Abstract
Bakgrunn
Dagens behandlingsalternativer for castration- og behandlingsresistent prostatakreft er begrenset og nye tilnærminger er desperat behov. Vårt nylige resultater fra en systematisk kjemisk biologi følsomhet skjerm som dekker de fleste kjente medikamenter og stoff-lignende molekyler indikerte at aldehyd-dehydrogenase-inhibitor disulfiram er en av de mest potente kreftspesifikke inhibitorer av prostatacancer cellevekst, inkludert TMPRSS2-ERG-fusjons positive cancere. Men resultatene viste at disulfiram alene ikke blokkerer tumorvekst
in vivo
eller induserer apoptose
in vitro
, noe som indikerer at kombinatoriske metoder kan være nødvendig for å forbedre de antineoplastiske effekter.
Metoder og funn
i denne studien benyttet vi en kjemisk biologi narkotika følsomhet skjermen for å utforske disulfiram mekanistiske detaljer og for å identifisere forbindelser poten effekten av disulfiram i TMPRSS2-ERG fusion positive prostata kreft celler. I alt ble 3357 forbindelser inkludert nåværende kjemoterapeutika samt narkotika som små molekylære forbindelser screenet alene og i kombinasjon med disulfiram. Interessant, resultatene indikerte at androgene og antioksidative forbindelser antagoniseres disulfiram virkning, mens inhibitorer av reseptor-tyrosin-kinase, proteosomet, topoisomerase II, glukosylceramidsyntase eller cellesyklusen var blant forbindelsene sensibiliserende prostata kreftceller til å disulfiram. Kombinasjonen av disulfiram og en antiangiogen middel sunitinib ble studert i mer detalj, siden begge er allerede i klinisk anvendelse i mennesker. Disulfiram-sunitinib kombinasjon indusert apoptose og redusert androgen receptor protein ekspresjon mer enn hver av forbindelsene alene. Videre kombi eksponeringen redusert metastatiske egenskaper som cellemigrasjon og 3D celle invasjon samt indusert epitelial differensiering vist som forhøyet E-cadherin uttrykk.
Konklusjoner
Til sammen våre resultater foreslå ny kombi fremgangsmåter for å hemme prostatacancer-cellevekst. Disulfiram-sunitinib Kombinasjonen ble identifisert som en av de potente synergis tilnærminger. Siden sunitinib alene har blitt rapportert å mangle effekt på prostatakreft kliniske studier, våre resultater gir en begrunnelse for ny kombinatorisk tilnærming til å målrette prostata kreft mer effektivt
Citation. Ketola K, Kallioniemi O, Iljin K (2012) kjemisk Biology Drug Sensitivity Screen Identifiserer Sunitinib som Synergistic Agent med Disulfiram i prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (12): e51470. doi: 10,1371 /journal.pone.0051470
Redaktør: Jun Liu, Johns Hopkins School of Medicine, USA
mottatt: Mai 29, 2012; Godkjent: 06.11.2012; Publisert: 12.12.2012
Copyright: © 2012 Ketola et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var gitt av EU-PRIMA prosjektet (kontrakt # LSHC-CT-204-504587), Kreft Organisasjoner fra Finland, Sigrid Juselius Foundation og Academy of Finland. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall i mannlige befolkningen i den vestlige verden [1]. Siden de fleste pasienter med prostatakreft hvert bli resistente mot tiden eksisterende legemidler som anti-androgener og senere også til cytotoksiske midler, er nye medikamenter og kombinatoriske tilnærminger nødvendig. Vi har nylig utført en kjemisk biologi sammensatte skjermen til systemisk teste følsomheten til 4910 kjente legemidler og narkotika-lignende små molekyler i ikke-maligne og maligne prostatakreftceller [2]. Aldehyd dehydrogenase (ALDH) hemmer disulfiram var blant fire kreft selektive hemmere identifisert blokkerer veksten av kultiverte TMPRSS2-ERG fusion positive Vcap celler ved nanomolar konsentrasjon samt redusere Vcap xenograft vekst
in vivo product: [2]. Nylig har veksten hemmende potensialet av disulfiram i prostatakreft blitt bekreftet i en uavhengig high-throughput sammensatt skjerm
in vitro Kjøpe og xenograft studier
in vivo product: [3], [4].
Disulfiram er en ALDH inhibitor som har vært langsiktig brukt som en alkohol avskrekkende på klinikkene. I tillegg til prostatakreft, er disulfiram også blitt vist å ha anticancer virkning i bryst, myelom, leukemi, lungecancer, cervical adenokarsinom, melanom, neuroblastom og tykktarmskreft [5] – [11]. Foreløpig er disulfiram i fase I kliniske studier med metastatisk melanom, i hormon ildfaste kreft med lunge- og levermetastaser (www.clinicaltrials.gov, identifikator NCT00256230 og NCT00742911) samt i prostatakreft (identifikator: NCT01118741). I dyrkede prostata kreft celler, induserer disulfiram oksidativt stress, reduserer ALDH og DNA metyltransferase (DNMT) aktiviteter samt hemmer DNA replikasjon [2], [4], [12]. Brystkreft, disulfiram og kobber co-eksponering inhiberer NF-kB aktivitet, øker reaktive oksygenarter og antall kreft stamceller (CSC) [13]. Videre inhibering av ALDH-aktivitet har blitt foreslått som en potensiell bety for å redusere kreft stamceller og for å overvinne resistens [14]. Våre tidligere resultater indikerte at selv om disulfiram redusert Vcap celle xenograft vekst ca 40%, det var ikke i stand til å blokkere det [2]. Lignende resultater er oppnådd i i menneskelig bein metastatisk LNCaP C4-2B xenografter [4]. I tillegg, disulfiram eksponering alene var ikke tilstrekkelig til å indusere apoptose i prostatakreftceller [2]. Således, i denne studien, utførte vi en kombinatorisk følsomhet skjerm i ERG positiv prostatakreftceller for å utforske disulfiram mekanismen i mer detalj. Videre var målet å identifisere potensielle agenter synergizing med disulfiram i prostatakreftceller. I alt ble 3357 forbindelser inkludert nåværende kjemoterapeutika og narkotika som små molekylære forbindelser studerte alene og i kombinasjon med disulfiram. De molekylære og fenotypiske endringer ble undersøkt med en av de mest potente disulfiram sensitive, sunitinib.
Materialer og metoder
Cells
TMPRSS2-ERG
genet fusjon og AR positiv prostata carcinom cellelinje Vcap ble mottatt fra legene. Adrie van Bokhoven (University of Colorado Health Sciences Center, Denver, Colorado) og Kenneth Pienta (University of Michigan, Michigan) og ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium [15]. Prostatakarsinom PC-3 celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Borås, Sverige) og dyrket i henhold til leverandørens anvisninger.
Loess-normalisert CellTiter-Glo resultater med 3357 forbindelser screenet i fravær ( y-aksen) og nærvær (x-aksen) av disulfiram (EF
50 90 nM) i VCap prostatakreftceller. Hver prikk representerer resultat oppnås med en sammensatt. Datapunkter som kvalifiserer som disulfiram sensibiliserende (firkanter under trendlinje) og redning (trekanter over trendlinjen) forbindelser er indikert. Resultat med sunitinib er angitt med en pil.
Forbindelser
Disulfiram ble kjøpt fra Fluka (München, Tyskland) og fortynnet i DMSO. Sunitinib ble kjøpt fra LC Laboratories (Woburn, USA) og fortynnet i DMSO.
High-throughput forbindelse Sensitivity Screen
En høy gjennomstrømming sammensatte følsomhet skjerm med biblioteket i 3357 forbindelser alene og i kombinasjon med disulfiram ble utført i VCap-celler. Biblioteket inkludert nåværende kjemoterapeutika og små molekylære forbindelser av kommersielle sammensatte biblioteker LOPAC (1280 eksisterende Food and Drug Administration-godkjent medisiner og andre forbindelser med farmakologisk relevante strukturer, 1 og 0,1 mikromol /L), Microsource Spectrum (2000 forbindelser inkludert de fleste av de kjente narkotika og andre bioaktive forbindelser og naturlige produkter, en og 0,1 mikromol /l), og en inhouse bibliotek (77 eksperimentelle forbindelser, 10, 1 og 0,1 mikromol /L). I skjermen, ble EC
50 verdi av disulfiram (90 nM) anvendt. Cellelevedyktigheten ble bestemt etter 3 dagers inkubering ved anvendelse av en CellTiter-Glo (CTG) fluorescerende cellenes levedyktighet assay (Promega, Inc.). De celleviabilitet Resultatene ble normalisert ved anvendelse av en løss metode som tidligere beskrevet [2]. Forbindelsene som kvalifiserte som treffer hemmet celleviabilitet av minst tre standardavvik fra medianen av DMSO kontrollene.
Cell Livskraftig og apoptose Analyser
Cell levedyktighet og apoptose ble utført på 384-brønners plater (Falcon). 2.000 celler per brønn ble belagt i 35 mL av deres respektive vekstmedier og venstre for å feste natten. Sammensatte fortynninger ble tilsatt til cellene i 15 ul og inkubert i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse CTG cellenes levedyktighet assay (Promega, Inc.). Induksjon av caspase-3 og 7 aktiviteter ble oppdaget med homogen Apo-ONE-analysen (Promega, Madison, WI). Celleviabilitet og apoptose-analyser ble deretter utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, i celleviabilitet analysen, 25 ul av aktivert CTG reagens ble tilsatt til hver brønn, ble platen inkubert i 30 minutter ved RT /150 rpm og luminescens signal (700 nm) ble kvantifisert ved bruk av Envision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, Massachusetts, MA). For den apoptose-analysen, ble 25 ul av mediet tatt ut fra hver brønn og 25 ul av ApoONE-reagens ble tilsatt til hver brønn. Platen ble inkubert i 2 timer ved RT og den fluorometriske signal (eksitasjon FITC 499 nm, emisjon 521 nm FITC) ble kvantifisert ved bruk av Envision Multilabel Plate Reader. Den gjennomsnittlige luminescens eller fluorometrisk signal fra de seks replikere sammensatte behandlede brønner ble delt på gjennomsnittlig signal på seks DMSO kjøretøy kontroll behandles brønner for å bestemme fold endringer.
Relative Celleviabilitet resultater i A) Vcap og B) PC- tre prostatakreftceller, så vel som i ikke-ondartet C) RWPE-1 og D) EP156T celler. Stjerner indikerer statistisk signifikans: *, P 0,05; **, P 0,01; og ***, P . 0.005
Statistiske analyser
treffet kriteriene i forbindelse skjermen (skår lavere enn -3 SD fra medianen) tilsvarer en P-verdi av 0,05; **, P 0,01; og ***, P . 0.005
Fastsettelse av Kombinatoriske stoffet effekter
Naturen av samhandling og graden av synergi mellom disulfiram og sunitinib ble analysert ved hjelp av kombinasjonen indeksmetoden [16]. Konsentrasjonen avhengighet av antiproliferative effekter ble bestemt for begge forbindelser, enten alene eller i kombinasjon. Fraksjon påvirket (Fa) ble definert som den fraksjon av celler som påvirkes av gitt konsentrasjon av forbindelser alene eller i kombinasjon. Fa = 0 ble fastsatt på grunnlag av DMSO kontroll og Fa = 1 på staurosporin (1 mm) respons (ingen levedyktige celler til venstre). Dataene ble analysert med Calcusyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK), og kombinasjonen indeks (CI) ble beregnet ut fra medianeffekt tomter i henhold til ligning KI = (D) 1 /(DX) 1+ (D) 2 /( DX) 2, hvor (DX) 1 og (DX) 2 er konsentrasjonene av forbindelsene D1 og D2 er nødvendig for å fremstille et gitt nivå av antiproliferativ effekt når de brukes alene, mens (D) 1 og (D) 2 er deres konsentrasjoner som produserer den samme virkning når de anvendes i kombinasjon. En kombinasjon indeks over 0,9-1,1 indikerer additiv interaksjon, verdier under 0,9 indikerer synergisme, og verdier over 1,1 indikerer antagonisme.
A) Cell morfologi i respons til disulfiram (1 mm) og sunitinib (5 mikrometer) eksponeringer alene og i kombinasjon. B) Presentasjon av kombinasjonen indeks (CI) og fraksjon av celler påvirkes (Fa) av sammensatte eksponeringer i ulike konsentrasjoner (500 nM, 1fiM, 5 mikrometer og 10 mm) i Vcap prostatakreftceller. CI-verdier for hver konsentrasjon: 500 pM: 0,92, 1 uM: 0,19, 5 um: 0,21, 10 uM: 0,40. C) caspase 3/7 aktiviteter i respons til sammensatte eksponeringer. Stjerner indikerer statistisk signifikans. ***, P 0,005
RNA Utvinning og kvantitativ revers transkriptase PCR
Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler ved hjelp RNeasy (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. Revers transkripsjon ved å bruke 500 ng totalt RNA ble utført ved anvendelse av Applied Biosystems cDNA syntese kit. TAQMAN genuttrykk prober og primere fra Universal Probe Library (Roche Diagnostics, Espoo, Finland) ble brukt til å studere androgen reseptor (AR), prostataspesifikt antigen (PSA), ERG, MYC og β-aktin mRNA uttrykk. Primer sekvenser er oppført i tabell S1. Sanntids kvantitativ PCR ble utført ved anvendelse av ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Kvantifisering ble utført ved hjelp av
ΔΔCT metode med RQ Manager 1.2-programvare (Applied Biosystems). β-aktin ble benyttet som en endogen kontroll. Gjennomsnitt ekspresjon av DMSO eksponerte kontrollprøvene ble ansett for beregning av folde endringer. To til fire replikate prøver ble undersøkt for kvantifisering av mRNA uttrykk.
Western Blot analyse og subcellulære Proteome Utvinning
For protein utvinning og Western blot analyse, ble Vcap celler belagt med 70% konfluens og venstre å feste over natten før behandlinger. Hel-celle-lysater ble fremstilt ved anvendelse av lyseringsbuffer (62,5 mM Tris, 1% SDS, 5%, β-merkaptoetanol, 10% glycerol og bromfenolblått). Tre replikative prøvene ble undersøkt for kvantifisering av protein uttrykk. Spesifikke antistoffer som gjenkjenner AR (1:1000 fortynning, musmonoklonale, Labvision, Fremont, California) eller PSA (1:1000, kanin polyklonale, DakoCytomation, Danmark) ble brukt. β-aktin (1:4000, mus monoklonalt, Sigma) ble anvendt som en kontroll lasting. Signaler ble påvist med 1:4000 fortynninger av passende HRP-konjugert sekundære antistoffer (alt fra Invitrogen Molecular Probes, Carlsbad, California) etterfulgt av visualisering med den forbedrede kjemiluminescens reagens (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK). De oppnådde signalene ble densitometrically analysert med GeneTools programvare (Syngene, Synoptics Ltd, Cambridge, UK).
uttrykk for A) AR, B) PSA, C) ERG, D) MYC mRNA som respons på disulfiram ( DSF) og sunitinib (Su) eksponeringer alene og i kombinasjon. E) AR og PSA protein ekspresjon som reaksjon på sammensatte eksponeringer alene og i kombinasjon. F) Kvantifisering av AR-protein ekspresjon i respons til 6- og 24 timer sammensatte eksponeringer. Stjerner indikerer statistisk signifikans: *, P 0,05; **, P 0,01; og ***, P . 0.005
E-cadherin (rød) og F-aktin (gul) uttrykk som svar på sammensatte behandlinger. DNA ble farget med DAPI (blå).
immunfluorescens
Immunofluorescensanalyse farging av Vcap celler ble utført som beskrevet tidligere [12]. Bilder ble tatt med 63 × forstørrelse ved hjelp av en Zeiss Axiovert 200 M fluorescens mikroskop (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).
Wound Healing analysen
Effekten av disulfiram (1 mm) og sunitinib (5 uM) alene og i kombinasjon på prostatacancer cellemigrering ble studert ved bruk av et sårhelende analysen. PC-3 celler ble sådd ut på 96-brønners plater (Essen ImageLock, Essen Instruments, Birmingham, UK) og et sår ble ripet med sår scratcher (Essen Instruments). Forbindelser og hensiktsmessige kontroller ble lagt umiddelbart etter såret riper og sår samløpet ble overvåket med Incucyte live-Cell Imaging System og programvare (Essen Instruments). Sårheling ble målt hver time i 24 timer ved å sammenligne gjennomsnittlig relativ såret tetthet av tre biologiske replikater i hvert forsøk.
Celler ble automatisk fotografert en gang hver time etter såret skrape. Sårlukking virkning ble beregnet som vikles konfluens i respons 6-, 12- og 24 timer eksponering av forbindelsene A) sårtilheling som reaksjon på sammensatte eksponering i 24 timer. Svarte området representerer sårkantene i begynnelsen av analysen. B) Kvantifisering av celler som kommer inn i såret. Stjerner indikerer statistisk signifikans: *, P 0,05; **, P 0,01; og ***, P . 0.005
A) Cell morfologi i 3D spheroid analysen svar på sammensatte eksponeringer. B) Et område av celler i Incucyte bilder (% av totalt areal) som svar på sammensatte behandlinger. Stjerner indikerer statistisk signifikans. *, P 0,05
3D-analyse
Cellene ble dyrket i 3D på Matrigel på ubestrøket angiogenese u-lysbilder (Ibidi Gmbh, Tyskland). De nederste brønner ble fylt med 10 ul av Matrigel (50%) i kulturmedium og inkubert i 30 minutter i 37 ° C. De celler (1000 celler /brønn) ble så platet ut og la til å feste i 1-2 timer i 37 ° C. Det andre laget av Matrigel i kulturmedium (25%) ble tilsatt, og platene ble inkubert i 37 ° C. Disulfiram (1 mm), sunitinib (5 mm) eller disulfiram-sunitinib kombinasjonen ble lagt inn etter 4 dagers inkubasjon og vedlikeholdes i opptil 7 dager. Spheroids ble overvåket i sanntid av levende celle bildebehandling (Incucyte, Essen Instruments, 10 × objektiv), anskaffe en image /t. Arealet av 3D-strukturer i bildene ble sammenlignet med det totale bildeområdet (i prosent) for å kvantifisere mulige effekter av forbindelsene på cellevekst.
Resultater
Chemical Biology sammensatte Sensitivity Screen Identifiserer Synergistic agenter med Disulfiram
Kjemisk biologi sammensatte skjermen tilnærming ble benyttet for å studere mekanismen av disulfiram redusert celle levedyktighet i prostatakreftceller og å utforske potensielle synergi interaksjoner av disulfiram og skjermede forbindelser. Library of 3357 forbindelser inkludert de fleste av de kjente narkotika og narkotika-lignende små molekylære forbindelser ble screenet alene og i kombinasjon med disulfiram i Vcap prostatakreftceller. Cellelevedyktighetsresultatene i fravær (DMSO kontroll) eller nærvær av disulfiram (EC
50, 90 nM) ble sammenlignet. Som forventet, flere forbindelser hemmet VCap cellevekst (fig. 1). Imidlertid er bare 15 forbindelser viste en kombinert effekt med disulfiram. I alt seks forbindelser lysfølsomt VCap-celler til disulfiram: treo-1-fenyl-2-decanoylamino-3-morfolino-1-propanol-hydroklorid, bortezomib, CGP-74514A-hydroklorid, epirubicin hydroklorid, forbol 12-myristat 13-acetat og sunitinib ( tabell 1). I motsetning til dette, 9 forbindelsene reddet disulfiram indusert antiproliferativ virkning (tabell 2). Interessant nok har disse forbindelser inngår androgene forbindelser som 4-androsten-3,17-dion, 5-alfa-Androstane-3-alfa, 17-beta-diol og androsteron, så vel som antioksidant astaxanthin. Således indikerer resultatene at disulfiram redusert celleproliferasjon kan antagoniseres med androgen aktivering eller antioksidanter. Videre PKC aktivator forbol 12-myristat 13-acetat var blant stoffene sensitiverende effekt disulfiram og PKC inaktivator dequalinium analog, C-14 linkeren, var blant medikamenter redning disulfiram virkning, noe som indikerer at PKC kan spille en rolle i disulfiram respons. Videre kan disulfiram effekt forsterkes via inhibering av reseptor-tyrosin-kinaser, proteasomet, topoisomerase II, glukosylceramidsyntase eller cellesyklus (tabell 1), mens inhibering av epidermal vekstfaktor-reseptor synes ikke å være en potent strategi for å forsterke effekten av disulfiram (tabell 2).
sunitinib og Disulfiram Cotreatment Vis Synergi
Interessant, sunitinib, en anti-angiogene agent, forsterket disulfiram indusert veksthemmende effekt. Sunitinib hemmer aktiviteten av flere tyrosinkinaser så som VEGFR-1, -2 og -3, PDGFR-α og -β, c-Kit, Ret og Flt-3 [17]. Det har vist seg å ha anti-neoplastisk aktivitet i en rekke ondartede sykdommer slik som leverkreft, bukspyttkjertel nevroendokrine tumorer, og ikke-småcellet lungekreft. Sunitinib er lisensiert til metastatisk nyrecellekreft og gastrointestinale svulster [18] – [20]. I prostata cancer, sunitinib reduserer veksten av kastrering resistent prostatakreft, både i prekliniske og kliniske miljøer [21], [22]. Men en fersk fase III-studie av sunitinib i prostatakreft mislyktes på grunn av manglende effekt på kastrering resistent prostatakreft (identifikator: NCT00676650). Siden sunitinib har allerede blitt undersøkt i kliniske studier hos pasienter med prostatakreft, ble sunitinib-disulfiram kombinasjon valgt for videre
in vitro
studier.
For å validere kombi anti-proliferativ effekt av sunitinib i prostata kreftceller, kan effekten av disulfiram og sunitinib alene og i kombinasjon ble undersøkt i VCap og PC-3 prostata kreftceller. Resultatene indikerte at disulfiram og sunitinib co-eksponering redusert VCap cellenes levedyktighet mer enn hver av forbindelsene alene (figur 2A.). I PC-3 celler, ble anti-proliferativ effekt sett ved høye konsentrasjoner i respons til sunitinib eller disulfiram-sunitinib co-eksponering (Fig. 2B). For å finne ut om synergi i Vcap celler skyldes rett og slett på grunn av økt cytotoksisitet, ble effekten av disulfiram, sunitinib eller disulfiram-sunitinib co-eksponering studert i ikke-maligne RWPE-1 og EP156T prostata epitelceller. Resultatene viste at cellelevedyktigheten ble redusert bare ved høyeste (10 uM) konsentrasjon i RWPE-1 og EP156T celler (Fig. 2C og D), noe som indikerer at økningen i total celletoksisitet ikke forklarer kombinatorisk respons i VCap-celler.
for å sammenligne effektene av disulfiram (1 mm) og sunitinib (5 mm) alene og i kombinasjon med Vcap celle morfologi, ble Incucyte levende celle analyse utført. Celler ble eksponert for forbindelsene i 48 timer. Det ble ikke observert klare morfologiske endringer som respons på alle sammensatte eksponeringer (Fig. 3A). Spesielt sunitinib forårsaket celler som kan festes til hverandre siden ingen individuelle celler ble sett i sunitinib eksponerings celler. Som svar på disulfiram-sunitinib ko-behandling, ble cellene også forbundet med hverandre, men det var tydelig mindre levedyktige celler til venstre (fig. 3A). Kombinasjon indeks (CI) ble bestemt ved ulike legemiddelkonsentrasjoner (500 nM, 1fiM, 5 mikrometer og 10 mm) basert på celle levedyktighet resultater i Vcap celler. Resultatene indikerte at disulfiram og sunitinib viste synergisme ved alle konsentrasjoner som ble testet (CI 1) (Fig. 3B). Den laveste CI-verdier ble sett i konsentrasjoner på 1 uM og 5 uM (CI 0,19 og 0,21). Sunitinib konsentrasjon på 5 mikrometer ble valgt for ytterligere kombinasjons eksperimenter basert på CI og celleviabilitet resultater samt tidligere sunitinib
in vitro
studier i prostatakreftceller [23] – [25].
sunitinib og Disulfiram Cotreatment induserer apoptose i prostatakreftceller
For å finne ut om disulfiram og sunitinib eksponering induserer apoptose, caspase 3 og 7 aktiviteter ble bestemt av en kvantitativ fluorometrisk analyse. Kaspase-aktivitet ble målt som respons på disulfiram (1 uM) og sunitinib (5 uM) eksponering i 48 timer alene og i kombinasjon i VCap-celler. Interessant, verken disulfiram eller sunitinib alene var i stand til å indusere apoptose. Imidlertid ble en signifikant induksjon av apoptose sett i respons til disulfiram-sunitinib kombinasjonsbehandling (fig. 3C). Til sammen viser sunitinib synergiveksthemmende effekter med disulfiram og kombinasjonen av disse to forbindelser indusere apoptose mer enn noen av forbindelsene alene.
Sunitinib Reduserer uttrykk av androgen reseptor (AR), prostataspesifikt antigen (PSA ), ERG og MYC i ERG positiv prostatakreftceller
for å identifisere de første molekylære endringer i respons til disulfiram og sunitinib, mRNA uttrykk for prostatakreft onkogener AR, PSA, ERG og MYC ble studert i disulfiram (1 mikrometer ), sunitinib (5 mm) eller disulfiram-sunitinib co-eksponerte Vcap cellene ved 3-timers tidspunkt. Interessant, resultatene indikerte at sunitinib betydelig redusert AR, PSA, ERG og MYC nivåer (ca. 40%), mens disulfiram alene ikke har større virkning (fig. 4A, B, C og D). Resultatene med disulfiram er i samsvar med vår forrige undersøkelse [2]. Men det var ingen indikasjoner for en kombinatorisk effekt av disulfiram og sunitinib på å redusere uttrykket av disse onkogener på mRNA nivå.
For å finne ut om endringer kan oppdages på proteinnivå, ble AR studert i respons til lengre eksponeringer (6 og 24 timer) disulfiram og sunitinib alene og i kombinasjon. Interessant nok var bare en svak reduksjon av AR observert i respons til sunitinib alene, og ingen reduksjon i AR-protein ekspresjon ble observert i respons til disulfiram alene. Imidlertid ble en klar reduksjon av AR proteinekspresjon (20 og 50%) observert i respons til en kombinasjon eksponering av disulfiram og sunitinib ved 6- og 24-timers tidspunkter (fig. 4E og F). Videre ble det observert lignende nedgang i AR regulert PSA protein nivåer (fig. 4E). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at sunitinib reduserer androgen signalisering i prostatakreftceller spesielt kombinert med disulfiram. Imidlertid er videre analyse for å finne ut om disulfiram og sunitinib handle synergi gjennom androgen signalering.
Disulfiram og Sunitinib Cotreatment induserer E-cadherin Expression
Resultatene fra mikroskopisk celle morfologi analyse antydet at Vcap celler ble mer festet til hverandre som reaksjon på enten sunitinib eller disulfiram og sunitinib co-eksponering sammenlignet med disulfiram eksponering alene (figur 3A.). For å finne ut om disse fenotyper skyldtes induksjon av celleadhesjonsmolekyl E-cadherin, ble immunkjemiske farging utført. Resultatene indikerte at disulfiram og sunitinib cotreatment indusert E-cadherin uttrykk mer enn hver av forbindelsene alene (Fig. 5). E-cadherin er kjent markør for kreftcelledifferensiering, og det er nedregulert i invasive prostatakarsinom [26]. Vi har tidligere vist at induksjon av E-cadherin ekspresjon er assosiert med redusert celleproliferasjon i ERG positive VCap prostatakreftceller [27], [28]. Disse resultatene indikerer at morfologisk fenotype sett i respons til sunitinib-disulfiram cotreatment korrelerer med forhøyet E-cadherin uttrykk i Vcap prostatakreftceller.
Disulfiram og Sunitinib Cotreatment Reduserer Prostate Cancer Cell Migration
For å studere om disulfiram og sunitinib cotreatment påvirker prostatakreft cellevandring, ble levende celle celle migrasjon analysen gjort. I analysen ble PC-3-celler anvendt som prostatakreft modell, ettersom VCap-celler ikke migrerer i denne analysen. Resultatene indikerte at disulfiram-sunitinib ko-eksponering redusert cellemigrasjon mer enn én av forbindelsene alene (Fig. 6). Migrasjonen ble betydelig redusert i disulfiram og sunitinib co-eksponerte prostatakreftceller på 12- og 24-timers tidspunkter (med 20 og 30% i forhold til DMSO kontroll). Betydelig reduksjon i cellemigrering ble også sett i disulfiram og sunitinib eksponerte celler ved 24 timers-tidspunktet (fig. 6B). PC-3-celle konfluens ble ikke signifikant redusert på følgende tidspunkter, noe som indikerer at reduksjon av cellemigrering ikke resulterer på grunn av redusert celleproliferasjon (fig S1). Dermed viste resultatene at disulfiram-sunitinib co-eksponering reduserer prostatakreft cellemigrasjon mer enn noen av forbindelsene alene.
Disulfiram og Sunitinib Kombinasjon Reduserer prostatakreft Cell invasjonen i 3D Kultur
effekten av disulfiram og sunitinib cotreatment ble studert i PC-3 3D spheroid modell [29]. Sfæroidene ble dyrket på Matrigel i 4 dager og disulfiram (1 uM) og sunitinib (5 uM) alene og i kombinasjon ble tilsatt til cellene og celle morfologi ble overvåket i 7 dager ved bruk av levende celle avbildning. Resultatene er vist i figur 7. Disulfiram alene var i stand til å redusere celler fra invaderende 3D-struktur, men det var ikke i stand til å redusere veksten av cellene inne i hulrommet (fig. 7A). I kontrast, sunitinib behandlet kulene var mindre, mens celle invasjonen ikke var blokkert. Interessant, kombinasjonsbehandling redusert mengden av invasive fremspring, så vel som størrelsen på sfæroidene. Arealet av celler i bildene (% av totalt areal) i respons til behandlinger sammensatte 7 dager på 3D er presentert i figur 7B. Til sammen disulfiram-sunitinib cotreatment redusert prostata kreft celle invasjon og vekst i 3D spheroid modell.
Diskusjoner
I denne studien benyttet vi en kjemisk biologi forbindelse sensibiliserende skjermen for å studere aldehyd dehydrogenase (ALDH ) hemmer disulfiram virkningsmekanisme og å identifisere potensielle synergi agenter for disulfiram i TMPRSS2-ERG positive prostata kreft celler. Totalt 3357 forbindelser inkludert aktuelle kjemoterapeutika og små molekylære forbindelser ble undersøkt alene og i kombinasjon med disulfiram og den synergistiske mekanisme for disulfiram sensibilisator sunitinib ble undersøkt nærmere.
Resultatene fra high-throughput kombinatorisk skjerm indikerte at flere androgene forbindelser såvel som en antioksidant astaxanthin var blant forbindelsene livredning disulfiram induserte anti-proliferativ effekt i prostata kreftceller. Våre tidligere resultater indikerte at disulfiram indusert oksidativt stress i prostatakreftceller [2]. Disulfiram øker ROS nivåer også i brystkreftceller [13]. Dermed blir redningen effekten av antioksidanten astaxanthin i disulfiram utsatt celler støtter tidligere resultater indikerer at disulfiram redusert celleproliferasjon medieres via induksjon av oksidativt stress. Screeningresultatene også antydet at PKC spiller en rolle i disulfiram reaksjon siden PKC aktivator forbol 12-myristat 13-acetat var blant legemidler sensibiliserende til disulfiram virkning, mens PKC inaktivator dequalinium analog, C-14-linker reddet disulfiram effekt på skjermen. Videre kan inhibering av reseptor-tyrosin-kinaser, proteasomet, topoisomerase II, glukosylceramidsyntase være alternative måter å forbedre disulfiram virkning, mens inhibering av epidermal vekstfaktor-reseptor har en motsatt virkning. En av de seks forbindelser sensibiliserende VCap-celler til disulfiram induserte anti-proliferativ effekt var antiangiogene middel, tyrosin-kinase-reseptor-protein-inhibitor sunitinib. Sunitinib er en anticancer stoff som er klinisk brukes til å behandle metastatisk nyrecellekarsinom og gastrointestinale kreftpasienter. Det har også vist seg å ha anti-neoplastisk aktivitet i hepatocellulær kreft, bukspyttkjertel nevroendokrine tumorer, og ikke-småcellet lungekreft [18] – [20].
