Abstract
For å teste hypotesen om at samtidig målretting av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) og transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) kan tilby en roman terapeutisk tilnærming i kreft i bukspyttkjertelen, ble EGFR stanse av RNA interferens (shEGFR) kombinert med TGF-β håndtering av oppløselig TGF-β reseptor II (sTβRII). Effekter på kolonidannelse i tre-dimensjonal kultur, tumordannelse i nakne mus, og nedstrøms signalisering ble overvåket. I både ASPC-en og T3M4 celler, enten shEGFR eller sTβRII betydelig hemmet kolonidannelse. Men i ASPC-1 celler, som kombinerer shEGFR med sTβRII redusert kolonidannelse mer effektivt enn både tilnærming alene, mens i T3M4 celler, shEGFR hemming av kolonidannelse ble reversert av sTβRII. Tilsvarende
in vivo
vekst av ASPC-1-stammer svulster ble svekket av enten shEGFR eller sTβRII, og ble markert undertrykt av begge vektorer. I motsetning T3M4-deriverte svulster enten ikke klarte å danne eller var veldig liten når EGFR alene ble stille, og disse effektene ble reversert av sTβRII grunn av økt kreftcellevekst. Kombinasjonen av shEGFR og sTβRII redusert fosfor-HER2, fosfor-HER3, phoshpo-ERK og fosfor-src (Tyr416) nivåer i ASPC-1 celler, men økte nivåer i T3M4 celler. Videre hemming av både EGFR og HER2 av lapatinib eller src av SSKI-606, PP2, eller dasatinib, blokkerte sTβRII-mediert antagonisme av kolonidannelse i T3M4 celler. Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at samtidig rettet mot EGFR, TGF-β, og src kan utgjøre en roman terapeutisk tilnærming i PDAC som hindrer skadelig krysstale mellom EGFR familiemedlemmer og TGF-β-avhengige veier
Citation.: Deharvengt S, Marmarelis M, Korc M (2012) Samtidig målretting av EGF reseptor, TGF-beta og Src poeng til en roman terapeutisk tilnærming i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (6): e39684. doi: 10,1371 /journal.pone.0039684
Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA
mottatt: 24 april 2012; Godkjent: 29 mai 2012; Publisert: 27 juni 2012
Copyright: © 2012 Deharvengt et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute (NCI) gi CA-R37-075059 (MK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødelighet i USA, med en 5-års overlevelse på 6% [1]. Disse dystre statistikken skyldes delvis til avansert stadium av kreft ved presentasjon, en lav sats av resectability, flere molekylære endringer som fremmer kreft i bukspyttkjertelen cellevekst og overlevelse, merket chemoresistance og intens desmoplasia som demper stoffet penetrasjon [2] – [5]. PDAC er forbundet med en høy frekvens av mutasjoner i K-
ras-onkogen
(95%) og P16 (85%), p53 (75%) og SMAD4 (55%) tumorsuppressorgener [4 ]. Dessuten, når p16-genet ikke er mutert, er det epigenetiske stilnet [6]. Det er også forhøyet ekspresjon av epidermal vekstfaktor (EGF) reseptor (EGFR), andre tyrosinkinase-reseptorer og deres ligander, og transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) isoformer [7]. EGFR medierer celle-autonome mitogen og motogenic signalkaskader ved å aktivere forskjellige veier, inkludert mitogen aktivert proteinkinase (MAPK), p38 MAPK, og juni kinase (JNK), mens TGF-β aktiverer Smad avhengig og signale-uavhengig, og antas å utøve parakrine effekter på celler i tumoren mircroenvironment i PDAC [8] – [10].
Overdreven EGFR-aktivering og dysfunksjonell signalisering av TGF-β reseptor (TβR) -avhengige veier, som observert i PDAC genererer multiple avvikende autokrine og parakrine interaksjoner mellom kreftceller og svulsten mikromiljøet som bidrar til tumor desmoplasia og som kan krysser med en eller annen av de tolv signaleringskaskader som er implisert i de fleste PDACs [5], [11]. Skuffende, rettet mot EGFR forlenger bare litt overlevelsen av pasienter med PDAC, og bare når det gis i kombinasjon med gemcitabin [12], mens anti-TGF-beta terapi for PDAC er under utvikling og testet i prekliniske studier [13] – [15].
Vi har nylig etablert en tre-dimensjonale kultursystem hvor cellene er innleiret i Matrigel bestående av 3% collagen IV /laminin-anriket geléaktige medium og plassert over et størknet lag av myk agar [16] . Vi har fastslått at samtidig behandling med TGF-β1 og EGF forbedret vekst i denne 3-D-modellen system i større grad enn hver av vekstfaktor alene, og overdratt øket chemoresistance for cytotoksiske forbindelser [16]. Videre farmakologisk inhibering av TβRI med SB431542 eller EGFR med erlotinib forbedret effekten av gemcitabin og cisplatin i humane kreft i bukspyttkjertelen celler og i primære cellekulturer etablert fra pankreata av genetisk modifiserte musemodeller av PDAC [16], og understreker at nytten av dette tre -D kultursystem for å teste effekten av terapeutiske midler.
i lys av viktigheten av EGFR og TGF-β i PDAC, søkte vi å teste hypotesen om at målretting begge veier kan utøve fordelaktige vekstundertrykkende effekter som er større enn undertrykke enten svei alene. Fordi små molekyl hemmere som er rettet mot EGFR og TβRI kan utøve ikke-spesifikke effekter og /eller kan målrette nært beslektede kinaser, brukte vi en mer spesifikk tilnærming som består av en lyddemping strategi for å undertrykke EGFR uttrykk og en løselig TβRII strategi for å beslaglegge TGF-β ligander . Vi rapporterer nå at samtidig undertrykkelse av begge baner som trekkes kolonidannelse av ASPC-1 humane kreft i bukspyttkjertelen celler dyrket i 3-D kultur og tumorvekst
in vivo
, men rettet mot TGF-β reversert vekst-inhiberende virkninger som utøves av EGFR stanse i T3M4 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler, og denne reverseringen skjedde i forbindelse med src aktivering som reflekteres av økt src fosforylering på tyrosin 419.
Resultater
Effekter av EGFR knockdown og sTβRII Expression på kolonidannelse
menneske~~POS=TRUNC uttrykker transformerende vekstfaktor alfa (TGF-α) og andre vekstfaktorer som aktiverer EGFR [17] – [19], så vel som alle de tre TGF-B [20]. For å avgjøre om abrogere EGFR og TGF-β signale modulert veksten av slike cellelinjer, ASPC-en og T3M4 celler ble ko-infisert med en m.o.i. av 10 for hvert virus med shRNA-lentivirus målretting Luciferase (shLuc-LV med pWPT-GFP), EGFR (shEGFR-LV med pWPT-GFP), sTβRII (hLuc-LV med pWPT-sTβRII), eller både EGFR og sTβRII (shEGFR -LV med pWPT-sTβRII). shEGFR-LV undertrykte effektivt EGFR-nivåer, mens pWPT-sTβRII ekspresjon var assosiert med nærvær av rikelige nivåer av sTβRII protein i mediet i alle fire cellelinjer (Fig. 1A).
(A) ASPC-1 og T3M4 menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler ble infisert med shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), eller begge shEGFR og sTβRII. Cellelysater og kondisjonert medium ble deretter utsatt for immunblotting med anti-EGFR og anti-HA-tag antistoff, henholdsvis, den sistnevnte tjener til å bekrefte sTβRII frigivelse av kreftcellene. Et anti-ERK-antistoff servert å vurdere kjørefelt lasting. (B) Konsekvensene av EGFR støydempere med shEGFR og TGF-β håndtering med sTβRII ble vurdert ved å måle kolonidannelse i 3-D kultur (B). Dataene er gjennomsnitt ± SE av tre bestemmelser fra tre uavhengige forsøk. * P 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med de respektive kontroller
Konsekvensene av EGFR lyddemping og TGF-β håndtering ble vurdert ved siden av å overvåke kolonidannelse i et 3-D kultur-analyse. hvor Matrigel gir en acellulær stillas og myk agar støtter forankringsuavhengig vekst [16]. Vi valgte å bruke dette 3-D-modellen system, siden vi tidligere har vist at samtidig behandling med TGF-β1 og EGF i denne modellen forøkt vekst i større grad enn hver av vekstfaktor alene [16], for derved å rekapitulere TGF-β tumor fremme effekter tidligere demonstrert i xenograft og orthotopic musemodeller av PDAC [13] – [14]. formasjon koloni med ASPC-1 celler infisert med pWPT-sTβRII eller shEGFR-LV ble redusert med 21% (p 0,05) og 33% (p 0,01), henholdsvis, mens infeksjon med både shEGFR-LV og pWPT-sTβRII resulterte i en 56% (p 0,01) reduksjon i antall koloni ved sammenligning med shLuc-uttrykkende ASPC-1-celler (figur 1B.). I motsetning til etter infeksjon med shEGFR-LV, ble kolonidannelse ved T3M4 celler ble redusert med 45% (p 0,05), mens pWPT-sTβRII svekket kolonidannelse i T3M4 celler med 27% (p 0,05). Men pWPT-sTβRII helt snudd hemmende handlinger shEGFR-LV på kolonidannelse (Fig. 1B). Dermed ASPC-1 celler utstilt synergi hemmende effekt på kolonidannelse når infisert med både shEGFR-LV og pWPT-sTβRII, mens i T3M4 celler var det paradoksalt reversering av pWPT-sTβRII av de hemmende handlinger shEGFR-LV.
For å finne ut om andre kreft i bukspyttkjertelen celle foret som oppfører seg som T3M4 celler, vi neste utførte kolonidannende analysen beskrevet i Colo-357 og PANC-en kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. S1). Colo-357 celler var bare vekst hemmes som følge av samtidig EGFR knockdown og sTβRII uttrykk. I motsetning PANC-1-celler ble hemmet vekst av EGFR knockdown, men oppviste en reversering av denne veksthemmende virkning i nærvær av sTβRII (fig. S1).
In vivo virkninger av EGFR knockdown og sTβRII Expression
Vi neste undersøkt konsekvensene av EGFR taushet sTβRII uttrykk i en subkutan naken mus tumor modell, for å avgjøre om den paradoksale reversering av EGFR lyddemping observert i 3-D
in vitro
modellen også skjedd
in vivo
. Sammenlignet med svulster som genereres av ASPC-1 celler infisert med shLuc-LV, ble svulstvolum på dag 24 ble redusert med 36% (p 0,05) med shEGFR-LV, 38% (p 0,05) med pWPT-sTβRII, og 85% (p 0,01) med begge vektorer (figur 2A.). Videre 2 av 8 mus injisert med pWPT-sTβRII-uttrykke ASPC-1 celler ble tumor-fri. Dramatisk, 4 av 8 mus injisert med ASPC-1-celler som uttrykker både pWPT-sTβRII og shEGFR-LV var tumorfrie på dag 24, og de resterende 4 svulstene ble eneste synlige 21 dager etter injeksjon av kreftceller. I tilfelle av T3M4-avledede tumorer, ble forsøkene ble avsluttet på dag 16 på grunn av rask tumorvekst i to av de fire gruppene. På dette tidspunkt ble tumorvolumet redusert med 37% (p 0,05) for celler infisert med pWPT-sTβRII og med 97% (p 0,01) for shEGFR-LV-infiserte celler (Fig. 2B). I motsetning T3M4 celler infisert med både pWPT-sTβRII og shEGFR-LV dannet store tumorer, som hver viste områder med nekrose (Fig. 2B).
ASPC-1 (A) og (B) T3M4 celler ble infisert med shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), sTβRII, eller begge EGFR-LV og sTβRII, og injisert subkutant (én injeksjon per mus) i flanken regionen nakne mus. Tumorvolumer ble overvåket i det angitte antall dager. Verdiene er gjennomsnitt ± SEM av 8 mus per gruppe, er angitt i nevneren til høyre for hver kurve. Antallet av svulster som ble dannet i hver gruppe er angitt i telleren. * P 0,05, og ** p. 0,01, sammenlignet med respektive kontroller
Svulster som oppstår enten ASPC-en eller T3M4 celler utstilt rikelig Ki-67 immunoreaktivitets og områder med CD-31- positive endotelialceller (fig. 3A). I ASPC-1-avledede tumorer, ble ekspresjon av pWPT-sTβRII ikke forandre spredning, mens ekspresjon av shEGFR-LV var assosiert med en 60% (p 0,05) reduksjon i både Ki-67 og CD31 immunoreaktivitet, og ekspresjon av begge vektorer forårsaket en ytterligere reduksjon i Ki-67 (72%, p 0,01) og CD31 (76%, p 0,01) immunoreaktivitet (fig. 3A). I T3M4 celler, ble ekspresjon av pWPT-sTβRII assosiert med redusert spredning (40%, p 0,01) og angiogenese (77%, p 0,01), ekspresjon av shEGFR-LV forandret ikke vesentlig spredning, men merkbart redusert CD31 immunreaktivitet (71 %, p 0,01), mens ekspresjonen av begge vektorer markert øket kreftcelle proliferasjon (196%, p 0,01) til tross for en vedvarende reduksjon (85%, p .. 0,01) i CD31 immunoreaktivitet (figur 3A)
A. De ASPC-1- og T3M4-avledede tumorer som er beskrevet i figur 2, ble immunfarget for Ki67 å vurdere proliferasjon og CD31 å vurdere angiogenese. B. De samme svulstene ble scoret for TUNEL-poisitive celler og spaltet PARP immunoreaktivitets å vurdere apoptose. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre bestemmelser fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01, sammenlignet med de respektive kontroller
I lys av nærværet av områder med nekrose i T3M4 tumorer som uttrykker både pWPT-sTβRII og shEGFR-LV, den. var viktig å unngå falske resultater som kan oppstå i områder om å gjennomgå nekrose. Derfor ble både TUNEL-analysen og spaltet PARP immunofarging utføres ved å vurdere apoptose, begge metoder som ga generelt samstemmige resultater (fig. 3B). Således pWPT-sTβRII ikke vesentlig endre prosentandelen av celler som gjennomgår apoptose i enten ASPC-1 eller T3M4-drived tumorer, mens shEGFR-LV ekspresjon var assosiert med en markert økning i apoptose i ASPC-1-celler (p 0,01), men ikke i T3M4 celler. Videre, i ASPC-en-deriverte svulster, pWPT-sTβRII endret ikke shEGFR-LV-forbundet apoptose, men i T3M4-deriverte svulster det var forbundet med økt apoptose (fig. 3B).
Effekter av EGFR knockdown og sTβRII Expression på Fosforylering State of EGFR familiemedlemmer
EGFR, HER2 og HER3 har alle vært innblandet i patobiologi av PDAC [7], [21] – [23]. Siden EGFR danner heterodimerer med HER2 og HER3, var det viktig å finne ut om sin taushet kan modulere signalering av disse EGFR familiemedlemmer. Derfor ble ASPC-1 og T3M4 cellelysater kastes immunblotting for å vurdere nivået av fosfo-HER2, HER3 og fosfo-(Fig. 4A). Densitometrisk analyse av data fra tre forsøk viste at pWPT-sTβRII ekspresjon i ASPC-1 celler induserte en nedgang i fosfo-HER2 og fosfo-HER3 nivåer, henholdsvis (p 0,05) 17% og 20%, mens EGFR knockdown induserte en 61% reduksjon i fosfo-HER2-nivåer (p 0,01) og en 30% reduksjon i fosfo-HER3 (p 0,01) nivåer. ASPC-1-celler som uttrykker både shEGFR-LV og pWPT-sTβRII oppviste en lignende nedgang i fosfo-HER2-nivåer (52%, p 0,01), men en mer uttalt reduksjon i fosfo-HER3 nivåer (56%, p 0,01). I motsetning i T3M4 celler, pWPT-sTβRII endret ikke fosfo-HER2 eller fosfo-HER3 nivåer, mens EGFR knockdown var forbundet med økte nivåer av både fosfo-reseptorer (Fig. 4A). I tre eksperimenter, var der en 60% økning i fosfo-HER2 og fosfo-HER3 nivåer i T3M4 celler etter EGFR knockdown, og 100% og 80% økning i fosfo-HER2 og fosfo-HER3 nivåer, henholdsvis, i celler som uttrykker begge vektorer .
(A) Påvirkning av reseptor fosforylering. ASPC-en og T3M4 celler ble infisert som indikert med shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), eller begge shEGFR og sTβRII. Cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer rettet mot de indikerte reseptorer og fosfo-reseptorer. (B) Celler ble infisert som angitt i A, og cellelysater ble utsatt for immunblotting med antistoffer rettet mot de angitte proteiner og fosfo-proteiner. Hvert panel viser data fra en representative for minst to uavhengige eksperimenter. I begge paneler A og B, immnoblotting med et anti-ERK-antistoff bekreftet tilsvarende kjørefelt lasting, men ikke alle ERK blotter vises.
For å avgjøre om HER2 og HER3 fosforylering ble også modulert
i vivo
i T3M4 celler, tumorer avledet fra disse cellene ble evaluert ved immunohistochemsitry (fig. S2). Moderat fosfor-HER2 immunoreaktivitets var tydelig i svulster fra celler infisert med shLuc, og shEGFR-LV, som ble nedsatt i tumorer infisert med pWPT-sTβRII, men økte i tumorer uttrykker begge vektorer. I motsetning fosfor-HER3 immunoreaktivitets var lav i svulster fra shLuc-infiserte T3M4 celler, noe økt i pWPT-sTβRII-uttrykke svulster, moderat økt i shEGFR-LV-uttrykker svulster, og markert økning i tumorer uttrykker begge vektorer (fig. S2 ). Dermed er både HER2 og HER3 abnormt aktivert
in vivo
i T3M4 celler når både EGFR og TGF-beta veier har blitt rettet.
Effekter av EGFR knockdown og sTβRII Expression på Nedstrøms Signa
ERK, src, og AKT er mitogen og pro-overlevelse signale moduler som er nedstrøms av EGFR familiemedlemmer, og som bidrar til PDAC progresjon [12], [24]. Derfor ASPC-en og T3M4 cellelysater ble utsatt for immunblot å vurdere virkningene av EGFR knockdown og sTβRII uttrykk på disse banene (Fig. 4B). I ASPC-1-celler, shEGFR-LV, pWPT-sTβRII, og deres kombinasjon var forbundet med svekkede fosfo-ERK nivåer, men bare kombinasjonen reduserte fosfo-AKT nivåer, mens ingen av disse transfeksjonsteknikker tilstander som er indusert i de-fosforylering av Src (Tyr527 ), som ville være representative for src aktivering (fig. 4B). I motsetning i T3M4 celler, shEGFR-LV alene eller i kombinasjon med pWPT-sTβRII resulterte i økt fosfo-ERK og redusert fosfo-src (Tyr527) nivåer, uten noen endringer i fosfo-AKT nivåer (Fig. 4B).
for å bekrefte at kombinasjonen av shEGFR-LV og pWPT-sTβRII aktivert src i T3M4 celler, ble lysatene også utsatt for en fosfor-kinase antistoff array. EGFR lyddemping førte til inhibering av fosforylering av src (Tyr419), Fyn, HCK, Lyn, Yes og FGR, som var spesielt tydelig med hensyn til src (fig. 5). I motsetning til ekspresjonen av sTβRII hemmet fosforylering av Lyn Ja, og FGR, uten å endre src, Fyn eller HCK fosforylering (fig. 5). Men de inhiberende virkninger av shEGFR-LV for alle 6-kinaser ble fullstendig reversert av sTβRII (fig. 5), noe som indikerer at ekspresjon av sTβRII reaktivert Src-familie kinaser.
T3M4-celler ble infisert med shLuc-LV (shLuc ), shEGFR-LV (shEGFR), og /eller WPT-sTβRII (sTβRII) som angitt. Cellelysatene ble så analysert med et fosfo-kinase-antistoff matrise for å vurdere status fosforylering av de angitte src familiemedlemmer. Resultatene ble kvantifisert som beskrevet i Metoder. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre bestemmelser fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01, og *** p 0,001 sammenlignet med kontroll
Effekter av HER2 taushet src Hemming på Colony Dannelse i T3M4 Cells
Vi neste søkt å vurdere rollen til HER2 ved formidling av de skadelige effekter av samtidig rettet mot EGFR og TGF-β. Som forventet, shEGFR-LV markert undertrykket EGFR-nivåer i T3M4 celler, shHER2-LV markert undertrykket HER2-nivåer, mens infeksjon med begge vektorer stilnet ekspresjon av både EGFR og HER2 (fig. S3). Videre T3M4 celler som uttrykker enten shEGFR-LV eller shHER2-LV viste en betydelig nedgang i kolonitall i den 3-D-analysen (fig. 6A). I tilfelle av shEGFR-LV, men ikke shHER2-LV eller shEGFR-LV sammen med shHER2-LV, ble denne effekten reverseres ved pWPT-sTβRII (Fig. 6A). Dermed samtidig infeksjon med shEGFR-LV og shHER2-LV markert hemmet kolonivekst (66%, p 0,01). Tilsvarende lapatinib (1 mm), en dobbel tyrosinkinasehemmer som avbryter HER2 og EGFR-signalveier, redusert koloni antall med 47% (p 0,01) og hindret tilbakeføring sett etter samtidig infeksjon med shEGFR-LV og pWPT-sTβRII ( fig. 6).
A. HER2 lyddemping og hemming. T3M4 celler ble infisert med shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), shHER2-LV (shHER2), eller begge shEGFR og shHER2, i fravær eller nærvær av WPT-sTβRII (sTβRII) eller 1fiM lapatinip. Kolonidannelse ble overvåket i 3-D-kultur. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av tre bestemmelser fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p 0,01, sammenlignet med kontroll. B. Effekt av c-Src-inhibering. T3M4 cellene ble inkubert i fravær eller nærvær av de src kinase inhibitorer SKI-606 (1 uM), PP2 (1 uM) og dasatinib (100 nM), og virkninger på kolonidannelse i 3-D kultur ble bestemt. Dataene er gjennomsnitt ± SE av tre bestemmelser fra tre uavhengige forsøk. * P 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med de respektive kontroller
I lys av det opp-regulering av fosfo-src (Tyr419) og defosforylering av Src (Tyr527) av den. kombinasjonen av shEGFR-LV og pWPT-sTβRII i T3M4 celler, søkte vi å finne ut om de skadelige virkningene av denne kombinasjonen kan være mediert av aktivert src. Derfor ble effekten av tre forskjellige src inhibitorer for kolonidannelse i 3-D kulturen undersøkt neste. Bare dasatinib (100 nM) i betydelig grad hemmet veksten av T3M4 celler infisert med shLuc-LV (fig. 6B). Men SKI-606 (1 mm), PP2 (1 mm), og dasatinib (100 nM) fullstendig blokkert pWPT-sTβRII-mediert reversering av shEGFR-LV-indusert veksthemming (Fig. 6B), noe som indikerer at denne effekten var avhengig av src kinase-aktivitet.
diskusjon
medlemmer av EGF-familien, inkludert TGF-α, heparin-bindende EGF-lignende vekstfaktor (HB-EGF), betacellulin, og amfiregulin, er uttrykt ved høye nivåer i PDAC og handle på kreftceller i PDAC og på tilstøtende stromal elementer [7]. EGFR aktivering av disse ligandene initierer flere signaleringskaskader, som for eksempel Ras /Raf /MAPK og Rac /JNK /MAPK-p38 [24]. EGFR heterodimerisering med andre medlemmer av EGFR familien fører til aktivering av andre signalveier som inkluderer Src, Raf1, B-Raf, Crk, og Nck, noe som ytterligere fremmer tumorprogresjon og biologiske aggressivitet [25]. EGFR krysstale med flere baner forsterkes av den høye frekvensen av Kras og Smad4 mutasjoner, og ved overflod av TGF-β som endrer den ekstracellulære matriks på en måte som fremmer kreftcellevekst, induserer avvik epiteliale-mesenchymale interaksjoner, forbedrer angiogenese, og fremmer metastase [4] – [7], [10], [13] – [14], [26] – [27]. Videre synergizes TGF-β med EGF for å fremme proliferasjon i 3-D kultur [16]. Sammen utgjør disse observasjonene tyder på at avvikende EGFR og TGF-β-avhengige signalveier er sentrale virkemidler for å fremme kreft i bukspyttkjertelen progresjon og kan representere viktige terapeutiske mål i PDAC.
I denne studien viste vi at lentiviral basert stanse av EGFR effektivt dempes dets pro-mitogene handlinger i 3 av 4 bukspyttkjertelcancercellelinjer, og at lentiviral basert lagring av TGF-β også svekkede spredning i 3-D kultur i de samme tre cellelinjer. Men i ASPC-1 og Colo-357 celler, samtidig støydempere EGFR og sekvestrerende TGF-β resulterte i forbedret veksthemming, mens i T3M4 og PANC-1-celler var det nesten fullstendig reversering av vekstundertrykkende effekter av EGFR ned-regulering . Under standard dyrkningsbetingelser vev, ASPC-1 og T3M4 cellene er resistente mot TGF-β-formidlet vekstinhibering, mens COLO-357 og PANC-1-celler er vekst-inhibert av TGF-β [19], [28]. Således kan den observerte paradoksale reversering ikke tilskrives forskjeller i vekst-hemmende respons av kreftceller. I stedet, i T3M4 celler, er denne reversering skyldes delvis, til den opp-regulering av fosfo-HER2 og fosfo-HER3 fremkalt ved EGFR nedregulering og forbedret i nærvær av sTβRII. Etter avtale med denne konklusjonen, ble veksthemmende effekter indusert av stanse HER2 eller begge EGFR og HER2 ikke reverseres ved sTβRII. Tilsvarende lapatinib, som hemmer både EGFR og HER2-kinase-aktivitet, også hemmet veksten av T3M4 celler, og denne effekten var resistent mot sTβRII-mediert reversering. ERK kan aktiveres av flere oppstrøms-signaler, og øket HER2 /3-fosforylering i T3M4-celler ble forbundet i den foreliggende studie med økt fosforylasjon ERK, noe som indikerer at HER2 /3 nedstrøms signalisering ble også aktivert.
Flere linjer av bevis tyder på at src aktivering mediert av TGF-β håndtering er også avgjørende for reversering fenomen. Først src hemming av EGFR lyddemping ble fullstendig reversert av TGF-β håndtering. Sekund, EGFR signale kjent for å aktivere src [29], og src aktivering er kjent for å indusere frigjøring av forløperne for EGF-lignende ligander [6] og dempe EGF internalisering [29], [30]. Disse mekanismene kan fremme EGFR heterodimerisering med HER2 og HER3, og dermed ytterligere styrking mitogen signalisering. Tredje, økt sTβRII nivåene av src fosforylering på tyrosin rest 419 i T3M4, og fosforylering på dette nettstedet korrelerer med økt src aktivitet. Videre sTβRII ikke endre fosforylering av Src (Tyr527) i ASPC-1-celler, men reduserte dets fosforylering i T3M4-celler i fravær og nærvær av shEGFR, noe som bekrefter at src ble aktivert i T3M4 celler ved sTβRII. Fjerde, tre src kinase hemmere, SKI-606, PP2, og dasatinib, blokkerte TβRII-mediert reversering av veksthemming.
Vi har tidligere fastslått at tilsetning av renset sTβRII protein til mediet av disse cellene også sequesters TGF-beta og blokkerer TGF-β handlinger
in vitro
(upubliserte observasjoner). TGF-β bindes til type II TGF-β reseptor (TβRII) homodimer, som deretter danner et heterotetrameric kompleks med den TβRI homodimer, som fører til aktivering av TβRI serin-treonin-kinase-aktivitet [9]. Denne aktiveringen initierer en signalkaskade som omfatter fosforylering av reseptor-regulert Smads (R-Smads), Smad2 og Smad3, ved deres C-terminale SSXS motiv, deres påfølgende oligomerisering med det felles mekleren Smad4, og translokasjon av komplekset til kjernen hvor regulering av gentranskripsjon foregår da [9], [31]. TβRII kan også bli fosforylert på tyrosin-rest 284 som fører til aktivering av alternative reaksjonsveier slik som p38 MAPK [32]. Mens src-aktivering forekommer ofte på nedstrømssiden av tyrosinkinase-reseptorer, kan TGF-β også øke src aktivitet, men på en forbigående måte [33]. Imidlertid TGF-β virker også til å indusere src degradering [34]. Det er mulig, derfor kan det TGF-β-håndtering i T3M4 celler forebygge kreft celle-avledet TGF-β fra inducing src nedbrytning og /eller inaktivering.
For å vurdere den biologiske relevansen av disse
in vitro
funn, vi brukte en subkutan naken mus modell som gjør det mulig for reproduserbar vurdering av
in vivo
biologiske relevansen av signalveier som er endret
in vitro
. Således, med hensyn til ASPC-1-celler, enten EGFR nedreguleringen eller TGF-β håndtering resulterte i signifikant (36 til 38%) reduksjon i tumorvolum, og en ytterligere reduksjon til 85% når begge metoder ble kombinert. Imponerende, svulster ikke klarte å danne i to av åtte mus injisert med ASPC-1 celler uttrykker pWPT-sTβRII, og i fire av åtte mus som uttrykker både pWPT-sTβRII og shEGFR-LV. Dessuten var det en markert forsinkelse i utseendet av de 4 svulster som oppsto fra celler som uttrykker både pWPT-sTβRII og shEGFR-LV, som alle oppviste sterkt redusert proliferasjon og angiogenese, og økt apoptose. Disse funnene støtter strategier for målretting mot TGF-β i PDAC [13], [14], [35], og er i overensstemmelse med den observasjon at det er en sterk EGFR
in situ hybridisering
signal i tumorvaskulatur in PDAC hos mennesker [36] og med forslag til roller av EGFR i tumor angiogenese. Mens rettet mot TGF-B av ligand binding eller ved TβRI kinase hemming demper bukspyttkjerteltumorvekst og metastasering i musemodeller [13] – [15], våre funn tyder på at, kan i visse tilfeller, rettet mot både EGFR og TGF-β-avhengige veier utøver synergis inhibitoriske effekter på PDAC proliferasjon og angiogenese.
T3M4-avledede tumorer, TGF-β håndtering resulterte i en reduksjon i tumorvolum 37% og redusert proliferasjon og angiogenese, mens EGFR nedregulering resulterte enten i manglende evne til å danne svulster eller ved dannelse av meget små svulster og markert svekket angiogenese. Således T3M4 celler er svært avhengig av EGFR for tumor initiering, progresjon og angiogenese
in vivo
, og dette utsøkte avhengighet av EGFR er konsistent med EGFR-mediert mitogenese, så vel som med dens rolle i angiogenese-avhengige onkogen avhengighet [37], [38]. Disse dramatiske effekter ble reversert av sTβRII som restaurerte spredning, men endret ikke angiogenese eller apoptose, noe som resulterer i store svulster som viste områder med nekrose. Således, mens
in vitro Hotell og
in vivo
veksthemmende handlinger av EGFR lyddemping ble reversert av TGF-β beslaglegging, de parakrine antiangiogene effekter av EGFR lyddemping og effekter på apoptose vedvarte, understreker de pro-mitogene effekter av src aktivering. Dessuten har det nylig blitt vist at angiogenese er viktig i et Kras drevet genetisk konstruert musemodell for PDAC [39] og det variant 161R form av interlukin-17F (IL-17F), som er en naturlig antagonist av den anti-angiogene virkningene av villtype-161H IL-17F, er forbundet med en dårligere prognose i PDAC [40], som gir indirekte bevis på at angiogenese kan spille en viktig rolle i dets metastatisk spredning. I lys av disse observasjonene, dagens funn tyder på at målretting EGFR og TGF-β kan være viktig for å normalisere tumor angiogenese i primærtumor og undertrykke angiogenese i metastatiske lesjoner i PDAC.
ASPC-en og T3M4 celler havn muterte KRAS og p53-gener, og uttrykker høye EGFR nivåer [5], [41]. Disse cellene har også produsere høye nivåer av TGF-β, TGF-α og amfiregulin [19], [42], som er auto-induserbar, TGF-β-induserbar, og pro-angiogen. Videre ASPC-1 celler havn en mutert SMAD4 genet [43], mens T3M4 celler er villtype for Smad4 [44]. Som sådan, ASPC-en og T3M4 celler utstillingen endringer som er svært representative av spekteret av typiske molekylære endringer sett i PDAC.
