Abstract
alfaføtoprotein (AFP) produserende magekreft (AFPGC) , representert ved produksjon av AFP, har en mer aggressiv atferd enn vanlig magekreft. De underliggende mekanismene er ikke godt forstått. Arsenikk (As
2o
3) brukes klinisk til å behandle akutte promyelocytic leukemi (APL) og har aktivitet
in vitro
mot flere solide tumorcellelinjer, med induksjon av apoptose og hemming av spredning de viktigste effektene. Signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) har en viktig rolle i tumorgenese av forskjellige primære kreftformer og kreftcelle ved oppregulering celle-overlevelse og downregulating tumorsupressorproteinene proteiner. Her fant vi redusert uttrykk for AFP og STAT3 etter induksjon av apoptose ved As
2o
3 i AFPGC FU97 celler. Også nivået av STAT3 target onkogen Bcl-2 ble redusert med As
2o
3, og den av tumor suppressor Bax ble økt. Videre ble STAT3 ekspresjon og dybde av invasjon og lymfeknutemetastase tilknyttet. Overlevelse av pasienter med magekreft var lavere med AFP og STAT3 dobbel overekspresjon enn med overekspresjon av enten alene. Nedregulering av AFP og STAT3 ekspresjon spiller en viktig rolle i As
2o
3-indusert apoptose av AFPGC celler, noe som tyder på en ny mekanisme for As
2o
3-indusert celle-apoptose. Som
2o
3 kan være et mulig middel for AFPGC behandling
Citation. Jia Y, Liu D, Xiao D, Ma X, Han S, Zheng Y, et al. (2013) Uttrykk for AFP og STAT3 er involvert i Arsenikk apoptose og hemming av spredning i AFP-produserende Gastric kreftceller. PLoS ONE 8 (1): e54774. doi: 10,1371 /journal.pone.0054774
Redaktør: Matias A. Avila, Universitetet i Navarra School of Medicine og Senter for anvendt medisinsk forskning (CIMA), Spania
mottatt: 4. november 2012; Godkjent: 14 desember 2012; Publisert: 30 januar 2013
Copyright: © 2013 Jia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien er støttet av National Nature Science Foundation Grant of China (NSFC, nr 81000869 og 81272588). (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default166.htm.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
alfaføtoprotein (AFP) er en stor plasma protein som produseres av plommesekken og leveren i fosterlivet. I klinisk praksis er AFP ofte brukt som en svulst markør for leverkreft og plommesekken svulster. Noen studier har vist at de andre tumorer hos mennesker kan også produsere AFP og magekreft var en av de mest vanlige [1] – [8]. AFP-produserende magekreft (AFPGC) har en mer aggressiv atferd enn vanlig magekreft fordi sykdommen utvikler seg raskt og metastasizes ofte i de regionale lymfeknuter og lever [7] – [10]. Videre er AFPGC forbundet med kortere intervall-fri levermetastaser etter radikal kirurgi, og overlevelsen er vesentlig dårligere med AFPGC enn uten AFP produksjon [1], [9], [10]. Således kan AFP være en passiv tumormarkør og en aktiv tumorvekst stimulator. Downregulating AFP uttrykk kan være en effektiv tilnærming til AFP-produserende kreft
Arsenikk (As
2o
3) har blitt brukt til å behandle leukemi [11] -. [13] og er aktiv i flere faste tumorer, inkludert magekreft [14]. Virkningsmekanismen for As
2o
3 omfatter påvirke virksomheten til Akt, JNK-kinaser, NF-kB, glutation, kalsiumsignalisering, reaktive oksygenarter (ROS), og caspaser, så vel som pro- og anti -apoptotic proteiner [15] – [18]. Ingen standard kjemoterapi er tilgjengelig for AFPGC, selv om noen regimer har vist effekt i et lite antall tilfeller [19] – [21]. Også, effekter og mekanisme av As
2o
3 mot AFPGC fortsatt uklare.
Signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er involvert i både signaloverføring og transkripsjonsaktivering og har viktige roller i en rekke biologiske prosesser som metabolisme og tumorigenesis [22], [23]. STAT3 er konstitutivt aktivert i en rekke forskjellige krefttyper [24], [25]. Målrette STAT3 kan være en effektiv tilnærming til å løse tumorprogresjon. Dette STAT3 virkning er mediert gjennom regulering av forskjellige STAT3 målgener, inkludert apoptose-inhibitorer og cellesyklus regulatorer, slik som Bcl-2, Mcl-1, Survivin, p53, c-Myc, cyclin D1 [26] – [31], og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [32]. Imidlertid er rollen til STAT3 i AFPGC dårlig forstått.
Her undersøkte vi effekten av As
2o
3 på spredning og AFP og STAT3 uttrykk i AFPGC FU97 celler. Vi evaluerte nedstrøms hendelsene STAT3 signalering, Bcl-2 og Bax uttrykk, for å utforske de mulige mekanismene bak dette fenomenet. Videre vurderte vi uttrykk for AFP og STAT3 ved immunhistokjemi i menneskelige mage kreftprøver. Downregulation AFP og STAT3 uttrykk bidro til As
2o
3-indusert apoptose og hemming av spredning i AFPGC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studieprotokoll ble godkjent av legeetikk andHuman Clinical Trial komiteen i Jinan Central Hospital. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Cell Culture and Drug Treatment
Den menneskelige AFPGC cellelinje FU97 ble hentet fra den japanske Innsamling av Forsknings Bioressurser (Japan) og ble opprettholdt i DMEM ( Invitrogen) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS;. Invitrogen), med 1% antibiotika ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet luft
2o
3 ( Sigma) ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) med 1 mol /l som en stamløsning og lagret ved 4 ° C. For
in vitro
bruk, stamløsningen ble fortynnet til passende konsentrasjon i dyrkningsmedium uten FBS. Eksponentielt voksende celler ble behandlet med As
2o
3 ved endelige konsentrasjoner på 1, 5 eller 10 umol /l. Kontrollkulturer ble behandlet med destillert PBS til en sluttkonsentrasjon på 0,1% i kulturmedium. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
MTT Cvtotoksisitetsmålinq
Effekten av As
2o
3 på å hemme
in vitro
vekst av FU97 celler ble bestemt ved måling av MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid) fargestoff absorbans av levende celler. FU97 celler ble sådd i 96-brønners plater med 1,6 x 10
3-celler per brønn i 100 ul DMEM inneholdende 10% FBS over natten. Etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av As
2o
3 i 24, 48 og 72 timer, 20 pl (5 g /l) MTT (Sigma, St. Louis, MO) løsning ble tilsatt til hver brønn og platene ble inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C. Formazine ble oppløst i 150 pl /brønn dimetylsulfoksid (DMSO), og absorbans ble registrert ved 490 nm. Inhiberingsgraden (%) = (1-A verdi i forsøksgruppen /A verdi i kontrollgruppe) x 100%. 0 mikromol /L gruppe ble brukt som blank kontroll.
DNA Fragmentering Analyse av Elektroforese
Det er totalt 10
6 celler ble forsiktig skrapet fra retter, vasket to ganger i kald PBS, og sentrifugert ved 15000 rpm i 10 min, deretter lysert i 200 ul lysebuffer (1 ml av 1 M Tris-HCl-buffer, pH 7,4, 0,2 ml 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre [EDTA], 0,5 ml 10% Triton X-100 ). Lyserte celler ble holdt ved 4 ° C i 10 minutter, og supernatanter ble inkubert med 2 ul RNase A (10 mg /ml i Tris-EDTA buffer) ved 50 ° C i 30 min, deretter med 2 ul proteinase K (10 mg /ml i destillert vann) i 45 minutter ved 50 ° C. Oppløsningen ble blandet med 5 M NaCl (20 mL) og 2-propanol (120 ul), inkubert ved 20 ° C i 24 timer, deretter sentrifugert ved 15000 rpm i 20 min. Det utfelte DNA ble oppløst i Tris-EDTA (5 ul) buffer og gjennomgikk elektroforese med 2% agarosegel og Tris-acetat-EDTA-buffer ved 50 V. DNA-fragmentering mønsteret ble visualisert ved anvendelse av en UV-transilluminator.
Hoechst 33258 Farging Analyse av Cell apoptose
Celler dyrket på glass cover-slips ble fiksert med 4% paraformaldehyde /PBS i 30 min, vasket i 15 minutter i 0,1% Triton X-100 /PBS og inkubert i mørke med Hoechst 33258 (10 ug /ml) i 15 min. Etter at dekkglass ble vasket i PBS, ble positive kjerner telles. Normale kjerner og apoptotiske kjerner (kondensert eller fragmentert kromatin) var lett skilles.
Kvantitativ Real-time PCR
Celler ble dyrket med As
2o
3 (5 pmol /L ) i 72 timer. Total RNA ble ekstrahert ved anvendelse av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri. Første cDNA ble utarbeidet med bruk av tilfeldige primere følgende instruksjonene i settet (Takara, Japan). Real-time kvantitativ PCR av AFP, STAT3 og nedstrøms gener involvert 7300 Real-time PCR System (ABI, USA) med Takara SYBR Premiks Ex Taq reagenser (Takara, Japan). Primere ble utviklet og validert av Invitrogen. Primeren informasjonen er i Tabell 1. PCR-reaksjonene ble utført i triplikat i en 20-mL volum i 2 minutter ved 94 ° C for innledende denaturering, etterfulgt av 30 sykluser ved 94 ° C i 30 sek og ved 60 ° C i 45 s. En rengjøring kontroll genet GAPDH ble brukt som en intern kontroll. Hvert primersett ble først testet for å bestemme optimale konsentrasjoner, og produktene ble kjørt på en 1% agarosegel for å bekrefte den riktige størrelse. Deretter ble ABI dissosiasjonskurve programvare som brukes til å kontrollere for flere arter i hver PCR-amplifikasjon. cDNA fra FU97 celler uten Som
2o
3 behandling ble brukt til å konstruere en standardkurve for hvert gen.
Western Blot analyse
Cell pellets ble homogenisert i utvinning -buffer (50 mmol /liter Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 150 umol /l NaCl, 100 mg /l fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mg /l aprotinin, 1% NP-40 og 0,5% natrium-ortovanadat), inkubert ved 4 ° C i 30 minutter, og sentrifugert i 20 minutter ved 12 000 g /min. Totalt protein i cellelysatet ble målt ved bruk av Bio-Rad kolorimetrisk kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For western blot-analyse, ble totalt protein separert på 10% SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembraner (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), som ble inkubert i 24 timer ved 4 ° C med antistoffene for AFP (1 :500, R D), STAT3 (1:1000), caspase 3 (1:500), BCL-2 (1:500), BAX (1:500) og GAPDH (1:1000, alt Cell signale teknologi) da pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus /kanin-IgG-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) etter en siste vask. Reaksjonene ble utviklet under anvendelse av 4-klor-1-naftol (Sigma) og H
2o
2. Signaler ble detektert ved bruk av en forbedret kjemiluminescens kit (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). GAPDH nivå var en intern standard.
Immunoassay av AFP Konsentrasjon i Overstående
Supernatanten fra FU97 celler ble samlet etter behandling med As
2o
3 eller negativ kontroll for 24, 48 og 72 h.AFP konsentrasjonen i supernatanten ble bestemt ved to-sete immunoenzymometriske assay i et TOSOH AIA system (Japan). Cut-off verdi for AFP var 10 ng /ml.
Pasienter
Vi har undersøkt data fra kirurgiske og patologiske poster for 24 pasienter med AFPGC og 24 tilfeldig utvalgte pasienter med normale nivåer av serum AFP og tilpasset AFPGC pasienter ved magekreft stadium. Pasientene hadde gjennomgått kirurgisk reseksjon ved Clinical Hospital of Shandong University, Kina, fra januar 1996 til desember 2011. AFPGC pasientene viste forhøyet serum AFP-nivå, men ingen samtidige leversykdommer. Histopatologiske nærvær av AFP positivitet ble bekreftet av immunhistokjemi. Vi kontaktet hver pasient for å bekrefte overlevelse eller dødsdato.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry involvert bruk av biotin-streptavidin-peroksidase med en Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, CA, USA). Kort sagt ble vevssnitt (4 mm) fremstilt av parafininnstøpte vevsprøver. Seksjonene ble deparaffinized med xylen etterfulgt av dehydrering i gradert alkohol. Snittene ble oppvarmet i en mikrobølgeovn i 2 minutter ved 900 W for å hente antigenet, og deretter inkubert med 0,3% H
2o
2-oppløsning i metanol i 30 minutter for å blokkere endogen peroksidase. Etter 3 vaskinger med phosphatebuffered saltvann (PBS), ble slides inkubert med 10% normalt hesteserum for å blokkere ikke-spesifikk bakgrunnsfarging, deretter inkubert med primære antistoffer kanin anti-AFP (1:100 fortynning) og anti-STAT3 (1:200) i et fuktig kammer ved 4 ° C over natten. Etter en vasking med PBS ble snittene inkubert med biotinylert heste anti-muse-antistoffer i 30 minutter, vasket 3 ganger med PBS, og inkubert med streptavidin-peroksidase konjugert i 30 min. Snittene ble visualisert ved inkubering med 3, 3′-diaminobenzidin-løsning (0,3% H
2o
2 og 0,05% 3, 3′-diaminobenzidin) og motfarget med hematoksylin. Utelatelse av det primære antistoff var en negativ kontroll. Hver kjøring inkluderte en positiv kontroll og en negativ kontroll. For den negative kontrollen, ble det primære antistoff erstattet med PBS.
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD og ble analysert ved anvendelse av SPSS v11.5 (SPSS Inc., Chicago , IL, USA). Foreningen av clinicopathologic variabler og AFP og STAT3 ble bestemt av chi-kvadrat test, og Yate korreksjon ble brukt i et lite antall prøver. Chi-kvadrat test eller tosidige Student
t
test ble brukt for å vurdere forskjeller mellom gruppene. Analyse av overlevelse involvert log-rank test, med Kaplan-Meier-kurver. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Vekst Hemming og apoptoseinduksjon i FU97 Cells av As
2o
3
FU97 celler ble behandlet med. forskjellige konsentrasjoner av As
2o
3 (1, 5 og 10 umol /l) ved 24, 48 og 72 timer. Som
2o
3 hemmet spredning av FU97 celler konsentrasjon og tid avhengig (Fig. 1a). I celler behandlet med 5 mikromol /l og 10 mikromol /l Som
2o
3 i 72 timer, den veksthemming var 56,27 ± 3,91% og 73,46 ± 4,64%, henholdsvis. DNA fragmentering er et karakteristisk trekk ved den apoptotiske prosessen. Typisk DNA fragmentering stiger ble påvist i FU97 celler behandlet med 5 mikromol /l og 10 mikromol /l Som
2o
3 (Fig. 1B). Her kan vi studere videre den morfologiske endring av apoptotisk celle. FU97 celler behandlet med 5 mikromol /l og 10 mikromol /l Som
2o
3 i 72 timer ble farget med Hoechst 33258, og observerte Under fluorescerende microscope.The Resultatene viste at As
2o
3 indusert FU97 celler apoptose i en konsentrasjonsavhengig måte, som antydet med fragmentert og kondenserte kjerner (fig. 1C). Å belyse ytterligere påvirkning av As
2o
3 på celle apoptose, ble caspase3 målt etter vestlig blot.The resultater fra Fig. 1D tydelig vist at caspase 3 protein uttrykk økt betydelig i FU97 cells.Therefore, As
2o
3 kan hemme cellevekst og induserer apoptose av AFPGC FU97 celler.
(A) Cellular veksthemming målt ved MTT-assay. Dataene er gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. (B) Agarosegel-analyse av DNA-fragmentering i FU97 celler behandlet med As2O3 i 72 timer. (C) apoptotiske kjerner farget med Hoechst 33258 viser intens fluorescens svarende til kromatin kondensering og fragmentering. (D) Western blot-analyse av caspase3 protein i totale celle ekstrakter av FU97 celler behandlet med den angitte konsentrasjon av As2O3 i 72 timer. GAPDH uttrykket servert som lasting kontroll.
hemmende effekt som
2o
3 på Uttrykk for AFP og STAT3 i FU97 Cells
For å belyse rollen til AFP og STAT3 i As
2o
3 indusert hemming av proliferasjon og apoptose, effekten av As
2o
3 på AFP og STAT3 uttrykk ble undersøkt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR og Western blot. Cellene ble behandlet med 1, 5 og 10 mikromol /l Som
2o
3 for 72 h.The mRNA og protein uttrykk for AFP og STAT3 og fosforylering av STAT3 ble signifikant nedregulert med As
2o
3 behandling på en konsentrasjonsavhengig måte (fig. 2, fig. 7).
Celler ble eksponert for As2O3 på 5 pmol /l i 72 timer. (A) Kvantitativ RT-PCR av mRNA-ekspresjon. (B) Western blot-analyse og kvantifisering av protein ekspresjon. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter med lignende resultater. * P. 0,05 sammenlignet med 0 mikromol /L
AFP Konsentrasjon Assosiert med Vekst Hemming og apoptose i FU97 cellekultursupernatant
For ytterligere å bekrefte den hemmende effekten av As
2o
3 på AFP, målte vi AFP proteinnivået i supernatanten fra FU97 celler. Som
2o
3 kan redusere AFP proteinnivå konsentrasjonsavhengig (Fig. 3, fig. 7). Dette resultat er avtalt med celleveksthemming forhold (fig. 1A), apoptose av FU97-celler (Fig. 1 B, C, D), og redusert mRNA ekspresjon av AFP og STAT3 (fig. 2A) og protein ekspresjon av AFP, STAT3 og pSTAT3 (fig. 2B).
Som
2o
3 redusert AFP proteinnivå konsentrasjonsavhengig. Dataene er representative for 3 uavhengige eksperimenter med lignende resultater. * P. 0,05 sammenlignet med 0 mikromol /L
reduserte nivåer av Stat3 målretting Genes, Bcl-2 og Bax, med As
2o
3 Behandling i FU97 Cells
for å utforske uttrykk for STAT3 targeting gener, undersøkte vi uttrykket av anti-apoptotiske Bcl-2 og pro-apoptotisk Bax i FU97 celler behandlet med As
2o
3. MRNA og protein uttrykk av Bcl-2 ble nedregulert i As
2o
3 behandlede celler (Fig. 4), men som av Bax ble oppregulert, noe som tyder på at effekten av As
2o
3 i celle apoptose ble mediert ved inhibering av konstitutivt aktivert STAT3 (fig. 7).
(A) Kvantitativ RT-PCR og (B), western blot analyse og kvantifisering av celler behandlet med As
2O
3 på 5 pmol /l i 72 timer. MRNA og protein uttrykk av Bcl-2 ble nedregulert i As
2o
3 behandlede celler, men at av Bax ble oppregulert. Alle forsøkene ble utført in triplo. *
p
. 0,05 sammenlignet med kontroll
Kliniske Kjennetegn på Selected Befolkning
Det var 34 menn (70,8%) og 14 kvinner (29,2% ) pasienter, med en median alder på 66 år (fra 45-83 år). De clinicopathological kjennetegn ved pasientene ble sammenfattet i tabell 2. Det var 48 pasienter hadde komplette oppfølgingsdata, og oppfølgingsperioden var fra 3 måneder til 60 måneder, med en gjennomsnittlig periode på 33,7 måneder. Den totale overlevelsestiden ble definert som månedene fra datoen for operasjonen til datoen for død eller tap oppfølging.
Immunhistokjemisk Expression of STAT3
Fordi vi mangler informasjon om uttrykk for STAT3 i AFPGC, bestemt vi uttrykket ved immunhistokjemisk farging av AFPGC pasientens vev. I de 24 AFPGC primære tumorer 11 var positive (46%) og 13 var negative (54%) for STAT3 ekspresjon. I de 24 AFP-negative magekreft prøver, 8 (33%) primære svulster var positive og 16 (67%) var negative for STAT3 ekspresjon. Dessuten, til tross for det relativt lave antall pasienter med komplette data, STAT3 overekspresjon var signifikant assosiert med dybden av invasjon og lymfeknutemetastase (p 0,05). I AFP-positive og -negative grupper (Fig 5, tabell 2, figur . 7).
(A) farging for AFP. (B) Sterk STAT3 farging med brune granulære innskudd i cytoplasma og kjerner. (C) Negativ kontroll immunhistokjemisk farging for AFP. (D) Negativ kontroll immunhistokjemisk farging for STAT3.
Uttrykk for AFP og STAT3 assosiert med dårlig prognose av magekreft
Median overlevelse av AFP-positive pasienter var 23 måneder ( 95% konfidensintervall, 16-30 måneder). som var betydelig kortere enn i AFP-negative pasienter, 53 måneder (95% konfidensintervall, 47-59 måneder) (P 0,05) sikret median overlevelse tid i STAT3-positive gruppen var 38 måneder (95% konfidensintervall , 29-47 måneder), som var vesentlig kortere enn i STAT3-negative gruppe, 54 måneder (95% konfidensintervall, 47-61 måneder) (P . 0.05, figur 6A og B, figur 7) .Furthermore. , overlevelse var lavere for AFP og Stat3 dobbel-positive pasienter enn med uttrykk av AFP eller STAT3 alene (P 0,05, fig 6C og D, figur 7..). Hos pasienter med AFP og STAT3 dobbelt positivt uttrykk median overlevelse var 22 måneder (95% konfidensintervall 11-33 måneder). Til sammenligning hos pasienter med enkelt uttrykk av AFP eller STAT3, median overlevelse var 54 måneder (95% konfidensintervall 44-64 måneder) og 59 måneder (95% konfidensintervall 47-71 måneder).
(A) AFP positivitet alene. (B) STAT3 positivitet alene. (C) AFP og STAT3 dobbel positivitet i forhold til AFP positivitet. (D) AFP og STAT3 dobbel positivitet sammenlignet med STAT3 positivitet (alle P 0,05).
inaktivering av ATBF1 genet i AFPGC, gjennom mutasjon eller redusert uttrykk, kan tillate AFPGC celler til å produsere AFP protein og overuttrykker STAT3, noe som bidrar til aggressiv oppførsel og dårlig prognose av AFPGC. As2O3 kan hemme AFPGC cellevekst og induserer celleapoptose. De underliggende mekanismene kan medføre nedregulering av AFP og STAT3 uttrykk og STAT3 downregulating uttrykk for anti-apoptotiske Bcl-2 og oppregulering at av svulsten suppressor Bax. Videre kan AFP dimerisere med andre proteiner, slik som nukleære reseptorer, transkripsjonsfaktorer og kaspaser, som alle kan fremme veksten av kreftceller. AFP kan dimerisere med transkripsjonsfaktor STAT3 for å fremme vekst AFPGC. Derfor kan AFP samhandle med STAT3 i signalveien for kjemoterapeutisk effektivitet av agenter på AFPGC.
Diskusjoner
AFPGC har vært vanskelig å behandle hovedsakelig på grunn av tilbøyelighet for metastasering og motstand på konvensjonell terapi. Alternative behandlingsformer spesifikt adresserer disse problemene er sterkt behov. Som
2o
3 har blitt brukt i kliniske studier med APL i mange år, og 10 mg /dag som
2o
3 ble funnet effektive i å indusere komplett remisjon hos pasienter med nylig diagnostisert og residiverende APL [ ,,,0],33]. Som
2o
3 inhiberte celleproliferasjon og apoptose av humane leverkreft cellelinje HepG2 [34], som ble ytterligere understøttet av en klinisk studie som viser som
2o
3 for å være effektiv og sikker for pasienter med fremskreden primær carcinoma i leveren [35], giftigheten var mild og serum-AFP-nivået ble redusert. Derfor har vi undersøkt om Som
2o
3 også indusert hemming av cellevekst og apoptose av hepatoid adenokarsinom i magen AFPGC FU97 celler og funnet antitumor egenskaper som
2o
3 i AFPGC celler.
Vi gir bevis for at As
2o
3 har en sterk anti-proliferativ effekt på FU97 celler i en konsentrasjon og tidsavhengig måte. Plasmanivået av arsen i den kliniske behandlingen av akutt promyelocytic leukemi kan nå 5.5 til 7.3 mm [36]. I vår studie, alle resultatene viste at 5 mikromol /l Som
2o
3 effektivt hemmet spredning og indusert celle apoptose på 72 timer. Denne dosering er klinisk relevante, noe som antyder at AFPGC celler er følsomme overfor As
2o
3.
AFPGC, som representert ved produksjon av AFP, utviser høyere proliferativ aktivitet, svakere apoptose, og rikere neovascularization enn AFP-negative mage kreft. På den annen side, er høye nivåer av AFP i fullt utviklet hepatokarsinom eller i serum fra verts assosiert med mer aggressiv atferd, og økt anaplasia [37], [38]. Studier av AFP knockdown etter siRNA funnet hemmet celleproliferasjon i hepatomas [39]. Derfor kan AFP fungere i et grunnleggende trinn i progresjonen av AFP-positiv kreft. Nedregulering av AFP uttrykk kan representere en relevant terapeutisk strategi. Vi fant at As
2o
3 kan nedregulere AFP mRNA og protein uttrykk. Også nedregulering av AFP etter As
2o
3 kan hemme celledeling og indusere celle apoptose i AFPGC FU97 celler. Videre AFP sekresjon i As
2o
3-behandlede celler var dose- og tidsavhengig redusert i supernatanten. Nedregulering av AFP uttrykk kan bidra til As
2o
3-indusert hemming av cellevekst og apoptose. Dermed disse data indikerte at AFP uttrykk er nedregulert i respons til As
2o
3 behandling. AFP kan spille en viktig rolle i spredning og apoptose av AFPGC.
I tillegg til å være et poeng av konvergens for mange onkogene signalveier, STAT3 deltar også i cellevekst og overlevelse. I leukemiceller, som
2o
3 aktiviserer mange intracellulære signaloverføringsveier, noe som resulterer i induksjon av apoptose [40]. Som
2o
3 hemming av STAT3, før inhibering av cellulær proliferasjon, er blitt beskrevet i multiple myelom-celler [41]. Også, som
2o
3 hemmer protein tyrosin kinase, dermed indirekte redusere aktivering av STAT proteiner [42] .Derfor, nedregulering av STAT3 har vært regnet som en av de virkningsmekanismer av As
2o
3 i akutt promyelocytic leukemi (APL) .Vi fant STAT3 aktivert i AFPGC celler, og som
2o
3 kan nedregulere STAT3 mRNA uttrykk og STAT3 og pSTAT3 protein uttrykk. Spesielt downregulated uttrykk for STAT3 og pSTAT3 var i samsvar med downregulated uttrykk for AFP ved As
2o
3. STAT3 kan bli hemmet av noen faktor i løpet av sin aktivering i respons til As
2o
3. i AFPGC. Uavhengig av de mulige mekanismene som er involvert i reguleringen av STAT3, kan den høye AFP uttrykk i AFPGC har viktige implikasjoner. Tidligere studier har også vist at AFP kan dimerisere med andre proteiner, slik som nukleære reseptorer (dvs. retinsyre-reseptor), transkripsjonsfaktorer og kaspaser, som alle kan fremme veksten av kreftceller [43], [44]. Dette i sin tur har ført til spekulasjoner om at AFP kan dimerisere med transkripsjon faktorer STAT3 å fremme AFPGC vekst. Videre undersøkelser av reguleringen av STAT3 uttrykk knyttet til AFP er nødvendig.
STAT3 kan indusere celle apoptose av transcriptionally downregulating BCL-2 uttrykk [45]. Bcl-2 er et oppstrøms effektor-molekyl i den apoptotiske reaksjonsvei og en potent suppressor av apoptose. Det kan oligomerisere Bax, som deretter depolariserer det mitokondriemembranen potensial til å frigjøre cytokrom c og indusere apoptose [46]. Forholdet av Bcl-2 til Bax er viktig for å bestemme om cellene vil gjennomgå apoptose eller overlevelse. Vi fant redusert uttrykk av Bcl-2 sammen med hemmet STAT3 uttrykk med As
2o
3 behandling i AFPGC celler. I motsetning til dette ble ekspresjonen av Bax økt. Sammen med funn i andre cellesystemer, hvor hemmet STAT3 nivået ble funnet å redusere BCL-2 uttrykk og indusere apoptose [45], den som
2o
3-induserte effekter vi funnet kan være mediert av hemming av konstitutivt aktivert STAT3.
for ytterligere å demonstrere om STAT3 spiller en nøkkelrolle i AFPGC, undersøkte vi AFPGC pasienter i form av STAT3 uttrykk. STAT3 positivitet i AFP-positive svulster var 46% og i AFP-negative tumorer 33%. Pasienter med AFPGC hadde en høyere rate av STAT3 uttrykk, men ikke signifikant kanskje på grunn av et lite antall pasienter. Men STAT3-positive uttrykk var assosiert med kreft vev, dybden av invasjonen og lymfeknutemetastase i AFPGC. Klinisk pasienter med AFPGC har dårlig prognose [1], [9], [10]. Vi bekreftet at prognosen var verre for pasienter med enn uten AFP som samsvarte med kreft stadium. Videre overlevelsen av pasienter med både AFP og STAT3 positivitet var betydelig dårligere enn de med AFP eller STAT3 positivitet alene. Derfor, i denne spesifikke type av magekreft, synes STAT3 for å ha en viktig rolle i celle-overlevelse og proliferasjon. STAT3 uttrykk i AFPGC kan forklare klinisk aggressiv atferd AFPGC, og STAT3 uttrykk kan være en nyttig progresjon indikator, hvis validert av omfattende prospektive studier i større kohorter. Nedregulering av AFP og STAT3 uttrykk kan representere en relevant terapeutisk strategi i AFPGC. Når det gjelder forholdet mellom AFP produksjon og STAT3 uttrykk, er det ikke tilgjengelig rapport som beskriver de underliggende mekanismer for å date.It er blitt rapportert at AFP-ekspresjon i magekreft er på grunn av mangel av transkripsjonsfaktoren ATBF1 [47]. I tillegg ATBF1, som en tumor suppressor gen, enhancesthe undertrykkelse av STAT3 signalering ved interaksjon med PIAS3 [48] .Derfor, er det rimelig å tenke at inaktivering av ATBF1 genet i AFPGC, gjennom mutasjon eller redusert uttrykk, kan tillate AFPGC celler til å produsere AFP protein og overexpres STAT3. For å klargjøre hvilke faktorer som er involvert i AFP produksjon og STAT3 uttrykk, er videre studier er nødvendig.
I konklusjonen, som
2o
3 kan hemme AFPGC cellelinje FU97 vekst og indusere apoptose. De mulige mekanismer relatert til nedregulering av AFP og STAT3 og STAT3 rettet mot anti-apoptotiske genet Bcl-2 og oppregulering tumor suppressor genet Bax (Fig. 7). Ekspresjonen av STAT3 i AFPGC spiller en viktig rolle i tumorinvasjon og prognose. Som
2o
3 kan være en mulig ny adjuvant stoffet i behandling av AFPGC. Denne studien gir noen teoretisk grunnlag for klinisk bruk verdig videre studier.
