Abstract
Naturlige produkter er blir mye utforsket for deres potensial for å forebygge samt behandle kreft på grunn av deres evne til å målrette flere molekylære stier.
Ficus religiosa
har vist seg å utøve ulike biologiske aktiviteter som apoptose i brystkreftcellelinjer. I denne studien rapporterer vi antineoplastiske potensialet i vandig ekstrakt av
F. religiosa product: (FR
aq) bark i humane livmorhalskreft cellelinjer, Siha og HeLa. FR
aq endret vekstkinetikken for Siha (HPV-16 positive) og HeLa (HPV-18 positive) celler på en doseavhengig måte. Det blokkerte cellesyklusutvikling ved G
1 /S-fasen i Siha som var kjennetegnet ved en økning i ekspresjon av p53, p21 og pRb-proteiner med en samtidig reduksjon i ekspresjonen av fosfo Rb (ppRb) protein. På den annen side, i HeLa, FR
aq apoptose gjennom en økning i intracellulær Ca
2+ fører til tap av mitokondriemembranpotensialet, frigjøring av cytokrom-c og økning i ekspresjon av caspase-3. Videre FR
aq redusert migrasjon samt invasjon evne til både livmorhalskreft cellelinjer akkompagnert med nedregulering av MMP-2 og Her-2 uttrykk. Interessant, FR
aq redusert uttrykk av virale teinene E6 og E7 i både livmorhalskreft cellelinjer. Alle disse data tyder på at
F. religiosa
kan utforskes for sin chemopreventive potensial i livmorhalskreft
Citation. Choudhari AS, Suryavanshi SA, Kaul-Ghanekar R (2013) Den vandige ekstrakt
Ficus religiosa
Induserer Cell Cycle Arrest i human livmorhalskreft cellelinjer Siha (HPV-16 Positive) og apoptose i HeLa (HPV-18 Positive). PLoS ONE 8 (7): e70127. doi: 10,1371 /journal.pone.0070127
Redaktør: Chunhong Yan, Albany Medical College, USA
mottatt: 22 februar 2013; Godkjent: 14 juni 2013; Publisert: 26.07.2013
Copyright: © 2013 Choudhari et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takke IRSHA, Bharati Vidyapeeth University og csir for å støtte dette arbeidet. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest viktigste årsaken til kreftdød i kvinner over hele verden [1], [2]. Høyrisiko humant papilloma virus (HPV) som HPV 16, 18, 31 og 33 har blitt tilskrevet å være de viktigste risikofaktorer for livmorhalskreft, hvorav HPV-16 og -18 står for nesten 70% av kreft [ ,,,0],3]. E6 og E7 er de to virale oncoproteiner som er nødvendige for utvikling og opprettholdelse av den transformerte fenotype i cervikale kreftceller. E6 fremmer p53-degradering ved et ubikvitin-proteasom-avhengig reaksjonsvei mens E7 forbinder med retinoblastom (pRb) protein og griper med sin binding til E2F [4], [5]. Dette resulterer i tap av Rb /E2F komplekser som fører til frigjøring av transkripsjonsfaktor E2F som induserer ekspresjon av celleproliferative gener [5].
Selv om dagens behandlingsmetoder kan kurere 80-95% av tidlig stadium og 60% av loco-regionalt avansert kreft, er fremdeles residiverende eller metastatisk sykdom et stort problem [6]. Nylig er komplementær og alternativ medisin (CAM) stadig mer populært som en chemopreventive tilnærming til ledelse, samt forebygging av kreft tilbakefall [7], [8]. Mer enn 60% av tiden anvendte anti-kreft legemidler er opprinnelig avledet fra naturlige kilder, slik som planter, marine organismer og mikroorganismer [9]. Ulike vitenskapelige studier, inkludert våre, har antydet muligheten av medisinske planter som anti-kreft narkotika kandidater [10], [11]. Vi har nylig rapportert anticancer potensialet i
kassiakanel plakater (kanel) i livmorhalskreft [12].
Ficus religiosa
L. familie Lauraceae, har vært mye brukt i tradisjonell medisin for ulike lidelser. De forskjellige deler har blitt brukt medisinsk i forskjellige former så vel som i kombinasjon med andre urter [13], [14]. Det har vist seg å oppvise forskjellige biologiske aktiviteter [14] inkludert sårheling [15], anti-bakterielle [16], anti-konvulsiv [17], anti-diabetiske [18], [19], anti-inflammatorisk [20] , acetyl- cholinesterase-hemmende aktivitet [21] og anti-angst aktivitet [22]. Den aceton ekstrakt av
F. Religiosa
bladene er blitt vist å indusere apoptose i brystkreftcellelinjer [14].
Vi har nylig rapportert antioksydant og cytotoksisk aktivitet av
F. religiosa
bark i livmorhalskreftceller [23]. I foreliggende studie har vi undersøkt den antatte molekylære mekanismen som ligger til grunn den antineoplastiske potensialet av det vandige ekstrakt av
F. religiosa product: (FR
aq) bark i livmorhalskreft. Våre data tyder på at Ficus hemmer veksten av livmorhalskreftcellelinjer, Siha og HeLa, ved å indusere cellesyklus og apoptose, henholdsvis. Interessant, FR
aq betydelig redusert uttrykk av virale teinene E6 og E7, og dermed tyder det terapeutiske potensialet i
F. religiosa
i livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Tissue kultur plasticware ble kjøpt fra BD Biosciences (CA, USA) og Axygen Scientific Inc ( CA, USA). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) pulver, penicillin og streptomycin ble oppnådd fra Invitrogen /Gibco (Grand Island, NY, USA). Føtalt bovint serum (FBS), 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-diphenylthiazolium-bromid (MTT), FCCP, Ionomycin og JC-1 ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ). Primært antistoff mot p53 (DO-1), p21 (187), caspase-3 (H-277), cytomegalovirus-C (7H8), Her-2 (F-11), pRb (C-15), ppRb (SER 807/811), HPV16 E6 /18 E6 (C1P5), HPV16 E7 (ED17), HPV18 E7 (N-19) eller tubulin (B-7) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA ). Annexin V-FITC apoptose kit # 3 ble kjøpt fra Invitrogen (CA, USA). Alle andre vanlige reagenser ble anskaffet fra Qualigens Fine Chemicals (Mumbai, India).
fremstillingen av vandige ekstrakt
Ficus religiosa plakater (FR
aq) og foreløpig phytochemical Undersøkelser
barken av Ficus
religiosa
L. ble samlet inn fra Pune District, Maharashtra, India og det ble bekreftet som beskrevet tidligere [23]. Bilaget prøven (MPCC 2417) av autentiske plantearter ble avsatt ved herbarium av medisinplanter Conservation Center (MPCC), Pune, Maharashtra, India. Barken ble veiet, pulverisert og ekstrahert i dobbelt destillert vann i en varmtvannsvifte som tidligere beskrevet [23], [24]. Den resulterende ekstrakt ble sentrifugert ved 13000 rpm i 15 min for å fjerne partikler. Supernatanten ble ytterligere filtersterilisert ved bruk av Swiney filter (porestørrelse 0,45 um), og det resulterende filtrat ble lagret i alikvoter ved -80 ° C inntil bruk. Utbyttet av det tørkede ekstrakt utvunnet fra utgangs-råmaterialet var 8,6% (vekt /vekt). Den nylagde FR
aq ekstrakt ble kvalitativt undersøkt for tilstedeværelse av flavonoider, fenoler, saponiner, tanniner og karbohydrater ved hjelp av standard prosedyrer for analyse [25].
Cell Culture
Den menneskelige livmorhalskreft cellelinjer, Siha (HPV-16), ble HeLa (HPV-18) og C33A (HPV-negative) hentet fra Nasjonalt Senter for Cell Science (NCCer), Pune, Maharashtra, India. Cellene ble dyrket i DMEM supplementert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, og antibiotika (100 enheter /ml penicillin og streptomycin). Cellene ble inkubert i en fuktet 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
Cell Growth Analysis
Assayet ble utført som tidligere beskrevet [12]. Kort sagt ble Siha og HeLa-celler sådd med en tetthet på 1 x 10
5 og 1,5 x 10
5 celler /ml, henholdsvis i 24-brønners plater i triplikater. Neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml) for 24, 48 og 72 timer. Cellene ble høstet og tellet for levedyktighet ved bruk av trypan-blått fargestoff ekskluderingsmetoden [12], [26].
Cellevekst i ett lag
Assayet ble utført som tidligere beskrevet [12]. Kort sagt ble Siha og HeLa-celler sådd ut i en tetthet såing av 1 x 10
3 celler /ml i 6-brønns plater. Etter 24 timer ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml), etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i en uke i nærvær av ekstraktet . Dette ble fulgt av fiksering av koloniene med 4% paraformaldehyd og farging med 0,5% krystallfiolett. Koloniene ble fotografert med Sony DSC-S75 Cyber-shot-kameraet.
Cell Vekst i Soft Agar analysen
Analysen ble utført som beskrevet tidligere [12], [26]. I korthet Siha og HeLa-celler (5 x 10
3 celler /ml) sammen med forskjellige konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml) ble blandet med 0,35% agarose (DNA-kvalitet, GIBCO-BRL) i full DMEM-medium ved 40 ° C og gelert ved romtemperatur i 20 min i løpet av en på forhånd gelert lag med 0,5% agarose i komplett medium i 6-brønns plater. Etter inkubasjon i to uker, ble koloniene telles i 10 forskjellige felt ved hjelp av en Axiovert 200 M mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og gjennomsnittlig verdi ble beregnet.
Wound Healing analysen
Begge Siha og HeLa-celler ble sådd ut ved en tetthet på 4 x 10
5 /ml i 24-brønners plater og fikk lov til å holde seg over natten ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. Neste dag ble cellene sultet for serum i 6 timer, fulgt av tilsetning av komplett medium med eller uten FR
vandig (0-80 ug /ml). En kunstig sår ble laget på plater inneholdende behandlede og ubehandlede celler med et 10 ul mikropipette spissen og såret ble tillatt å gro i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. Bildene til 0 h samt 16 timer ble fanget ved hjelp av Axiovert 200 M mikroskop. Den gjennomsnittlige grad av sårheling ble evaluert ved å måle bredden av såret ved hjelp av ImageJ 1.44p [27].
Matrigel transmembran Invasion Assay
For invasjonsstudier, 24-brønners BioCoat Matrigel invasjon Chambers (BD Biovitenskap, Bedford, MA) ble brukt [28]. Siha og HeLa-celler (5 x 10
4) med eller uten FR
aq behandling (0-80 ug /ml) ble sådd i serumfritt medium inn i de øvre kamrene invasjons og tillatt å invadere over Matrigel- belagt membran i 24 timer. Mediet inneholdende 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer som fungerte som et lokkemiddel chemo. Etter 24 timers inkubering, ble ikke-invaderende celler fjernet fra toppen av hver membran med våte bomullspinner; invaderende celler festet til bunnen av membranen ble fiksert med 4% formalin og farget ved anvendelse av 0,5% krystallfiolett. Celle tallene ble telt i ti tilfeldig høy effekt (× 20) felt ved hjelp Axiovert 200 M mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) er utstyrt med en Sony Cyber-shot 3,3 megapiksler kamera.
Gelatin Zymografi
aktiviteten til MMP-2 i det kondisjonerte mediet ble bestemt ved gelatin zymografi som tidligere beskrevet [12]. Kort sagt ble Siha og HeLa-celler sådd ut ved en tetthet på 4 x 10
5 celler /ml i 6-brønners plater og tillatt å forholde seg over natten ved 37 ° C i 5% CO
2 inkubator. Neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml) fremstilt i serumfritt medium og inkubert i 24 timer. Den følgende dag, kulturmediet ble oppsamlet og sentrifugert ved 14000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C for å fjerne cellerester. Det kondisjonerte medium fra kontrollcellene, så vel som celler behandlet med FR
aq ble oppsamlet og konsentrert i Centricon YM-30-rør (Millipore, MA). Prøvene som inneholdt en lik mengde av totale proteiner, ble blandet med prøvebuffer (2% SDS, 25% glycerol, 0,1% bromfenolblått og 60 mM Tris-HCl, pH 6,8) og underkastet under ikke-reduserende betingelser på 7,5% SDS- polyakrylamid gel inneholdende gelatin (0,5 mg /ml). Etter elektroforese ble gelen vasket med 0,25% Triton X-100 og inkubert over natten ved 37 ° C i buffer inneholdende 150 mM NaCl, 100 mM CaCl
2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% Triton X- 100, 0,02% NaN
3. Gelen ble farget med fargeløsning (0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 i 40% isopropanol) og avfarget i 7% eddiksyre. Gelatinolytisk aktivitet ble detektert som ufargede bånd mot blå bakgrunn. Kvantifisering av band i kontroll og behandlede prøver ble utført ved densitometrisk analyse på Alpha Imager bruker Alpha Brukervennlighet FC programvare, Alpha Innotech.
Immunoblotting
HeLa og Siha celler ble sådd ut i en seeding tetthet av 4 x 10
5 celler /ml i 6-brønners plater og tillatt å forholde seg over natten ved 37 ° C i CO
2 inkubator. Neste dag ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml) og inkubert i 24 timer. Etter inkubering ble cellene høstet ved trypsinering, vasket med 1 x PBS og protein ble ekstrahert som tidligere beskrevet [12]. Kort sagt ble cellepelletene resuspendert i 60 ul lyseringsbuffer inneholdende 50 mMTris (pH 7,4), 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin (Pro-ren Amersco , Solon, USA), 1 ug /ml pepstatin (Amresco, Solon, USA), 150 mM NaCl, 0,5 ug /ml aprotinin (Amersco, Solon, USA) og protease-inhibitor cocktail (Roche, Lewes, UK) og inkubert på is i 1 time med intermitterende blanding. Ekstraktet ble sentrifugert i 20 minutter ved 4 ° C ved 12 000 rpm. For cytokrom-c release, ble cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner fremstilt som beskrevet tidligere [29]. Proteinet ble beregnet ved hjelp av Bradford reagens (Biorad Laboratories Inc, CA, USA). Lik mengde protein ble applisert på enten 10% eller 12% (for E6 protein) SDS-polyakrylamid-gel og overført elektroforetisk til Amersham Hybond-P PVDF-membran (GE Healthcare, UK) i natriumfosfatbuffer (pH 6,8). Membranen ble blokkert i 5% BSA i TST og inkubert ved 4 ° C over natt med primært antistoff mot p53, p21, caspase-3, cytomegalovirus-c, Her-2, pRb, ppRb, HPV16 E6 /18 E6, HPV16 E7, HPV18 E7 eller tubulin (Santacruz, CA, USA) ved en 1:500 fortynning. Membranen ble vasket i TST og inkubert med sekundær IgG-HRP-konjugat ved 1:5000 fortynning. Proteinene ble visualisert med en chemiluminescence kit (Amersham ECL Advance western blotting deteksjon kit, GE Healthcare, UK) og densitometry analyse ble utført på skannede Immunoblotanalyse bilder ved hjelp av bilde J gel analyseverktøy.
Vurdering av cellesyklus arrest
for cellesyklusanalyse, HeLa, Siha og C33A cellelinjer ble platet ved en seeding tetthet på 5 x 10
5-celler /brønn på 6-brønners plater og tillatt å holde seg i 24 timer ved 37 ° C i CO
2 inkubator. Neste dag ble cellene behandlet med FR
vandig (0-80 ug /ml) i 24 timer. Cellene ble høstet ved trypsinering og fiksert i iskald 70% etanol ved -20 ° C i 30 minutter. Etter vasking med 1 x PBS, ble cellene behandlet med RNase A (100 mg /ml) ved romtemperatur i 30 minutter og farget med PI (20 ug /ml). Fargede celler ble analysert for DNA-PI fluorescens ved hjelp av et flowcytometer (FACS Calibur, BD). Et minimum på 10.000 hendelser ble tellet per prøve; Dataene ble analysert ved hjelp av FACS Calibur-celle søken programvare (Becton Dickinson) for de andelene av cellene i G
0 /G
1, S-fasen og G
2 /M-fasene av cellesyklusen.
Vurdering av apoptose
for å bestemme antall celler gjennomgår apoptose på FR
aq behandling, HeLa, Siha og C33A ble belagt med en seeding tetthet på 5 × 10
5 celler /brønn i 6-brønners plater og fikk vokse over natten ved 37 ° C i CO
2 inkubator. Neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml) og inkubert i 24 timer. Cellene ble farget med Annexin V-FITC i henhold til produsentens instruksjoner (Annexin V-FITC apoptose kit # 3, Invitrogen, Grand Island, New York). Totalt 10.000 hendelsene ble kjøpt og dual parameter prikkplott av FL2-H (X-aksen, PI fluorescens, lineær skala) versus FL1-H (Y-aksen, Annexin V-FITC-fluorescens, linearscale) ble registrert. Dataene ble analysert ved hjelp av FACS CaliburCell quest programvare (Becton Dickinson).
Analyse av mitokondriemembranen potensial (Δψm)
Flowcytometri analyse ble utført på celler ved hjelp av JC-1 fargestoff som beskrevet tidligere [12]. HeLa-celler ble sådd ut ved en tetthet såing av 5 x 10
5 celler /brønn i 6-brønners plater og tillatt å holde seg over natten ved 37 ° C i CO
2 inkubator. Neste dag ble cellene behandlet med FR
vandig (0-80 ug /ml) i 24 timer. Dette ble etterfulgt av høsting av cellene, vasket to ganger med 1 x PBS, etterfulgt av inkubasjon med friskt kulturmedium inneholdende JC-1 fargestoff (2,5 ug /ml) i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Fargede celler ble vasket to ganger med iskald 1 x PBS, resuspendert i 1 ml 1 x PBS og analysert med hensyn på Δψ
m
ved strømningscytometri. FCCP (10 uM) ble anvendt som en positiv kontroll. Et minimum på 10.000 hendelser ble tellet per prøve og fluorescensstyrkene ble målt ved 527 nm (grønn) og 590 nm (rød).
Påvisning av intracellulært kalsium ved hjelp av Fluo-3 /AM
HeLa-celler ble sådd ut ved en tetthet såing av 5 x 10
5-celler /brønn i 6-brønns plate og tillatt å holde seg over natten. Neste dag ble cellene behandlet FR
vandig (0-80 ug /ml) i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. Etter inkuberingen, ble intracellulær Ca
2 + nivåer analysert ved strømningscytometri, som beskrevet tidligere [12]. I korthet ble cellene ladet med 5 uM Fluo-3 /AM (Sigma, St. Louis, MO) og 100 ug /ml Pluronic F127 (Sigma, St. Louis, MO) i sentrifugerør og inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 1 time i mørke. Cellene ble suspendert på nytt etter hver 20 minutter for å sikre jevn farge lasting. Cellepelletene ble vasket to ganger med 0,9% saltvann og resuspendert i 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i FACS-rør. Ionomycin (30 uM) ble anvendt som en positiv kontroll. Fluorescensintensiteter ble målt ved 525 nm ved hjelp av FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) for å oppnå basislinjeavlesninger. Gjennomsnittlig kanalfluorescens intensiteter ble beregnet ved hjelp av Cellquest-programvare.
Statistical Analysis
Alle forsøkene ble utført in triplo og gjentatt minst tre ganger og dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Statistisk analyse ble utført med SigmaStat 3,5 program (Systat Software, Inc.) ved hjelp av enveis ANOVA med α = 0,05.
Resultater
Ficus modulerer Vekst Kinetics av livmorhalskreftceller
Vi har tidligere rapportert at
F. religiosa
viste betydelig antioksidant potensial samt cytotoksisitet i livmorhalskreft cellelinjer, HeLa og Siha [22]. Basert på den valgte vi ikke-cytotoksiske konsentrasjoner av FR
vandig (0-80 ug /ml) for Siha (HPV-16) og HeLa (HPV-18) i våre analyser. Det ble observert at FR
vandig minsket veksten av cellene i et dose- og tidsavhengig måte. I Siha, FR
vandig redusert cellevekst ved 80 ug /ml konsentrasjon av ~4.78- (p = 0,008), ~4.72- (p = 0,001) og ~3.42 ganger (p = 0,053) ved 24, 48 og 72 timer henholdsvis, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 1A). Tilsvarende, ved 80 ug /ml konsentrasjon av FR
aq, HeLa-celler oppviste ~5.53- (p≤0.001), ~5.94- (p = 0,010) og ~6.37 ganger (p = 0,001) reduksjon i cellevekst ved 24, 48 og 72 timer henholdsvis, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 1B). Dette ble ytterligere understøttet av kolonidannelse og myk-agar-analyser, karakterisert ved at en doseavhengig reduksjon i antall kolonier ble observert i både den cervikale kreftcellelinjer (figur 1C og D, henholdsvis). Interessant, ved 80 ug /ml konsentrasjon, FR
vandig betydelig redusert antall kolonier i HeLa (~4.97 fold, p≤0.001) og Siha (~2.95 fold; p≤0.001) i forhold til sine respektive ubehandlede kontrollceller ( Figur 1D). Dermed Ficus regulert vekstkinetikk av livmorhalskreftceller på en betydelig måte. Som en negativ kontroll, tok vi C33A (HPV-negative cellelinje) og analysert cytotoksisiteten til FR
aq i den. Ficus fremkalte ikke noen cytotoksisitet opp til 160 mikrogram /ml konsentrasjon i C33A celler, som var lik den som ble observert i Siha og HeLa (figur S1). Imidlertid, ved høyere konsentrasjoner, FR
aq indusert cytotoksisitet i alle tre cellelinjer, karakterisert ved at HeLa-celler og C33A viste lignende cytotoksisk effekt.
Siha (A) og HeLa (B) ble behandlet med FR
vandig (0-80 ug /ml) i 24-72 t og antallet levedyktige celler ble tellet ved bruk av trypan-blått fargestoff utelukkelse metode. Data representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (C) livmorhalskreftcellelinjer (Siha og HeLa) ble behandlet med FR
aq (0-80 mikrogram /ml) for en uke. Koloniene ble farget med krystallfiolett og fotograferte. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. (D) både Siha og HeLa (5 x 10
3) sammen med FR
vandig (0-80 ug /ml) ble dyrket i bløt agar i to uker. Kolonier ble tellet fra minst 10 forskjellige områder, og gjennomsnittet av hver er plottet. Dataene representerer gjennomsnitt ± SD av fem uavhengige eksperimenter.
Ficus induserer G
1 fase Arrest i Siha og endrer Expression of Cell Cycle regulatoriske proteiner
For å analysere mekanismen bak Ficus medierte regulering av vekstkinetikk i cervikale kreftceller, undersøkte vi cellesyklusfordelingen i Siha, HeLa og C33A. Strømningscytometri-analyse viste at i nærvær av FR
aq, Siha utviste en økning i G
en populasjon med en samtidig reduksjon i S-fasen på en doseavhengig måte (figur 2A). Interessant, ved 80 ug /ml konsentrasjon, var det en økning i prosentandelen av celler i G
en fase (59,88 til 72,33%) med en samtidig reduksjon i S-fasen populasjonen (15,98 til 8,50%, p 0,050). På den annen side, i HeLa, var det en betydelig økning i sub-G
0 populasjonen (3,65 til 87,38%, p 0,001) som indikerer apoptotisk populasjonen (fig S2). Interessant, ved ikke-toksiske doser, FR
aq påvirket ikke veksten av HPV-negative C33A celler (figur S2).
Siha celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av FR
aq (0- 80 ug /ml) i 24 timer. (A) Forbedret akkumulering av cellene i G
1 fase med en samtidig reduksjon i S-fase populasjon ble observert etter behandling med Ficus (som indikert ved histogrammer). Western blot viser uttrykket nivåer av p53 og pRb (B), så vel som p21 og ppRb (C). Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (D, E) Densitometrisk analyse av western blot viser ganger endring i proteinnivå på FR
aqtreatment. Båndene ble kvantifisert ved densitometri skanning ved hjelp ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij). Dataene representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
Vi undersøkte mekanismen for G
1 /S fase arrest i Siha ved å evaluere uttrykk for G
1 sjekkpunkt proteiner som p53, pRb, fosfor Rb (ppRb) og p21. Det var en signifikant økning i ekspresjonen av p53 (figur 2B og D), så vel som dens nedstrøms effektor, p21 (figur 2C og E) etter behandling av cellene med FR
aq. Ekspresjon av pRb ble analysert siden defosforylert pRb er kjent for å danne komplekser med E2F for å undertrykke transkripsjon av celleproliferative gener [30]. FR
aq, økt betydelig ekspresjon av pRb (Figur 2B og D) med en samtidig reduksjon i nivåene av ppRb (figur 2C og E) på en doseavhengig måte. Disse resultatene tyder på at Ficus indusert G
1 /S arrest i Siha ved å modulere uttrykk for cellesyklusregulerende proteiner.
Ficus induserer apoptose i HeLa gjennom Økning i Cyt c og caspase 3 Expression
Vi fant at i HeLa, Ficus behandlingen resulterte i økning i antallet celler i sub-G
0-fase, en indikasjon på apoptotisk populasjonen (figur S2). Ved farging med Annexin V-FITC, cellene viste en doseavhengig økning i både tidlig og sen apoptotisk cellepopulasjon (figur 3A). Interessant, ved 80 ug /ml FR
aq konsentrasjon, var det ~4.4 ganger (p≤0.050) og ~5.5 ganger (p≤0.050) vekst i både tidlig og sen apoptotisk cellepopulasjon, sammenlignet til de ubehandlede kontrollceller. På den annen side ble det ikke observert apoptose i FR
aq behandlet Siha eller C33A celler (figur S3).
(A) Representative FACS piktogrammer av celler behandlet med FR
aq (0-80 ug /ml) er vist. Prosent av annexin V-positive (tidlig-apoptotiske celler, nedre høyre kvadrant) og Annexin V /PI-dobbel-positive celler (sen-apoptotiske celler, øvre høyre kvadrant) er indikert. (B) flowcytometrisk analyse av den raske kalsium frigivelse i HeLa-celler etter behandling med FR
vandig (0-80 ug /ml) er blitt vist. Ionomycin ble anvendt som en positiv kontroll. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (C) FACS-analyse følgende JC-1-farging av HeLa viste endring av mitokondriemembranpotensialet etter FR
vandig (0-80 ug /ml) behandling sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (D) Western blot viser ekspresjon av cytokrom c fra cytosoliske fraksjon. Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (E) Totalt protein ble isolert og analysert for ekspresjon av p53 og caspase 3 ved immunblotting. Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (F og G) Densitometrisk analyse av western blot som viser gangers forandring i proteinnivåer. Båndene ble kvantifisert ved hjelp ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
Vi studerte Ca
2+ signaleringsmekanisme i celler behandlet med FR
aq og observert at den induserte en doseavhengig økning i de intracellulære kalsiumnivåer (figur 3B). Ionomycin ble anvendt som en positiv kontroll. Interessant var økningen i intracellulær kalsium resulterte i ødeleggelse av mitokondriemembranpotensialet (Δψm) som ble observert ved reduksjon i antallet røde fluorescens intensitet, etter farging av cellene med JC-1 fargestoff (figur 3C). Det var ~3 gangers reduksjon i den røde fluorescens-intensitet (p≤0.001) ved 80 ug /ml konsentrasjon av FR
aq. FCCP ble anvendt som en positiv kontroll i studien. Den mitokondriemembranen depolarisering ble forbundet med en doseavhengig økning i cytosol-cytokrom c (figur 3D og F), som ble fulgt av en økning i ekspresjon av caspase 3 og p53 (figur 3E og G). Disse resultatene indikerer at Ficus indusert apoptose i HeLa gjennom mitokondrieavhengig veien.
Ficus Reduserer invasjon og migrasjon av Siha og HeLa
sårtilheling analysen ble utført i begge cellelinjene, og det ble observert at ficus effektivt hemmet migrering av både Siha (figur 4A) og HeLa (figur 4B) i en dose- og tidsavhengig måte sammenlignet med ubehandlede kontrollceller. Etter 16 timer, de ubehandlede Siha og HeLa-celler som var i stand til å dekke opp ~82% av såret, mens ved 80 ug /ml FR
aq behandling, cellene dekket såret ved å ~33% (p 0,001 ) og 22% (p 0,001), henholdsvis (figur 4C). På denne bestemte dosen, Ficus redusert invasiv evnen til både Siha og HeLa av ~2.45- (p≤0.001) og ~3.8-folder (p≤0.001), respektivt, sammenlignet med de ubehandlede kontrollcellene (figur 4D).
Analyse av cellemigrering i Siha (A) og HeLa (B) ble behandlet med FR
vandig (0-80 ug /ml) ble målt ved sårhelende analysen. Den øvre panel av bildet viser såret laget ved 0 timer. Det nedre panel viser migrering av celler svarende til den distanse på 16 timer. (C) Grafisk fremstilling av sårlukking i Siha og HeLa-celler 16 timer etter FR
aq behandling har vist. Verdier ble representert som en prosent til lukking av sår og uttrykt som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (D) Celle invasjon assay som viser prosentandelen av celler invaderte hvert felt i nærvær eller fravær av FR
aq. De invaderte celler ble talt i ti tilfeldige felt og verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. (E) Gelatin zymografi som viser nedregulering av MMP-2-ekspresjon i FR
vandig (0-80 ug /ml) som ble behandlet Siha og HeLa. (F) Western blot-analyse som viser nedgang i Her-2-ekspresjon i HeLa Siha og behandlet med FR
vandig (0-80 ug /ml). Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (G) Densitometrisk analyse av western blot viser ganger endring i HER-2 proteinnivåer i Siha og HeLa. Båndene ble kvantifisert ved densitometri hjelp ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).
Det er vel kjent at økt uttrykk av MMP’er i tumorvev er assosiert med kreftcelle matriksdegradering, invasjon og metastase [31]. Vi observerte at FR
aq signifikant nedregulert uttrykk av MMP-2 i begge Siha og HeLa-celler (figur 4E) sammenlignet med de ubehandlede kontrollceller.
HER2 /
neu
har blitt rapportert å forbedre den metastatisk potensial av kreftceller [32] og er positivt korrelert med MMP-2-ekspresjon [33]. Vi fant at FR
vandig redusert ekspresjon av HER-2 på en doseavhengig måte i både Siha og HeLa (figur 4F og G). Dataene tyder på at Ficus redusert migrasjon samt invasjon av livmorhalskreftceller ved å modulere uttrykk for HER-2 og MMP-2 proteiner.
Ficus Reduserer Expression of viral teinene E6 og E7
Siden, Ficus oppviste betydelig antineoplastisk potensial i både HPV16 (Siha) og HPV18 (HeLa) positive cellelinjer, undersøkte vi ekspresjonen av de virale proteinene E6 og E7 i de behandlede og ubehandlede celler. Det ble observert at, FR
vandig betydelig redusert ekspresjon av E6 og E7-oncoproteiner i både Siha og HeLa (figur 5A og B henholdsvis). Ved 80 ug /ml FR
aq konsentrasjon, ble ekspresjon av E6 og E7-proteinene ble redusert med ~3.0- (p≤0.001) og 3,7-folder (p≤0.001), respektivt, i Siha (figur 5A og C) og ved ~3.2- (p≤0.001) og 4,0-folder (p≤0.001), respektivt, i HeLa sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 5B og D). Dermed sank Ficus uttrykket av de virale teinene E6 og E7, som forsterker sin terapeutiske betydning i kreft regulering.
uttrykk for E6 og E7 teinene ble bestemt ved immunoblotting med E6 og E7 antistoffer i Siha (A) og HeLa (B) ble behandlet med FR
vandig (0-80 ug /ml). Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting.
