tosidig uparede Student t-tester (for like avvik) som gjennomføres av Excel 2007 (Microsoft Corp., Redmond WA). Alle data som vises er gjennomsnittet SEM av tredoble verdiene fra tre separate forsøk. * P 0,05, ** p 0,01 og *** p 0,001 sammenlignet med kontrollgruppen. Uavhengig Student t-tester eller enveis ANOVA ble brukt for å sammenligne kontinuerlige variabler mellom de to gruppene, eller mer enn to grupper. Resultatene ble ansett for å være statistisk signifikant på p 0,05. Den cytotoksiske synergi ble analysert og fremstilles grafisk ved bruk av CalcuSyn programvare (BioSoft, Cambridge UK), og ble uttrykt som en kombinasjon indeksen ved LC99 (dvs. konsentrasjonen dødelig for 99% av cellene). Ytterligere bekreftelse ble oppnådd med i en 5×5 matrise ved hjelp av en CellTiter-Glo analyse og Bliss additiv modell analyse.
Resultater
Uttrykk for p-ERK og p-AKT signaler i NSCLC celler
Dereguleringen av både RAF /MAPK og AKT /mTOR signalveier er tenkt å spille en avgjørende rolle i kreftutvikling og tumorprogresjon hos NSCLC [22]. Utallige komponenter av disse signalveier kan fungere som molekylære mål i kreftbehandling, men det er viktig å vite at tilstedeværelsen av disse avvikene i kreftceller for klinisk innblanding [23]. Vi først bestemt referanse ekspresjon av fosforylert (p) -AKT og p-ERK 1/2 i våre cellelinjer (Fig. 1A). Fosforylert ERK signal ble påvist i alle fire-cellelinjene anvendt i våre forsøk, noe som tyder på at den ERK-reaksjonsveien spiller en viktig rolle i kreftutvikling i KRAS eller BRAF muterte celler. Legemidler som er rettet mot denne veien kan vise seg effektive. Imidlertid, p-AKT ble svakt påvist i BRAF muterte celler, HCC364 og H1755 i forhold til A549 og H460 cellelinjer, slik som vist i fig. 1A. Dette kan tyde på at AKT signalveien ikke kan spille som avgjørende rolle i BRAF muterte celler
A:. Western blot av fosforylert AKT og ERK signal i innfødte ubehandlet cellelinjer ([+] mutert [-] vill type). Alle baner er fra samme gel og pause ble opprettet for å inkludere bare relevant cellelinjer B: A549, H460, H1755 og HCC364 cellelinjer som ble behandlet med D (DMSO) eller indikert narkotika, E (erlotinib), V (vemurafenib), og EV (erlotinib-vemurafenib) ble analysert etter 72h av en MTS analyse. IC50 for vemurafenib i HCC364 var 0,8 mikrometer. C: Western blot forskjellige NSCLC cellelinjer, viser endringer i p-ERK, p-AKT og PARP med kjøretøy D (DMSO), E (erlotinib) 1,6 mikrometer, V (vemurafenib) 1,6 mikrometer, EV (erlotinib + vemurafenib) 1,6 /1.6, iM etter 24 behandling. D: Apoptose av flowcytometri 48t etter behandling med D (DMSO), E (erlotinib) 1,6 mikrometer, V (vemurafenib) 1,6 mikrometer, EV (erlotinib /vemurafenib 1,6 /1,6 mm). Western blot, post 48t, støtter PARP cleavage med V og EV i HCC364 men ikke H1755 celler.
Erlotinib og vemurafenib
Effekten av kombinasjonsbehandling med erlotinib og vemurafenib. Kombinasjonen av en EGFR målrettet monoklonalt antistoff (cetuximab) og BRAF (vemurafenib) hemming hadde vist effekt i tykktarm kreft celler med BRAF mutasjon [15]. Vi har søkt for å fastslå om et lignende konsept å kombinere BRAF og EGFR hemninger kan være effektive i NSCLC-cellelinjer. A549, ble H460, H1755 og HCC364 celler behandlet med varierende konsentrasjoner av erlotinib, vemurafenib, eller en kombinasjon av erlotinib og vemurafenib (5-gangers seriefortynninger av enkle midler og 2,5 gangers fortynninger på 1: 1 forhold av kombinasjonen). Celleproliferasjon analysene viste at bare HCC364 celler var følsomme for vemurafenib og kombinasjonen av vemurafenib og erlotinib var ikke effektiv (Fig. 1B). H1755 cellene var mindre følsomme for vemurafenib og ingen signifikant synergi ble observert med kombinasjonen av erlotinib og vemurafenib. Vemurafenib var ineffektive i KRAS muterte celler (A549, H460). I tillegg ble det mangel på synergi mellom erlotinib og vemurafenib bekreftet ved hjelp av BLISS metoden (S2 fig.) [24].
onkogene signal endringer etter behandling i 24 timer med en kombinasjon av vemurafenib pluss erlotinib (1,6 mikrometer /1.6 uM) ble analysert ved immunblot-analyse (fig. 1C). Vemurafenib redusert fosforylering av ERK i HCC364 celler bare uten en etterfølgende økning i aktivert AKT. Dette funnet antydet at mangelen på synergi mellom erlotinib og vemurafenib sett i proliferasjonsanalyser er på grunn av ERK-AKT forhold sett i tykktarmskreft, og er ikke til stede i de HCC364 cellene. Dette er sannsynligvis ikke relatert til valg av EGFR-hemmer (cetuximab vs. erlotinib). Vemurafenib alene induserte aktivering av ERK-signalering i ikke-BRAF muterte celler, A549 og H460. Ingen signifikant endring i aktivert ERK ble notert i H1755 celler etter vemurafenib behandling. Interessant, observerte vi at kombinasjonen av vemurafenib og erlotinib resulterte i en reduksjon i aktivert AKT i KRAS muterte celler (fig. 1C).
Til slutt, vurderte vi endring i apoptose etter erlotinib og vemurafenib behandlinger alene eller i kombinasjon . HCC364 celler var følsomme for vemurafenib-indusert apoptose og PARP-spaltning, mens H1755-celler var resistente (Fig. 1D). Mekanismen av apoptose ble bestemt ved Immunoblotanalyse analyser etter 48 timers behandling med vemurafenib og det forårsaket en økning i BIM (pro-apoptotiske), sammenlignet med DMSO. En reduksjon i MCL-en (anti-apoptotiske) ble også sett med vemurafenib men ingen endring ble sett i BCL-XL (anti-apoptotiske), BCL-2 (anti-apoptotiske), BAK (pro-apoptotiske), og BAX ( pro-apoptotiske) sammenlignet med DMSO (S3 fig.).
Virkning av monoterapi vemurafenib i BRAF muterte NSCLC-cellelinjer. Ved hjelp av en langsiktig vekstanalyse vemurafenib ble funnet å være effektive i BRAF-V600E muterte HCC364 celler og ikke i ikke-V600E BRAF mutert H1755-celler (fig. 2A). Vi ønsket da å ytterligere evaluere den molekylære mekanismen bak denne anti-tumor aktivitet. Vi analyserte endringer i cellesyklus 24 timer etter behandling med vemurafenib i både HCC364 og H1755 celler. I HCC364 celler, vemurafenib forårsaket en betydelig økning i antallet av G1-celler med en påfølgende reduksjon i S-faseceller, som støtter G1 arrest i V600E muterte celler. Vemurafenib, men var ineffektiv til å forårsake en G1 blokk i H1755 celler (fig. 2B). Immunoblotting viste forandringer i cellesyklusproteiner i HCC364 celler, etter vemurafenib behandling inkludert, nedregulering av CDK2 uttrykk og oppregulering av p21 og P27 uttrykk (Fig 2C.)
A:. Langsiktig vekstanalyse, 7 dager etter behandling med kjøretøy-D (DMSO), vemurafenib 50 nM, 500 nM, 5000 nM i både HCC364 og H1755 celler. HCC364 cellene mer følsomme for vemurafenib. * P 0,05; *** P 0,001 sammenlignet med DMSO. B: Cellesyklus analyser av flowcytometri 24 timer etter behandling med DMSO, V (vemurafenib) i HCC364 og H1755 celler. Cell faser som vises er G1, S og G2 fase. V induserer cellesyklusarrest i HCC364 celler, som vist ved en økning i G1 og en signifikant reduksjon i S-fasen. C: Western blot ved 48 timer etter behandling støtte bevis for G1 arrest, og viser økning i p27 og reduksjon av CDK2 med V (vemurafenib) sammenlignet med D (DMSO). Ingen effekt ble sett i H1755 celler. Alle baner for HCC364 og alle baner for H1755 er fra samme gel. Bruddet har blitt opprettet for å fjerne erlotinib behandlet baner.
Trametinib og vemurafenib
Effekt av kombinasjonsbehandling med trametinib og vemurafenib. Behandling med kombinasjon av MEK hemmer og BRAF-hemmer har vært effektiv i avansert melanom med BRAF-V600 mutasjon, men effekten av MEK hemmer eller dette tilsvarende kombinasjon er ikke blitt undersøkt i BRAF mutert NSCLC [12]. Vi analyserte om tilsetting av trametinib til vemurafenib ville vise noen effekt i BRAF muterte celler, H1755 og HCC364. Trametinib var mer effektiv ved å hemme vekst etter syv dager i begge cellelinjer sammenlignet med vemurafenib, men kombinasjonen av de to medikamenter ble ikke signifikant forskjellig enn trametinib alene (Fig. 3A, B). Vi evaluerte forskjeller i cellesyklus for begge BRAF mutante NSCLC-celler etter en 24-timers behandling med DMSO, vemurafenib, trametinib og kombinasjonen (Fig. 3C). Både vemurafenib og trametinib var effektive til å forårsake G1 rest som gjenspeiles av en betydelig økning i G1 fase og en reduksjon i S-faseceller sammenlignet med DMSO behandling. Men kombinasjonen var ikke mer effektiv enn noen av de enkelte midler alene. Cellesyklus-stans observert med flowcytometri i HCC364 cellene ble bekreftet ved immunoblot assay for cellesyklusproteiner etter 24 timers behandling med de respektive midler. Den viste nedregulering av CDK2 med oppregulering av p21 og p27 med vemurfenib, trametinib og kombinasjonen sammenlignet med DMSO (Fig. 3D). Men det var ingen forskjell angitt i cellene behandlet med trametinib, vemurafenib, eller en kombinasjon av trametinib pluss vemurafenib i uttrykk for CDK2, p21 eller p27 i disse cellene (fig. 3D). I tillegg gjorde vi ikke observere noen forskjell i pJAK2 og pSTAT3 uttrykk (S4 fig.) Interessant, gjorde H1755 celler ikke viser en tilsvarende trend i CDK2 eller p21 og p27 på tross av G1 arrest og reduksjon i S-fasen sett med flowcytometri ( fig. 3D). Dette gjør oss til å tro at det er en annen mekanisme involvert i G1 arrest, som er uavhengig av CDK2 downregulation i disse cellene
A, B:. Langsiktig vekstanalyse, 7 dager etter behandling med kjøretøy-DMSO (D ), V (vemurafenib) 1fiM, T (trametinib) 1fiM og TV (trametinib + vemurafenib, 1 mM hver) i HCC364 (A), og H1755 celler (B). C: Celle syklus analyser ved flow-cytometri i HCC364 og H1755-celler etter 24 timers behandling med D, V 0,5 pM, 0,5 pM T, TV 0,5 /0,5 uM. D: Western blot etter 24 av H1755 og HCC364 behandlet som i C (*** p 0,001 sammenlignet med DMSO)
Vi har utforsket videre apoptotiske effekten av vemurafenib og trametinib kombinasjon i. BRAF mutert NSCLC celler. Trametinib indusert apoptose i begge BRAF muterte cellelinjer. Kombinasjonen av vemurafenib og trametinib forårsaket betydelig høyere apoptose enn både monoterapi i HCC364 og H1755 (fig. 4A). Apoptose etter forskjellige doser av trametinib behandling ble bekreftet ved tilstedeværelse av PARP spalting i HCC364 celler, mens en reduksjon i PARP ble sett på H1755-celler uten tilstedeværelse av spaltet PARP (Fig. 4B). Forekomsten av apoptose ble videre støttet av oppregulering av pro-apoptotiske proteiner, BIM, både HCC364 og H1755 celler ved behandling med trametinib. Kombinasjonen forårsaket større økning i BIM sammenlignet med trametinib alene. Denne observasjonen tyder på at kombinasjonen av vemurafenib og trametinib er bedre å fremme apoptose enn trametinib alene i BRAF muterte celler (Fig. 4C). Det ble ikke observert signifikante endringer i uttrykket av BCL-2, BCL-XL, MCL-en, BAX og BAK
A:. apoptose ved flowcytometri, 48t etter behandling med kjøretøy-D (DMSO), V ( vemurafenib 1 mm), T (trametinib 1 mm), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 mm) i HCC364 og H1755 celler. (* P 0,05, ** p 0,01; *** p 0,001). B: Western blot av spaltet PARP i HCC364 og H1755, 48 timer etter behandling med D (DMSO) og varierende mengder vemurafenib (0,25, 0,5, 1 uM) og trametinib (0,25, 0,5, 1 uM) C: Western blot viser endringer i ERK, AKT, BIM, PARP cleavage, 48t etter behandling med kjøretøy D (DMSO), V (vemurafenib 1 mm), T (trametinib 1 mm), TV (trametinib + vemurafenib 1/1 um) i HCC364 og H1755 celler. Fire kjørefelt ble behandlet i duplikater for hver cellelinjer og bare den venstre 4 baner av hver cellelinjer har blitt vist i figuren.
Trametinib som monoterapi i BRAF mutert NSCLC. Den MEK hemmer, selumetanib vist seg å nedregulere ERK signal i prekliniske lunge modeller med KRAS muterte NSCLC, men en lignende effekt er ikke vist i BRAF mutert NSCLC [25]. Vi ønsket å sammenligne de onkogene signalendringer som følge av innføring av en BRAF inhibitor, en MEK-inhibitor, eller en kombinasjon av begge i BRAF mutert NSCLC. Endringene i onkogene signaler ble evaluert ved å utføre en immunoblot-analyse for å vurdere endringer i apoptose signaler i begge celler med vemurafenib vs vs trametinib kombinasjonen ved 48 timers behandling med 1 uM dose av enkle midler og 1: 1-forhold av kombinasjonen, 1: 1 um doser hver. Vi har observert at behandling med trametinib forårsaket en signifikant suppresjon i fosforylering av ERK sammenlignet med DMSO eller vemurafenib alene i både HCC364 og H1755-celler (Fig. 4C). Kombinasjonen av trametinib og vemurafenib var ikke bedre enn trametinib alene. I tillegg har vi oppdaget at pakt ikke var forhøyet i HCC364 celler ved bruk av enten enkle midler eller kombinasjon (p-AKT ble svakt påvist i HCC364 celler og ekspresjon ble ikke endret-immunoavtrykket er ikke vist). Men vi så en økning i p-AKT uttrykk med bruk av monoterapi trametinib i ikke-V600E BRAF mutert H1755 celler og interessant kombinasjon av trametinib og vemurafenib ikke viser en økning i p-AKT sammenlignet med DMSO, noe som tyder på at kanskje p-AKT-reaksjonsveien kan spille en rolle i resistens mot behandling med monoterapi trametinib. Trametinib er også effektiv i å forårsake apoptose i både HCC364 og H1755-celler (Fig. 4A). I tillegg trametinib også forårsaket G1 arrest i begge BRAF muterte celler (fig. 3C). Selv om endringene i cellesyklusproteiner, nedregulering av CDK2 og oppregulering av p21 og P27 uttrykk, ble bare sett i HCC364 celler.
Diskusjoner
BRAF pathway spiller en viktig rolle i tumordannelse i NSCLC, BRAF-hemmere, vemurafenib og dabrafenib har vist bare beskjeden effekt i BRAF-V600E muterte kreft [11,13]. Til tross for målretting denne spesifikke mutasjon, bruk av dabrafenib, i NSCLC med BRAF-V600E mutasjon har resultert i bare en responsrate 40% sammen med et skuffende 30% sykdomsprogresjon [11]. Disse resultatene reflekterer at BRAF hemming alene er ikke et ideelt alternativ behandling og nyere strategier for optimal og effektiv behandling av denne utvalgt gruppe pasienter er garantert. Denne hypotesen støttes også av en klinisk studie i melanom viser en betydelig fordel i progresjonsfri overlevelse med kombinasjon av dabrafenib pluss trametinib vs. dabrafenib alene [12]. Våre in-vitro eksperimenter gjorde bekrefte at vemurafenib er effektive i å hemme veksten, redusere ERK signalering, og indusere apoptose i BRAF V600E mutant cellelinje HCC364, mens i ikke-V600E BRAF mutant cellelinje, H1755, var ikke så følsom. Prahallad
et al.
, Har vist økt aktivitet ved kombinert behandling av EGFR-hemmer cetuximab med vemurafenib ved å koble ERK og AKT signaliserer gjennom mellomledd CDC25C i BRAF muterte tykktarmskreftceller [15]. Men våre resultater gjenspeiler at kombinasjonen av erlotinib og vemurafenib er ikke effektiv i NSCLC celler. Selv om vi ikke var i stand til å oppdage CDC25C i BRAF mutant cellelinjer HCC364 (V600E) og H1755 (non-V600E), disse cellene ikke svare på ERK hemming med forbedret AKT aktivering som tyder på at ERK og AKT signalering ikke er knyttet sammen gjennom CDC25C i disse -celler.
vemurafenib var i stand til å modulere apoptose-relaterte proteiner og cellesyklus [26,27]. Vi fant at behandling med vemurafenib resulterte i reduserte nivåer av anti-apoptotiske proteiner MCL-en og forhøyede nivåer av pro-apoptotiske proteiner BIM i NSCLC cellelinjer. MCL-1 tap sammen med økt BIM [28-30], fører til apoptose induksjon, og økte nivåer av BIM kan også initiere apoptose [31-33]. I tillegg er cellesyklusrelaterte proteiner, CDK2, ble nedregulert under cellecyklus-hemmende proteiner, p21 og p27, ble oppregulert etter vemurafenib behandling i HCC364 celler, noe som resulterer i vekststans. Vi spekulerer i at disse protein expression endringene er trolig sammenheng med redusert aktivitet av ERK [34,35], siden tilsvarende effekt ble sett ved behandling med trametinib (Fig. 3D). Dette styrker vår hypotese om at modulering av BIM og MCL-en er knyttet til redusert aktivitet av ERK i HCC364 celler. Dessverre, H1755, BRAF-ikke-V600E celler, viste G1 cellesyklus arrest avhengig nedregulering av ERK ved behandling med trametinib. Cellesyklus-stans skjedd uten endring av cellesyklusproteiner, CDK2, p21 og p27. Dette tyder på at H1755 celler kan ha en annen mekanisme som er involvert i G1 rest uavhengig av CDK2 sjekkpunktet i cellesyklusen.
Våre resultater viser trametinib er effektiv til å forårsake apoptose i både BRAF V600E og ikke-V600E muterte celler. Trametinib var potent i å redusere ERK signal i BRAF mutante celler, og dette undertrykkelse er mer uttalt med trametinib sammenlignet med vemurafenib selv i BRAF V600E muterte celler. De langsiktige vekstanalyseresultatene viser også at trametinib har bedre effekt som monoterapi sammenlignet med vemurafenib i BRAF V600E celler, men dette kan være som et resultat av en kortere halveringstid på vemurafenib [36,37]. Interessant, behandling med monoterapi trametinib forårsaket oppregulering av AKT-signalisering i BRAF ikke-V600E bare celler, noe som tyder på en potensiell flukt mekanisme for utvikling av resistens mot behandling med MEK-inhibitor alene. Dette kan gi et innblikk i utviklingen av resistens mot MEK-hemmere. Den AKT svei synes ikke å være oppregulert ved BRAF ikke-V600E-celler ble behandlet med kombinasjonen av trametinib og vemurafenib, noe som tyder på at kombinasjonsbehandling kan være overlegne i forhold til hver av de to enkle midler i denne gruppen også. Det mekanistiske forhold mellom ERK inhibering og AKT aktivering i BRAF mutant NSCLC av MEK-inhibitor må videre evaluert. Vi viste også for første gang at kombinasjonsbehandling forårsaket en signifikant økning i oppregulering av BIM i begge V600E og ikke-V600E celler, og dermed spiller en betydelig rolle i apoptose [31]. Kombinasjonen behandling forårsaket også liten, men en betydelig styrking i apoptose i BRAF muterte cellene sammenlignet med monoterapi, noe som tyder på begrunnelsen for å bruke kombinasjon av BRAF og MEK hemmer i denne utvalgt gruppe. I tillegg kan kombinasjonen av trametinib og vemurafenib overvinne motstanden til trametinib alene og således bedre enn monoterapi trametinib. Lupin et al. har fremhevet det mulig mekanisme bak motstanden i BRAF-V600E muterte NSCLC celler til BRAF-hemmer [38]. De to diskrete molekylære mekanismer for å skaffe BRAF-hemmer motstand inkluderer tap av full-lengde i BRAF-V600E kombinert med uttrykk for en avvikende form for BRAF-V600E som beholder RAF sti avhengighet og konstituerende autokrint EGFR signale drevet av c-Jun-mediert EGFR ligand uttrykk. Våre resultater støtter hypotesen om BRAF- mutasjon uavhengig aktivering av MAPK vei som fører til utvikling av resistens mot BRAF-hemmer ved behandling av BRAF-V600E mutert NSCLC. I tillegg har side-effekt og toksisitet profil (19% av kutant karsinomer i BRAF inhibitor arm
vs
. 7% i kombinasjonsterapi i melanomapasienter) favoriserer kombinasjonsterapi [12].
