Abstract
Mål
glutation (GSH) spiller en viktig rolle i å beskytte cellene mot oksidativ skade. ABCC1 protein transporterer GSH. Selv om dette proteinet er i stor grad undersøkt i kreft, på grunn av flermedisinresistens fenotype, dens rolle i de rørformede celler av nyrene er ukjent. Målet med denne studien var å finne ut om ABCC1 har en rolle i å beskytte celler fra den distale nevronet mot stress forårsaket av høy medullar osmolalitet.
viktigste metoder
MA104 celler ble behandlet med høy konsentrasjoner av natriumklorid, urinstoff, eller begge deler for å heve osmolaliteten av kulturmediet. Celleviabilitet ble åpnet av MTT og trypanblått analyser. ABCC1 ekspresjon og ekstrudering av carboxi-fluorescein (CF), et fluorescerende ABCC1 substrat, ble målt ved strømningscytometri.
Viktige funn
Inkubering av MA104-celler i et høyt natriumkonsentrasjon medium resulterte i endringer i celle detaljnivå og endret uttrykk og aktivitet av ABCC1. Urea endret ikke ABCC1 uttrykk eller aktivitet, men motsatt de observerte NaCl effekter. Høye natriumkonsentrasjoner hadde også en negativ effekt på celle levedyktighet og urea også beskyttede celler mot denne effekten.
Betydningen
Våre funn viser at ABCC1 spiller en betydelig rolle i beskyttelse av nyrene epitelceller mot stress forårsaket av høy natrium miljø stede i nyremargen
Citation. Fonseca LM, Alvarez AB, Rodrigues RC, Santos DHF, Lopes AG, Capella MAM (2013) ABCC1 er knyttet til beskyttelse av den distale nevronet mot Hyperosmolalitet og High Sodium Miljø: Mulige implikasjoner for Cancer Kjemoterapi. PLoS ONE 8 (6): e68049. doi: 10,1371 /journal.pone.0068049
Redaktør: Dominique Heymann, Faculté de Médecine de Nantes, Frankrike
mottatt: 07.01.2013; Godkjent: 23 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Fonseca et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Programa de Oncobiologia (FECD /FAF /ONCO II), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) og Programa de Apoio aOS Núcleos de Excelência (PRONEX). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
multiresistens (MDR) er fortsatt den viktigste årsaken til svikt i kreft kjemoterapi. Selv om MDR er multifaktoriell, er det først og fremst karakterisert ved en ATP-avhengig reduksjon av intracellulær akkumulering av legemidlet, på grunn av overekspresjon av tre proteiner som tilhører ABC-transportører superfamilie: P-glykoprotein (ABCB1), brystkreft protein (BCRP eller ABCG2) eller multiresistens-assosiert protein 1 (MRP1 eller ABCC1). Selv om utgangspunktet observert i tumorceller, disse proteiner er også tilstede i normale celler. I nyrene, er begge ABCB1 og ABCG2 uttrykt i den apikale membran av proksimale tubuli, hvilket antyder en rolle i medikament sekresjon [1], [2].
ABCC1, tidligere kjent som MRP1, er et transmembranprotein som opprinnelig gjenkjent som en transportør i forbindelse med multimedikamentresistens fenotype i visse kreftceller [3] – [6], men senere studier viste at dette protein er ubikvitært uttrykt i nesten alle organer i pattedyr, inkludert mennesker [7], [8]. Dette transportør har en stor betydning i inflammatoriske prosesser og oksidativt skade, gitt at det transporter både redusert og oksidert glutation, leukotriene C4 og prostaglandiner [7], [9]. Dets fysiologiske rolle har blitt studert i flere organer og systemer, og en av de viktigste funnene er det faktum at dens tilstedeværelse er essensielle for den hypertensive respons på angiotensin II [10].
Men om den fysiologiske rolle ABCC1 i nyre, er det ikke sannsynlig at dette proteinet presenterer noen form for sekretorisk rolle, på grunn av det faktum at det er begrenset til glomerulus og til basolateral membran av både den tykke stigende lem av Henle sin sløyfe og den medullar samlekanal [11 ]. At funn til slutt utsatt videre studier om viktigheten av denne transport i nyrene, selv om noen bevis peker mot en rolle ABCC1 i urinkonsentrasjons mekanismer. For eksempel, tykk stigende lem og distale tubuli er spesielt følsomme for GSH uttømming som fremmes av diethylmaleat (DEM), som danner komplekser med GSH, redusere de intracellulære nivåene av dette tripeptid. Dyr utsatt for behandling med DEM viste alvorlige urinkonsentrasjonsmangler [12], [13]. I tillegg ble det påvist at etoposid-indusert polyuri i abcc1 (- /-) mus, tyder på at dette protein er en eller annen måte er knyttet til vann reabsorpsjon [14]
En rekke anticancer legemidler er kjent for å indusere nefrotoksisitet.. For eksempel, nefrotoksisitet indusert ved cisplatin, en vanlig brukt medikament i anticancerterapi, begrenser dens anvendelse ved kreftbehandling, og flere undersøkelser er utført for å minske denne uheldige virkning [15] – [17]. Også det ble nylig vist at nefrotoksisitet knyttet til doxorubicin, et stoff meget brukt i kjemoterapi for brystkreft og andre former for kreft, er på grunn av mitokondrie forstyrrelser og celledød som regulerer gener [18].
Siden nefrotoksisitet er assosiert med flere kreftmedisiner [19], [20], og siden rollen ABCC1 i nyre forblir uløst, denne studien forsøkte å gjenkjenne en mulig rolle av dette proteinet i nyreceller. Vi observerte bevis på at ABCC1 er knyttet til vern av den distale nevronet mot hyperosmolalitet grunn av en høy natrium miljø og at GSH er viktig for å opprettholde levedyktigheten til distale nevronet celler.
Materialer og metoder
Alle dyr prosedyrer ble tidligere vurdert og godkjent av Animal Subject komiteen i Centro de Ciencias da Saúde – UFRJ med protokollnummer IBCCF 082/2009
Cell Culture
Monkey embryo cellelinje MA104. , gris nyre epitelceller Advisor-PK1 og hunden nyre epitel cellelinje MDCK ble alle hentet fra Rio de Janeiro Cell Bank. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Gibco, USA) med penicillin og streptomycin (Gibco, USA) og supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA) og L-glutamin (Gibco, USA).
Behandling med Osmolytes
for å heve osmolalitet av kulturmediet, 100 mM NaCl, 200 mM urea, 200 mM mannitol, eller 50 mM NaCl 100 mM urea (endelige konsentrasjoner) ble lagt til mediet, heve sin osmolalitet til ca. 450 mOsm /kg H
2o. Løsningene ble det tilsatt enten gradvis over en periode på 72 timer, eller i en enkelt tilsetning, slik det er beskrevet i figurene «bildetekster.
MTT-analysen
MTT kolorimetrisk analyse [21] ble brukt for å vurdere levedyktigheten til MA104 cellelinjen inkubert i hyperosmotisk medium. Omtrent 2 x 10
4 celler pr brønn ble sådd ut på 96 brønn plater. Den neste dag NaCl, urea, mannitol eller NaCl + urea ble tilsatt til mediet som beskrevet ovenfor. I noen forsøk Buthionine-sulfoksiminforbindelser, en inhibitor av GSH-syntese (BSO-Fluka, USA), og MK571, en ABCC1 inhibitor, ble også tilsatt. Etter inkubasjonsperioder på 24, 48 eller 72 timer ble 20 ul av 10 mg /ml tiazoyl blå tetrazoliumbromid (Sigma, USA) ble tilsatt til kulturen og cellene ble videre inkubert i 3 timer ved 37 ° C. Ved slutten av inkubasjonstiden supernatanten ble fjernet og 100 ul dimetylsulfoksid ble tilsatt per brønn for å oppløse det nydannede formazan salt. Absorbansen ble målt ved 490 nm ved hjelp av en ELISA plateleser (Benchmark, BioRad). Gjennomsnittsverdier ble beregnet ut fra 3 uavhengige eksperimenter.
trypanblått Farging
En annen metode som brukes for å få tilgang til cellenes levedyktighet var celletelle med Trypan blå farging. I dette tilfellet, 1 x 10
5-celler /brønn ble sådd ut på 24 brønners plater, og etter inkubasjon med osmolytes som beskrevet ovenfor, ble cellene tellet med et hemocytometer.
glutation
Et kommersielt kit ved hjelp monochlorobimane som substrat (Millipore, USA) ble anvendt for å måle glutation (GSH) nivåer. For denne analysen, ble 1 x 10
6-celler sådd ut på kulturflasker, behandlet som ovenfor, og høstet med trypsin. GSH Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Fluorescens-nivåer ble avlest ved anvendelse av en plateleser med en 380/460 nm filter-apparatet.
ABCC1 Aktivitet
Cellene ble sådd ut på 24 brønn plater og behandlet med osmolytes som beskrevet ovenfor. Karboksy-fluorescein-diacetat (CFDA – Molecular Probes, USA) er en ikke-fluoriserende molekyl som blir omformet til en fluoriserende ett, karboksy-fluorescein (CF) av intracellulære esteraser. Dette molekylet er et substrat for ABCC1. Derfor, for å bestemme ABCC1 aktivitet, ble cellene inkubert i 30 minutter med 2 uM cfda (for å muliggjøre farveopptaks, esterase handling, og akkumulering av CF), renset med fosfat-bufret saltvann (PBS), for å vaske ut fargestoff og inkuberes i 30 minutter i CFDA-free DMEM for CF ekstrudering. Cellene ble deretter høstet med trypsin, vasket og ressuspended i saltoppløsning. Intracellulær fluorescens ble målt i en Beckton-Dickinson strømningscytometer (FACSCalibur). Dataanalyse ble utført av programvaren Summit (Dako Inc, USA).
Merking med Anti-ABCC1 Antistoff
Celler ble sådd ut på 24 brønner plater og merkingsassayet ble utført som beskrevet i en tidligere arbeid fra vår gruppe [22]. Den polyklonale kanin antistoff A23 (Alexis Biochemicals, USA) og Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA) ble brukt som henholdsvis primær- og fluorescerende sekundære antistoffer.
Western blotting-analyse for Tamms-Horsfall protein (THP eller Uromodulin) og aquaporin 2 (AQP2)
uttrykk av THP og AQP2 ble vurdert ved immunoblotting med spesifikke antistoffer. Celler ble sådd ut på 6-brønners plater på en 5 x 10
5-celler /brønn og inkubert ved 37 ° C. Etter 48 timers inkubasjon ble kulturmediet suget; cellene ble vasket tre ganger med PBS (pH 7,4) ved romtemperatur, skrapet, og sentrifugert ved 14 000
g
i 60 sekunder. Cellene ble deretter suspendert i prøvebuffer (Trisma basis 0,76% m /v; Glyserol 12,56% m /v og natriumdodecylsulfat 2,3% m /v; pH 6,8). Etter homogenisering ble en liten prøve som brukes for proteinmåling. Bufferen ble deretter supplert med 0,6% ditio-L-treitol (DTT), 0,5% β-merkaptoetanol, og bromfenolblått (1 mg /ml). Proteinene ble deretter underkastet SDS-polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) og overført til en PVDF-membran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membranene ble blokkert med Western Breeze blokkerende løsning (Invitrogen, USA) og inkubert med spesifikke antistoffer mot THP eller AQP2. Den fosfatase alkaliske Western Breeze Kit (Invitrogen, USA), ble brukt til å visualisere de bandene i membranene. Den subklon C7 fra MDCK-cellelinjen ble brukt som en positiv kontroll for AQP2, siden det er sammensatt av primære celler fra samlekanal [23]. Andre kontroller var utdrag fra rotte nyre medulla og cortex. For dette Whistar rottene hadde sine nyrer fjernet, dissekert og lagret ved -80 ° C for prosessering. Lige organer ble tilslutt homogenisert i en oppløsning bestående av PMSF (1 mM), sukrose (250 mM), EDTA (1 mM) og imidazol (20 mM) til et homogenat ble oppnådd.
Statistical Analysis
Hvert eksperiment ble gjentatt med fra tre til fem ganger. Data ble uttrykt som middelverdier ± standardavvik av gjennomsnittet og ble analysert ved anvendelse av Students t-test eller en-veis ANOVA med Bonferroni Dunnet eller legg tester for sammenligning av forskjellene. Verdier for P mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Karakterisering av MA104 Cells
Siden det er ingen human cellelinje fra distal nephron kommersielt tilgjengelig, vi prøvde å teste om nedsatt ape cellelinje MA104 var stammer fra distale nevronet. Først sammenlignet vi følsomheten av tre pattedyrnyrecellelinjer til urea: MDCK, en kaninnyre-cellelinje med egenskapene av distal nevronet [24] – [26]; LLCPK1, et svin nyrecellelinje med karakteristikker av proksimale tubuli [27] og MA104, men likevel ikke karakterisert. Celler ble inkubert i 48 timer med forskjellige konsentrasjoner urea og cellenummeret og den cellulære levedyktighet ble målt ved hjelp av Trypan blå farging. Som det kan ses i fig. 1, MA104 cellene er så motstandsdyktig mot urea som MDCK-celler, mens LLC-PK1-celler er mer sensitive.
Cellene ble sådd ut på 24-brønn plater og urea ble tilsatt 24 timer senere i flere konsentrasjoner. Etter 48 timers inkubering, ble celletallet og levedyktigheten målt ved hjelp av Trypan blå farging (n = 4). a – forskjellig fra 37,5 mm (p 0,01); b – forskjellig fra 75 mm (p 0,001).
MDCK er en hund nyrecellelinje, og det er store forskjeller mellom hund og mennesker. Videre trenger flere antistoffer hevet til mennesker ikke merke hunden proteiner. På den annen side, er MA104 en ape nyrecellelinje, og det er godt akseptert at for ikke-humane primater har mange egenskaper med mennesker. Vi har tidligere vist at antistoffer mot humant ABCB1 og ABCC1 også merkes denne cellelinjen [28], [29]. Gitt at ABCC1 uttrykkes bare på de basolaterale membraner av distale tubuli rett og samlekanal epitel [11], og tar hensyn til motstanden i MA104 celler til urea, synes det sannsynlig at disse cellene kom fra distal nevronet. Derfor evaluert vi noen kjennetegn ved distale nevronet segmenter i denne cellelinjen. Våre resultater viste at MA104 cellene ikke viste signifikant merking med PNA, en markør for interkalerte celler og uttrykte ikke uromodulin, et protein som blir uttrykt bare i den distale rett tubuli, men uttrykker AQP2, et protein som er karakteristisk for hoved celler av oppsamlings kanal (fig. 2). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at MA104 cellene stammer fra samlekanal, noe som gjør dem en god modell for å studere hvilken rolle ABCC1 i motstanden av nyreceller til hyperosmolalitet.
A. Ekspresjon av THP-protein i rottenyre kortikale (kolonne 1) og meldullary (kolonne 2) og ekstraktene MA104 (felt 3) i den øvre membranen og β-aktin i den nedre membran; B. Ekspresjon av aquaporin 2 i MDCK-C7 (kolonne 1) og MA104 (kolonne 2); C og D. PNA merking (100 mm) av MDCK-C11 (C) og MA104 (D).
Følsomhet for MA104 Cells til flere Osmolytes
Neste skritt var å bestemme virkningen av forskjellige osmolytes i overlevelse av MA104-celler. Medium osmolalitet ble tatt opp med natriumklorid, urinstoff eller mannitol i en enkelt tilsetning (en osmotisk sjokk) og levedyktighet ble målt ved MTT-analyse. Konsentrasjonen av NaCl som ble anvendt var som tidligere bestemt som den minimale NaCl-konsentrasjonen for å oppnå maksimal effekt på celleoverlevelse (data ikke vist). Fig. 3 viser at tilsetning av natriumklorid sterkt redusert celleoverlevelse, mens urinstoff og mannitol hadde bare en liten effekt. Dette resultatet tyder på at den reduserte levedyktigheten av celler behandlet med NaCl er ikke på grunn av hyperosmolalitet seg selv, ettersom mannitol ikke gi samme effekt.
Etter en innledende inkubering på 24 timer ved 37 ° C, ble tilsatt til osmolytes kulturmediet og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3). a – forskjellig fra kontroll (p 0,05); b – forskjellig fra NaCl (p 0,01)
Siden NaCl kan påvirke flere funksjoner, for eksempel natriumkanaler, klorid kanaler, natrium-kalium ATPase etc, og siden det ikke er data i den vitenskapelige. litteratur tyder enten Na
+ eller Cl
– er den viktigste årsaken til nedgangen i cellen levedyktighet, bestemte vi oss for å studere dette punktet. Til sammenligning brukte vi cholinklorid, som opprettholder den samme ioniske styrken av mediet med uten nærvær av Na
+. På fig. 4 er det vist at NaCl og cholinklorid like redusert cellulær levedyktighet, noe som tyder på at kloridionet har ansvaret for denne effekten.
Etter en innledende inkubering på 24 timer ved 37 ° C, ble osmolytes tilsatt til kulturmediet og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer; A. Celler ble behandlet med NaCl eller NaCl + urea. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3). a – forskjellig fra kontroll (p 0,05); b – forskjellig fra NaCl 175 mM (p 0,001) og B. Celler behandlet cholinklorid (vist som kolin) eller cholinklorid + urea (n = 3). a – forskjellig fra kontroll (p 0,001); b – forskjellig fra kolin 175 mm (p 0,001)
Effekt av Urea i følsomhet MA104 celler til NaCl og kolin klorid
Noen forfattere observert at urea beskyttet celler mot. skade indusert ved hjelp av natrium-klorid [30]. Som medullær hyperosmolalitet i nyrene er hovedsakelig på grunn av urea og NaCl, vår neste trinn var å undersøke en mulig beskyttende effekt av urea på cellelevedyktighet under høyt NaCl-konsentrasjon. Cellene ble deretter sendt til en osmotisk sjokk med NaCl i nærvær eller fravær av urea. For å opprettholde den samme osmolaliteten av mediet, ble forskjellige mengder av NaCl og urea anvendt (det endelige osmolaliteten av mediet med 50 mM urea 150 mM NaCl ble lik den i medium tilsatt 175 mM NaCl alene, omtrent 561 mOsm /kg H
2o som målt ved hjelp av et osmometer). Til sammenligning, har vi også brukt cholinklorid. Det kan ses på fig. 4 som urea beskyttet celler sendes til høy NaCl, men virkningen av urea i celler behandlet med cholinklorid var mye mindre enn det som ble observert for NaCl. Dette tyder på at begge ionene (Na
+ og Cl
-) delta i celledød, men effekten av urea er mer uttalt under en NaCl miljø, noe som er i overensstemmelse med den renale medullar miljø. Siden kolin klorid er ikke en osmolyte i nyremargen, fikk vi ikke bruke dette stoffet i de følgende eksperimenter.
Intracellulær GSH nivåer i MA104 celler behandlet med Osmolytes
Det er flere bevis på at NaCl bly til oksidativ skade [31], [32]. Siden GSH er en av de viktigste intracellulære molekyler relatert til beskyttelse mot oksidativt stress [33], ble nivåene av intracellulær GSH evaluert i MA104-celler etter behandling med osmolytes. For denne analysen ble osmolytes tilsettes på en gradvis måte, i løpet av 72 timer og innholdet av GSH ble målt. På fig. 5 er det vist at behandling av celler med NaCl forårsaket en signifikant økning (ca. 50%) i de intracellulære nivåene av redusert GSH i MA104-celler. Urea alene ikke forandre det intracellulære innholdet av GSH, men reverserte GSH økning observert i celler behandlet med NaCl. For å teste om denne høyden i GSH nivåer kan være relatert til celle overlevelse, brukte vi BSO, en hemmer av glutation syntase, som vil kunne innskrenke denne høyden i GSH nivåer. Cellene ble pre-inkubert med BSO før behandling med NaCl eller urea. Som forventet, hemming av GSH-syntese ved BSO redusert med 50% overlevelse av celler behandlet med NaCl, men ikke forandre den for celler behandlet med urea eller urea + NaCl (fig. 6), noe som tyder på at celledød i nærvær av urea + NaCl skjer ved en annen måte enn den som med NaCl alene og er ikke avhengig av GSH.
Celler ble inkubert som angitt i figur 4 og de intracellulære nivåene av GSH ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 8); p 0,05 (a – forskjellig fra både kontroll- og urinstoff)
Etter en innledende inkubering på 24 timer ved 37 ° C, BSO (1 mM) ble tilsatt til kulturmediet, og etter 24 timer. inkubering osmolytes ble tilsatt til kulturen og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 3); p 0,05. (A – forskjellig fra NaCl).
Uttrykk av ABCC1 i MA104 celler behandlet med Osmolytes
Siden vedlikehold av intracellulære GSH nivåer er nært forbundet med ABCC1 transport [34], [ ,,,0],35] og gitt at MA104 og samlekanal celler uttrykker ABCC1 [14], [22], i de neste forsøkene vi prøvde å studere en mulig rolle ABCC1 i responsen til MA104 celler til NaCl og urea. Ved utførelse flowcytometri, observerte vi at NaCl fører til endringer i celle kornethet (så ved forandringer i sidesprednings-SSC), uten noen forandringer i cellevolum (så ved endringer i forover-spredning-FSC) som kan sees i fig . 7A. Derfor må vi først studert slike endringer. For å gjøre dette, ble cellene separert i to regioner: region R1, som inneholder celler med normal SSC og region R2 inneholder celler med høy SSC (Fig 8A.)
Celler ble inkubert i 96 timer ved 37. ° C med osmolytes. A – dot tomter viser forskjellen mellom forover spredning (FSC) og side spredning (SSC), som representerer henholdsvis cellevolumet og detaljnivå. B – Andel av celler som utviser normal detalj for hver behandlingsgruppe. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 4); (A – forskjellig fra kontroll; p 0,001 og b- forskjellig fra NaCl; p 0,01).
Celler ble inkubert med osmolytes under 96 timer ved 37 ° C. Cellene ble deretter merket med anti-ABCC1 antistoff og ekspresjon av dette protein ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Hver behandlingsgruppe ble delt inn i to undergrupper i henhold til SSC-verdier. A – Histogram som viser de to subpopulasjoner (normal og høy SSC) for hver tilstand og B – Andel ABCC1-positive celler fra både normale og høye SSC subpopulasjoner. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (n = 5). a – forskjellig fra kontroll (p 0,01) og b- forskjellig fra NaCl; p. 0,01)
I fig. 7B er det vist at 90% av kontrollcellene har normal SSC og at behandling i 72 timer med urea alene ikke endret celle granularitet. Men NaCl øker kraftig denne parameteren, med nesten halvparten av befolkningen har større SSC. Dessuten, urea reverserte denne forandring, siden 76% av cellene som sendes inn til NaCl + urea var i regionen med normal SSC og dette var ikke signifikant forskjellig fra kontrollceller. Selv om denne økningen i celledetalj kan skyldes en redusert cellevolum, på grunn av for å slippe av cellen vanninnhold, kan vi ikke observere dette. FSC av celler som sendes til alle behandlinger var lik den for kontrollcellene, noe som tyder på noen endring i cellevolum etter langvarig behandling med NaCl, urea eller NaCl + Urea (Fig. 7A).
I betraktning av den observerte virkningene av NaCl behandling i SSC, for studier av ABCC1 ekspresjon og aktivitet vi separeres cellene i to regioner, en forbindelse til celler med normal SSC og den annen relatert til celler med høy SSC. Resultatene er vist i fig. 8 viste at for celler med normal SSC, omtrent 85% av kontrollcellene uttrykker ABCC1. Denne prosentandelen er redusert til omtrent 50% i celler behandlet med NaCl, og urea ikke reversere dette. For celler med høy SSC, prosentandelen av celler som uttrykker ABCC1 er omtrent 50% i kontrollceller. NaCl økte dette til ca 92%, og urea endret dette, returnere verdier nær kontrollcellene (54%).
Det neste skrittet var å studere ABCC1 aktivitet ved flowcytometri. Når du gjør dette, observerte vi at kontrollceller akkumulerer mye mer CF (en vanlig benyttet substrat for ABCC1) enn celler behandlet med osmolytes, sannsynligvis fordi hyperosmolalitet av media med NaCl, urea og NaCl + urea hindret cellulært opptak av fargestoffer ( fig. 9). Selv om dette svekket sammenligning av osmolyte-behandlede celler med kontrollceller, kunne vi fortsatt sammenligne celler med normal eller høy SSC inne i samme behandling. Derfor, i fig. 10 er vist akkumuleringen og utstrømningen av NaCl behandlede celler med normal (fig. 10A og 10B) og høy (fig. 10C og 10D) SSC. Det kan sees at det cellulære opptak av cfda var like, uavhengig av normal eller høy SSC (fig. 10A og 10C). Imidlertid utstrømningen av det fluorescerende fargestoff ved celler med høy SSC var nesten fullstendig (fig. 10D), mens i celler med normal SSC ca. 50% av cellene har ikke utstrømning fargestoff (Fig. 10B). På den annen side er celler behandlet med NaCl + urea var like i stand til å effluks fargestoff, uansett normalt eller høyt SSC (fig. 11b og 11d).
Total populasjon av celler ble inkubert i 96 timer ved 37 ° C med osmolytes og mobil fluorescens, viser akkumulering av CF etter 30 min inkubering ble målt som beskrevet i Materialer og Metoder. Panel A viser opphopning av CF i kontrollceller, noe som gjenspeiles av den høye fluorescens. Paneler B, C og D viser akkumulering av CF i celler behandlet henholdsvis med NaCl, urea eller NaCl + urea. Histogrammer representant for 3 forskjellige eksperimenter.
Celler ble inkubert med NaCl i 96 timer ved 37 ° C og aktiviteten ABCC1 ble målt som beskrevet i Materiale og metode. Ved analyse ble cellene delt inn i to undergrupper i henhold til den side scatter verdier. Venstre paneler: CF opphopning av celler med normal (A) og høy (C) SSC; Høyre paneler: CF efflux fra celler med normal (B) og høy (D) SSC. Histogrammer representant for 3 forskjellige eksperimenter. Verdiene i hvert panel refererer til prosentandelen av celler med fluorescens, noe som innebærer celler som akkumulerer CF (i panelene A og C) og celler som ikke var i stand til dyseutstrømningen fargestoffet etter 30 min i fargestoff-fritt medium (i panelene B og D).
Celler ble inkubert med NaCl + urea i løpet av 96 timer ved 37 ° C og aktiviteten ABCC1 ble målt som beskrevet i Materiale og metode. Ved analyse ble cellene delt inn i to undergrupper i henhold til den side scatter verdier. Venstre paneler: CF opphopning av celler med normal (A) og høy (C) SSC; Høyre paneler: CF efflux fra celler med normal (B) og høy (D) SSC. Histogrammer representant for 3 forskjellige eksperimenter.
Diskusjoner
MA104 er en cellelinje avledet fra nyre afrikanske Monkey embryoer [36]. Det uttrykker flere kjennetegn ved polariserte epitelceller, for eksempel dannelsen av «domer», etablering av en transmonolayer elektrisk motstand og polarisert modning av innhyllet virus [37]. Vi har tidligere vist at denne cellelinje som uttrykker minst to proteiner relatert til flermedisinresistens, ABCB1 og ABCC1 [28], [29], [38]. I denne studien har vi preget videre disse cellene, og det virker veldig sannsynlig at MA104 stammer fra samlekanal, sannsynligvis viktigste celler. Slik karakterisering er viktig for å etablere denne cellelinjen som en modell for studier av ABCC1 i nyrene.
Så snart karakterisert viste vi økningen i osmolalitet på grunn av NaCl eller cholinklorid (men ikke urea) forårsaket en reduksjon i cellevekst. Videre urea beskyttede celler fra vekst-inhibering eller celledød som induseres av NaCl, men ikke cholinklorid (fig. 3-4). Disse resultatene er i samsvar med andre forfattere som viste at urea kan reversere de skadelige virkninger tilskrives NaCl [30]. Det har også blitt vist at, selv om urea kan forårsake oksidativ skade, er det også i stand til å aktivere beskyttende mekanismer mot slike oksidative skader, og at NaCl aktiverte også beskyttelsesmekanismer, men bare når det ble gradvis tilsatt til mediet, [39], [ ,,,0],40]. Imidlertid er mekanismene ved hvilke slike effekter oppstår fremdeles ikke forstått. Den nøyaktige prosessen som NaCl forårsaker reduksjon i celle levedyktighet er ennå ukjent. Noen forfattere ser ut til å være enige om at høye konsentrasjoner NaCl forårsake cellesyklus arrest. Både Michea og Kultz hevder at mIMCD lider cellesyklus arrest i G2 etter inkubasjon med høy natriumklorid konsentrasjoner, som fører til redusert spredning [41], [42]. Dimitrieva legger til det krav, som viser at p53-nivåene øker raskt i mIMCD3-celler etter inkubasjon med natriumklorid, redusere celleproliferasjonen ved første øyeblikk [43]. En senere studie igjen antyder at NaCl induserer en reduksjon i proliferasjon, nå grunn av en økning i EGR-1-ekspresjon, noe som ville tjene som en stimulans for differensiering [44]. Kultz [45] hevder videre at NaCl i høye konsentrasjoner fører til doble trådbrudd i DNA, som kan være forårsaket av frie radikaler. Videre Zhou og Zhang er enige om at høy NaCl forårsaker en økning i ROS og følgelig oksydativ skade [46], [47]. Som det står, synes bevis til å peke på at reduksjonen av levedyktighet tendens til å peke mot oksidativt stress som utgangspunkt.
beskyttelse tilbys av urea er like kontroversielt som er NaCl indusert skade. En studie antyder at urea i seg selv fører til økning i ROS, men også er i stand til å indusere ekspresjon av heme oksygenase-1 (HO-1) i nyreceller, som kan omfatte en del av det adaptive eller beskyttende system for å hyperosmolaritet [40]. Zhang et al, viser at tilsetning av urea til NaCl behandlede celler fører til hemming av caspase-3 aktivitet [30]. Også Santos viste at det innerste medulla nyreceller behandlet med både NaCl og urea viste en økning i HSP70 som korrelerer med økningen i osmolaritet. Forfatterne foreslår at et slikt funn, assosiert med reduksjon spredning sett i de behandlede celler kan være en del av den beskyttende mekanismen som gjør det mulig for cellene å overleve i nyremarg [48]. Tatt sammen antyder dataene at mens NaCl (og i noen modeller, urinstoff) fører til økning i ROS og påfølgende DNA-skade, en samtidig behandling med urea fører til aktivering av responsmekanismer slik som anstand ekspresjon som fører til DNA-beskyttelse. Men resultatene viste at beskyttelse av urea mot skade er forårsaket hovedsakelig av Na
+ ion og ikke nødvendigvis NaCl. Dette tyder på at nye undersøkelser er nødvendig for å forstå både den dødelige effekten av NaCl og urea og interaksjonen mellom disse to komponenter i nyremargen.
Gitt at GSH er hoved ikke-enzymatiske antioxidant-molekylet, har vi studert de intracellulære nivå av GSH-celler ble behandlet med NaCl og /eller urea. Det ble observert at NaCl, men ikke urea, økte intracellulære GSH-nivåer, og at urea reverseres økningen i GSH-nivåer i NaCl-behandlede celler (Fig. 5). Økningen i GSH-innholdet i NaCl-behandlede celler kan skyldes inhibering av ABCC1 aktivitet eller ekspresjon, men kan også være på grunn av en økning av oksidativt stress. Videre BSO redusert med 50% overlevelse av celler behandlet med NaCl, men endret ikke overlevelse av celler behandlet med urea eller urea + NaCl (fig. 6).
