Abstract
Bakgrunn
Diabetes mellitus er knyttet til kreft i bukspyttkjertelen. Vi antok en rolle for bukspyttkjertelstel celler (PSC) i hyperglykemi indusert forringelse av kreft i bukspyttkjertelen, og derfor studert to humane cellelinjer (RLT PSC, T3M4) i hyperglykemiske miljø.
metodikk /hovedfunnene
effekten av kronisk hyperglykemi (CHG) på PSC avtaler ble undersøkt ved hjelp av mRNA uttrykk array med real-time PCR validering og bioinformatiske sti analyse, og bekreftende protein studiene. Stresset fiberdannelse (IC: αSMA) indikerte at PSC avtaler pleier å transdifferentiate til en myofibroblast lignende tilstand etter eksponering for CHG. Fosforylering av p38 og ERK1 /2 ble økt med en påfølgende oppregulering av CDC25, SP1, økonomisjefer og p21, og med nedregulering av PPARy etter PSC avtaler ble utsatt for kronisk hyperglykemi. CXCL12 nivåene økt betydelig i PSC supernatanten etter CHG eksponering uavhengig av TGF-β1 behandling (3,09 ganger med en 2,73-fold uten TGF-β1, p 0,05). Den upregualtion av SP1 transkripsjonsfaktor i PSC avtaler etter CHG eksponering kan være innblandet i den økte CXCL12 og IGFBP2 produksjon. I kreftceller, hyperglykemi induseres en økt ekspresjon av CXCR4, en CXCL12 reseptor som også ble indusert av PSC s kondisjonert medium. Reseptor-ligand-interaksjon økt fosforylering av ERK1 /2 og p38 resulterer i aktivering av MAP-kinase pathway, en av de mest kraftfulle stimuli for celleproliferasjon. Riktignok kondisjonert medium av PSC øket kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og denne effekten kan være delvis inhibert av en CXCR4-inhibitor. Som PSC kondisjonerte medium (normal glukosekonsentrasjon) økte ERK1 /2 og p38 fosforylering, konkluderte vi med at PSC avtaler produsere andre faktoren (e) som innflytelse (er) bukspyttkjertelkreft atferd.
Konklusjoner
Hyperglykemi induserer økt CXCL12 produksjon av PSC avtaler, og dens reseptor, CXCR4 på kreftceller. Den ligand-reseptor interaksjon aktiverer MAP kinase signal som fører til økt kreftcelle spredning og migrasjon
Citation. Kiss K, Baghy K, Spisak S, Szanyi S, Tulassay Z, Zalatnai A, et al. (2015) Kronisk hyperglykemi induserer Trans-Differensiering av menneskelige bukspyttkjertelen stel celler og forbedrer Ondartet Molecular Kommunikasjon med menneskelig kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 10 (5): e0128059. doi: 10,1371 /journal.pone.0128059
Academic Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA
mottatt: 28 januar 2015; Godkjent: 23 april 2015; Publisert: 26 mai 2015
Copyright: © 2015 Kiss et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Alle microarray Resultatene er lastet opp til Gene Expression Omnibus (GEO) database depotet (sjonsnummer: GSE59953).
Finansiering: Denne studien har vært støttet delvis av den OTKA 100904 tilskuddet. Balansen av støtten kom fra: School of Ph.D. Studier, Semmelweis University, Ungarn. Forfatterne ville ikke ha hadde vært i stand til å gjennomføre noen av disse eksperimentene uten ressurssterke materialer som følger: JML, RJ overførte udødeliggjort menneskelige bukspyttkjertelen stel (RLT PSC) cellelinje til Semmelweis universitet under en MTA-avtalen. Den T3M4 menneskelige bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom cellelinjen var en slags gave fra den europeiske Pancreas Center i Heidelberg. De reagenser som anvendes i den mRNA-ekspresjon matrisen var slag gaver fra GF, slik som AMD3100, og de reagenser som ble brukt for å vurdere CXCL12, IGFBP2, CXCR4, CXCR7 på protein og mRNA-nivåer. De bevilgende myndighet på OTKA hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. GF har lest journalen politikk og forfatterne av dette manuskriptet har følgende konkurrerende interesser: JML, RJ, GF har en patentsøknad P1300509 (PCT /HU2014 /00007) som er knyttet til materiale relevant for dette manuskriptet er. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. OTKA tilskudd ikke deltok i finansieringen av forsøkene førte til P1300509 (PCT /HU2014 /00007) søknad eller bidratt i noen annen form til det.
Innledning
Epidemiologiske studier og deres meta -analyses etablert et klart bevis for sammenhengen mellom diabetes mellitus (DM) og kreft i bukspyttkjertelen (PAC) og konkluderte med at DM er ikke bare en tidlig manifestasjon, men også en etiologisk faktor på PAC. [1] Carstensen og medarbeidere basert på data fra mer enn 4 millioner årsverk bekreftet sammenhengen mellom type 1 DM (T1DM) og PAC og konkluderte med at en stor kreftfremkallende effekten av eksogent insulin er usannsynlig i T1DM. [2]. I mer utbredt type 2 DM (diabetes mellitus type 2) sammenhengen med PAC er også tydelig i lys av en meta-analyse av 36 studier [3].
En prospektiv kohort rapportert at forhøyet fastende plasmaglukose (FPG) nivåer er risikofaktorer for Pac [4]. I tillegg er en dose-respons-meta-analyse av data som oppnås fra 2408 Pac pasienter bekreftet at hver enkelt mmol /L økning i FPG allerede over 4,1 mmol /l er forbundet med en 25% økning i frekvensen av kreft i bukspyttkjertelen [5]. I en risikomodell for å identifisere personer med økt risiko for kreft i bukspyttkjertelen, diabetes 3 år utgjorde en tilsvarende grad av risiko enn, familiehistorie med kreft i bukspyttkjertelen i den generelle befolkningen [6]. Kreft i bukspyttkjertelen, hvorav 90% av tilfellene er duktalt adenokarsinom, betyr en elendig prognose med en 5 års overlevelse på 7% [7]. Dette betyr et unikt høyt behov for en bedre forståelse av sin molekylære patologi.
Til tross for antallet som støtter epidemiologiske studier de cellulære og molekylære mekanismer for utviklingen av denne foreningen mellom DM og PAC er mindre entydig. Derfor hypotese vi det kronisk hyperglykemi i tillegg til den direkte effekt på cancerceller, kan også ufordelaktig endre kommunikasjonen mellom kreftceller og mikromiljøet, spesielt med de pankreatiske stel celler som er de viktigste cellulære stromale elementer i Pac. Konsekvensene av fibroblast aktivering-en prosess drevet opprinnelig av transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) utviklet seg til å forbedre sårheling-er ugunstig i kreftsykdom [8]. Eksperimentelle data antydet at antitumorimmunitet ble undertrykt av stromale celler som uttrykker fibroblast-aktiveringsprotein (FAP) og et middel som målretter FAP-uttrykkende celler forbedret antitumorimmunitet [9]. Men dette konseptet er nylig blitt utfordret basert på observasjoner med αSMA + myofibroblast slettet transgene mus i bukspyttkjertelkreft modell antyder en enda mer kompleks regulering [10].
bukspyttkjertelen stel celler (PSC avtaler) ved aktivering trans-differensiere til myofibroblasts -lignende celler som er hovedkilden for den ekstracellulære matriks (ECM) proteinavsetning i løpet av vev fibrose [11-13]. Pankreatisk duktus adenokarsinom er karakterisert ved en rikelig desmoplastic stroma som et resultat av PSC-aktivering [14].
Det er en intens kommunikasjon mellom tumor-assosierte pscs og kreftceller. Aktivert PSC avtaler frigjøre en rekke vekstfaktorer, cytokiner og chemokiner som fremmer ondartet oppførselen til bukspyttkjertelen kreftceller, som spiller en viktig rolle i kreftutvikling og vekst [15-18] aktiverte setllate celler også beskytte bukspyttkjertelen svulst fra strålings og gemcitabine- induserte apoptotiske effekter [19]. PSC avtaler i indirekte co-kultur forbedret stamcelleliknende fenotyper av kreftceller og indusert uttrykk for kreft stamcellerelaterte gener, noe som tyder på en rolle i kreftstamcelle nisje [20].
Vi vurderte responsen humane pscs utsatt for kronisk hyperglykemi (CHG, 21 dager), ved hjelp av en flertrinns metode for å identifisere de molekylære reaksjonsveier som kan regulere PSC-aktivering. Pac-celler ble også direkte vurdert ved eksponering til hyperglykemi eller betinget PSC kulturmedium (CCM).
Materialer og Metoder
cellelinjer, cellekulturer
I alle forsøkene vi brukte RTL-PSC og T3M4 humane cellelinjer. RLT-PSC er en human pankreas stelcellelinje som tidligere har blitt udødeliggjort ved transfeksjon med SV40 stort T antigen og human telomerase (hTERT) og analysert for stelcellemarkører [13]. I tillegg er det T3M4 human pankreatisk duktus adenokarsinom-cellelinje ble anvendt som var en velvillig gave fra den europeiske Pancreas Center i Heidelberg [21].
PSC-celler ble dyrket i DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium, Sigma, St. Louis, MO) med 1000 mg /l (5,5 mmol /L) glukosekonsentrasjon, T3M4-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma) begge supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma) og 1% penicillin /streptomycin ( Sigma). Celler ble dyrket ved 37 ° C atmosfære inneholdende 5% CO2 og passert ved 85-90% konfluens ved bruk av trypsin-EDTA-oppløsning (Sigma).
Vekstfaktorer og andre forbindelser
transformerende vekstfaktor β1 (TGF-β1, Sigma) ble tilsatt i 5 ng /mL sluttkonsentrasjon til cellene. AMD3100 octahydrochloride hydrat (2 ug /ml, Sigma) ble anvendt for å hemme CXCR4-reseptoren. Under cellemigreringsvurderings-celler ble behandlet med mitomycin C (10 ug /ml, Sigma, Part No .: M4287) for å forhindre celleproliferasjon. BSA (bovin serum albumin, Sigma, varenummer .: A3294) ble brukt for aspecific blokkering i flere metoder.
Behandling tidsplan for PSC og T3M4 celler
PSC avtaler ble utsatt for CHG og TGF β1 i henhold til følgende protokoll:
«kontroll» betingelser celler ble dyrket som beskrevet ovenfor. I tilfelle av «høy glukose» behandling celler ble dyrket i kulturmedium inneholdende 15,3 mmol /l glukose i 3 uker (21 dager), som preliminære eksperimenter viste den beste responsen av ECM proteinproduksjon ved denne tidsramme. Deretter ble cellene sultet i 24 timer i FBS-fritt medium og deretter i 48 timer i FBS-fritt medium, enten med eller uten TGFβ1 for å sammenligne virkningen til Chg. To biologiske paralleller ble anvendt for hver diett.
Celler dyrket i T75 kolber ble samlet og anvendt for mRNA og proteinanalyse, ble cellekulturmediet samlet opp for proteinanalyse. For immunocytokjemi cellene ble dyrket på dekkglass i 6 brønners plater. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
T3M4-celler ble dyrket til 80% konfluens i T75-kolber, så sultet over natten i FBS-fri RPMI. Deretter kulturmedium inneholdende PSC-CCM og RPMI med 10% FBS i en 50% -50%-forholdet ble tilsatt til cellene i 48 timer. Som kontroller i T3M4 eksperimenter FBS-fri DMEM (med 5,5 og 15,3 mM glukose konsentrasjon) ble tilsatt i parallell til full-FBS RPMI. Etter 48 timers behandling, T3M4 celler og cellekulturvæsken ble samlet opp for protein studier.
Fremstilling av kondisjonert cellekulturmedium (CCM)
CCM fremstilt fra RTL-pscs ved å dyrke dem i T75-kolber med 12 ml DMEM inneholdende 10% FBS i 3 dager. DMEM med 1000 mg /l (5,5 mmol /L) eller med 2750 mg /l (15,3 mml /l) glukose ble anvendt. CCM ble oppsamlet fra hver kolbe, steril filtrert og lagret ved-20 ° C inntil bruk.
mRNA-ekspresjon matrise
Total RNA ble isolert (Mean RNA Integrity Antall [RIN] = 9,2 ± SD 0,4) ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen, Hilden, Tyskland). To biologiske duplikater ble samlet innenfor hver gruppe og to tekniske duplikater ble hybridisert fra hver samleprøve gruppe på Genechip PrimeView Menneskelig Gene Expression Array (Affymetrix, Santa Clara, CA). Biotinylert forsterket RNA (Arna) prober ble syntetisert fra 200 ng total RNA ved hjelp av 3 «IVT Express Kit (Affymetrix). Merkede Arnas ble deretter renset og fragmentert for den påfølgende hybridisering. Fluorescent signalene ble skannet av Genechip Scanner 3000 (Affymetrix). Data ble hentet fra CEL filer ved hjelp av «R» overflaten med Bioconductor programvarepakker. Robust multichip Average (RMA) normalisering ble utført og data ble konvertert til log2 notasjon til å lage Feature utvalg av lineær modell og SAM bruke «limma» og «samtools» pakker. Alle microarray Resultatene er lastet opp til Gene Expression Omnibus (GEO) database depotet (sjonsnummer: GSE59953).
genuttrykk verdier på hver behandling arm ble rangert på deres differensial uttrykk i forhold til prøvene isolert fra «kontroll» PSC avtaler . To sett med gener, ble de 100 og 300 valgt å gi den beste separasjon. (P-verdi: 10-4, Statistica programvareversjonen 8, T-test).
Bioinformatikk /Pathway analyse
MetaCore (Thomson Reuters) pathway database integrert programvare ble brukt for funksjonell analyse av mRNA uttrykk microarray data [22]. Denne analysen ga en foreløpig rangering av signaloverføringsveier som er mest sannsynlig endret i PSC avtaler etter CHG eksponering. Vi har valgt 14 differensielt uttrykte gener fra disse orienterings nettverk for videre real-time RT PCR validering, basert på deres potensial tilknytning til diabetes eller bidrag til PSC aktivering, holme bestemt fibrose eller kreft i bukspyttkjertelen.
Real-time RT PCR validering
Først tråd cDNA ble syntetisert fra en mikrogram RNA ved hjelp av M-MLV revers transkriptase kit (Invitrogen av Life Technologies Carlsbad, CA, USA) under de betingelser som er anbefalt av produsenten. Real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI Gene Expression TaqMan Analyser (S1 tabell.) Og TaqMan Universal PCR Master Mix (Delenr 4324018) på en ABI 7000 Sequence Detection System, alle kjøpt fra Applied Biosystems av Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) under forhold som er anbefalt av produsenten. Prøvene ble kjørt i tre paralleller i 20 pl totalt volum inneholdende 50 ng cDNA [syklus betingelser: denaturering: 95 ° C (10 min) etterfulgt av 40 sykluser: 95 ° C (15s), annealing + forlengelse: 60 ° C (1 minutt)] . Resultatene ble standardisert til 18S rRNA (Delenr 4319413E). Cycle terskel (CT) verdiene ble registrert og relativ genekspresjon ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metode.
Enzyme-linked immunsorbent analyse (ELISA)
Type-1 og type 3 kollagen innholdet ble vurdert ved hjelp av en indirekte ELISA system. Plater ble belagt over natten med cellekultursupernatant ved 4 ° C. Etter blokkering med 3% vekt /volum BSA, ble primære antistoffer anvendt over natten ved 4 ° C. Etter vasking med PBS, ble passende sekundært antistoff anvendt. (Antistoff spesifikasjoner og fortynninger anvendt er angitt i Tabell S2). Signaler ble oppnådd ved tilsetning av 3,3 «, 5,5»- tetrametylbenzidin (Sigma, Part No .: T0440), ble reaksjonen stoppet med 1,6N svovelsyre. Absorbansen ble registrert ved 450 nm (Labsystems Multi MS, Thermo Labsystems, Milford, MA, USA)
Kvantifisering av CXCL12 og IGFBP2 i celle supernatant ble utført ved hjelp av en Solid Phase Sandwich ELISA kit (Quantikine R . D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA, kat. nr .: DSA00 og DGB200), i henhold til produsentens instruksjoner. Hver prøve ble testet i triplikater.
fluorescerende farging
For påvisning av intracellulær type-1 kollagen, alfa glatt muskel aktin (α-SMA) og vimentin, immunocytochemistry ble forhåndsdannet. Etter å ha dyrket på dekkglass ble cellene fiksert med iskald metanol. Ikke-spesifikke protein-protein interaksjoner ble blokkert med 5% BSA i 30 minutter ved RT, deretter ble cellene inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C. For sekundære antistoffer Alexa Fluor 488 green på en 1: 200 fortynning ble brukt i 1 time. Celler ble kontra med 4′-6′-diamidino-phenylindole (DAPI, Sigma, varenummer .: D9542). Alle trinn ble vaske preformed med PBS. Bildene ble tatt av et Nikon Eclipse E600 mikroskop med hjelp av Lucia Cytogenetikk versjon 1.5.6 programmet. Detaljer angående antistoffer og deres hensiktsmessige fortynninger finnes i Tabell S3.
Western blot-analyse
etter cellelyse, proteinkonsentrasjon ble målt ved Bradford-metoden. Tjuefem mikrogram av denaturert totalt protein ble fylt på en 10% polyakrylamidgel og ble kjørt i 30 minutter ved 200 V. Proteiner ble overført til PVDF-membran (Millipore, Billerica, MA, USA) i 1,5 timer ved 100 V. Ponceau farging ble anvendt for å bestemme effekten blotting. Membranene ble blokkert med 3% vekt /volum fettfri tørrmelk (Bio-Rad) i TBS i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med de primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Etter at vasketrinnene (0,05 v /v% Tween-20 i TBS), passende sekundært antistoff ble anvendt i 1 time, ble signalene detektert av SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Kit (Pierce /Thermo Scientific, Del nr .: 34080), og visualisert ved Kodak Image Station 4000mm Digital Imaging System. WB analyser ble gjentatt 3 ganger. Ponceau farging ble brukt til å vurdere lik lasting av prøver. Applied antistoffer er angitt i S4 tabell.
spredning og migrasjon analyser av T3M4 bukspyttkjertelen kreftceller
Effekten av PSC-CCM på T3M4 bukspyttkjertelen celler ble vurdert ved hjelp av en sulforhodamin-B (SRB) spredning test. T3M4 celler ble dyrket i 96-brønners plater (5000 celle /brønn) i 50% full-FBS RPMI med 50% avkjølte PSC supernatant /nei-FBS DMEM. Celler ble fiksert med 10 w /v% trikloreddiksyre ved 0, 24, 48, 72 og 96 timer. Etter vasking ble cellene inkubert med 0,4% sulphorodamine-B-oppløsning. Ubundet SRB ble eliminert med 1% eddiksyre. Bundet SRB ble rekonstituert med 10 mM TRIS buffer, ble absorbansen målt ved 570 nm med mikroplateleser (LabsystemsMultiScan MS).
Migrasjon av T3M4 celler ble undersøkt ved hjelp sårhelende analysen. Etter å ha sådd ut i petriskåler, ble celler dyrket til fullstendig konfluens. Spredning ble hemmet av med mitomycin C, enn monolaget ble såret med en 100 mL pipette tips. Etter å skrape celler ble dyrket med 50% RPMI + 50% DMEM /PSC-CCM i 20 timer og fotografert.
Statistisk analyse
Shapiro-Wilks test ble brukt til å vurdere normalitet. To-tailed T-test med uavhengige variabler ble brukt til å sammenligne midler (normalfordelinger). ANOVA med post-hoc Scheffe test ble brukt for multiple sammenligninger. Statistica (release 7) programvare ble benyttet for disse beregningene.
Resultater
glukosetransportører (typer-1, -2 og -3) uttrykkes på menneskelig RLT PSC og T3M4 celler
Typer-1, -2 og -3 gluts, men ikke GLUT-4 ble påvist i RLT PSC og T3M4 Pac cellelysater av WB. (Figur 1).
GLUT-1, GLUT-2 og GLUT-3 er uttrykt på både menneskelige RLT PSC og T3M4 Pac celler. GLUT-4 ble verken oppdaget på PSC avtaler og heller ikke på T3M4 celler. Positive kontroller: hepatoma cellelinje HepG2 for GLUT-1 og GLUT-2, medulloblastoma DAOY for GLUT-3 og RD-40 rabdomyosakrom celler for GLUT-4
Kronisk hyperglykemi og TGF-β1 induserer en. PSC aktivering
Økt α-SMA og type-1 kollagen protein uttrykk ble oppdaget av farging etter PSC avtaler ble utsatt både CHG og TGF-β1. Betydelig høyere type-1 og type-3 kollagen protein nivåer ble observert på TGF-β1 behandling, både med (3,61 ganger og 2,08 ganger, p 0,05) og uten (3,47 ganger og 2,35 ganger p 0,05) før CHG eksponering.
Når PSC avtaler ble utsatt bare å CHG, en trend mot økt type-1 og -3 kollagen produksjoner (1,41 ganger og 1,40 ganger) ble observert (figur 2). Disse resultater tyder på at kronisk hyperglykemi kan bidra til PSC-aktivering og overdreven produksjon av ECM.
Økt α-SMA og type en kollagen-protein-ekspresjon ble funnet på immunocytokjemi etter pscs ble utsatt både for 21 dagers hyperglykemi eller 48h av TGF-β1
(a)
. Økt type 1 og type-3 kollagen nivåer ble observert i PSC cellekultursupernatant i ELISA-studiene, men økningen var statistisk bare signifikant etter TGF-P1 behandlinger både med og uten tidligere CHG eksponering, men ikke etter CHG eksponering alene
(b)
. Signifikante forskjeller (p 0,05) er markert *
mRNA uttrykk profiler i PSC avtaler etter behandlinger
Basert på resultatene av mRNA uttrykk matrisen vi rangert de potensielt endret trasé på ulike behandlinger , og et sett med forskjellig uttrykt gener ble valgt for videre validering av real-time RT PCR (CXCL12, VCAN, FOS, LTBP2, COL5a1, THBS1, PPARy, RND3, MMP1, DPP4). Den biologiske troverdighet i visningen av Metacore integrerte pathway gradene tjent som grunnlag for valg av gener for ytterligere validering. Alle de 10 utvalgte gener vises tilsvarende endringer i real-time PCR validering som i microarray.
Relativ mRNA uttrykk for CXCL12, FOS, LTBP2, økt THBS1 i PSC avtaler etter eksponering for CHG, og effekten av TGF -β1 alene var begrenset. Men da vi søkte deretter etter CHG eksponering, TGF-β1 ytterligere forsterket den oppregulering av CXCL12, LTBP2, THBS1 genekspresjon. PPARy, RND3, og MMP1 mRNA uttrykk redusert etter CHG eksponering. Steady state nivå av VCAN og Col5a1 mRNA bare økt etter at TGF-β1 behandling. Endringer genekspresjon på mRNA nivå i den menneskelige RLT PSC celler etter forskjellige behandlinger er angitt på S1 Fig.
Økt CXCL12, IGFBP2 protein nivåer i RLT-PSC supernatanter
CXCL12 nivåene økt betydelig i PSC supernatanten etter RLT-PSC-celler ble utsatt for Chg uavhengig av påfølgende TGF-β1 behandling (3,09 ganger og 2,73 ganger, s 0,05) (figur 3A). Behandling av PSC avtaler holdt tidligere i normal glukosekonsentrasjons med TGF-β1 i 48 timer resulterte i et 2,69 gangers økning av CXCL12 nivåer.
Når TGF-β1 behandling ble påført senere etter at pscs ble utsatt for CHG det resulterte i en signifikant (3,78 fold, s 0,05) IGFBP2 proteinnivå høyde i PSC supernatanten (figur 3B)
CXCL12 nivå var signifikant økt i PSC cellekultur etter eksponering for CHG mens 48t TGF-β1. behandling med normal glukosekonsentrasjon resulterte også i mer enn 2 ganger økning
(en
). IGFBP2 proteininnhold ble øket i cellekulturmediet etter eksponering for enten CHG eller TGF-β1. Denne endringen var eneste signifikante når PSC avtaler ble utsatt for TGF-β1 senere etter CHG eksponering.
(b)
. Signifikante forskjeller (p 0,05) er markert *
Endring av viktige signalveier i PSC avtaler
WB analyse av PSC avtaler utsatt for CHG både med og uten påfølgende TGF-β1 behandling demonstrerte mest signifikant økning i fosforylering av ERK1 /2 og p38 med påfølgende induksjon av CDC25a og SP-1-proteiner. Protein uttrykk for p21
waf1, HIF1α, ble også økt, mens mengden PPARy redusert etter PSC avtaler ble utsatt for CHG (fig 4). I tillegg ble hexosamin-reaksjonsveien også indusert som indikert av den endrede β-O-tilknyttet-N-acetylglukosamin (GlcNAc) O-proteinmodifikasjons mønstre i pscs utsettes for CHG. WB resultater med verdiene de relative tetthet (vesentlige og moderate forandringer) er indikert på figur 4. Med unntak av marginale endringer var det ingen avgjørende, betydelige eller store endringer i mengden av FAK, PTEN, AKT, PKC-α, c- FOS proteiner i PSC avtaler etter forskjellige behandlinger. (S2 Fig)
pscs ble utsatt for Chg og /eller etterfølgende TGF-β1 behandling. Beste representative bilder av viktige signalmolekyler av stel cellene er angitt i Western blot membraner. Ponceau farging ble brukt til å vurdere lik lasting av geler. Signifikant (p 0,05) * og svært signifikante forskjeller (p 0,001). ** Er merket
Økt spredning og migrasjon av T3M4 celler og effekten av en CXCR4 hemmer
spredning av T3M4 celler økt betydelig etter 48t kultivering med CHG utsatt PSC /CCM viser nesten to gangers økning (10.48) sammenlignet med andre behandlinger (DMEM-5.5: 6.58¸DMEM-15.3: 6.43, p 0,05) på 72h varig hele eksperimentet (96h). Denne spredning fremmende effekt kan være delvis inhiberes ved hjelp av CXCR4-inhibitor, AMD3100 ko-behandling (14,91 vs 17,54, p 0,05), men bare etter 96h av behandlingen (figur 5A)
spredning av T3M4 celler inkubert med. forskjellig kondisjonert PSC kulturmedium og CXCR4 inhibitoren AMD3100 etter 24, 48, 72 og 96 timer etter behandling. T3M4 celleproliferasjon (heltrukket linje, ubehandlet kontroll) ble øket betydelig etter inkubering med PSC supernatant (prikket linje), forutsatt at PSC var før de utsettes for CHG. Nærværet av CXCR4 inhibitor AMD3100 (stiplet linje) kan delvis motvirker denne spredningen induksjon etter 96h.
(b)
Migrasjon av T3M4 kreftceller i et sårhelende analysen. Betydelig innvirkning av hyperglykemi på migrering av kreftceller: en rask direkte virkning av forhøyede glukosenivået ble funnet. Det var ingen slående effekt av klimaanlegg PSC kultur medier på T3M4 celle migrasjon.
(c)
Western blot analyser av viktige signalmolekyler i T3M4 celler. Kreftceller ble utsatt for hyperglykemi eller forskjellige kondisjonert PSC kulturmedium. Beste representative bilder av viktige signalmolekyler av kreftcellene er angitt i WB membraner. Ponceau farging ble brukt til å vurdere lik lasting av geler. Signifikant (p 0,05). Forskjellene er angitt *
Migrasjon av T3M4 tumorceller ble vurdert i en sårhelende analysen. Både eksponering av kreftceller til å dirigere hyperglykemi (kreftceller inkubert i 50% DMEM-høy glukose og 50% RPMI i en glukose concentation av 13.2mM) og eksponering for PSC CCM-5,5 forbedret migrering etter 20 timer sammenlignet med kontrollceller. Den mest markante migrasjon fremme effekten ble oppdaget når kreftceller ble inkubert med kondisjonert PCS medium med høyt glukoseinnhold (CCM-15.3). (Fig 5B)
Endring av viktige signalveier i T3M4 cellene
I T3M4 celler, en massiv (mer enn 5 ganger) økning i fosforylert ERK1 /2 parallelt med en betydelig økning i p21 protein produksjon ble funnet etter eksponering både til hyperglykemi og til PSC-CCM, til tross for at T3M4 er en KRAS-villtype ductal Pac cellelinje. Betydelig økning i p-p38 ble funnet i T3M4 celler eksponert for begge typer PSC-CCMS. Hyperglykemi eksponering redusert mengden av p (Thr) Akt og p (Ser) Akt i T3M4-celler, i motsetning til eksponeringen av kreftceller til PSC-CCM økte mengden av p (Ser) Akt (figur 5C). Begge reseptorer CXCL12, CXCR4 og CXCR7 ble uttrykt på T3M4 celler (figur 5C). T3M4 celler eksponert direkte til hyperglykemi eller annen betinget PSC kultur media uttrykt økt mengde av CXCR4, for det meste etter behandling av T3M4 celler med kulturmediet av PSC avtaler som tidligere ble utsatt for CHG. I kontrast, fant vi ingen endring i CXCR7 protein uttrykk på T3M4 celler etter forskjellige behandlinger. WB resultater med verdiene de relative tetthet er indikert på figur 5C. Bare en beskjeden, ikke-signifikant økning i c-fos og i FAK-proteiner ble funnet i T3M4 celler eksponert for begge typer av PSC-CCMS eller protein uttrykk for PTEN og PKCα ble signifikant endret i T3M4 celler etter forskjellige behandlinger. (S3 figur)
Diskusjoner
Den epidemiologiske kobling mellom DM og Pac [1-3, 6] motivert denne linjen av forskning. Vi antok at CHG kan indusere transdifferensiering (aktivering) av PSC avtaler og bidra til utvikling og progresjon av bukspyttkjertelen fibrose og kreft [15-18, 23]. Hypotesen ble vurdert ved hjelp av menneskelig, udødeliggjort RLT PSC cellelinje [13] i en unik eksperimentelle oppsettet. En rekke av PSC aktiverende faktorer (f.eks: EtOH, TGF-β1, PDGF, TNFa, interleukiner [IL-1, -6, -13], ROS) ble tidligere identifisert, men rollen av kronisk (dvs. 14 dager) hyperglykemi i PSC aktivisering er ikke undersøkt ennå.
Tidligere studier har rapportert en hyperglykemi indusert aktivering av rotte PSC avtaler, men bare opp til 72 timer, og uten et genom-wide tilnærming. [24-26] Vi fant at menneskelige PSC avtaler økte cytoplasma αSMA mikrofilamentdannelse og tendens til å øke store ECM protein bestanddeler (type-1 og -3 kollagener) ved eksponering for CHG.
genom-wide mikromatrisemetoden ble brukt til å vurdere glukose indusert endringer i mRNA uttrykk mønstre. Den MetaCore veien database-programvare ble brukt for foreløpig identifisering av diabetes forbundet trasé, etter valget av de 300 differensielt uttrykte gener. Hver molekyl vei var resultatet av integrering av flere sett av gener med endrede mRNA uttrykk i microarray (f.eks .: CXCL12 ble identifisert som en integrasjon av 12 gener med vesentlig forandret mRNA-uttrykkene til en enkel signalkaskade). Deretter vi validert mRNA uttrykk for et valgt sett av gener ved hjelp av real-time PCR. Viktige signalmolekyler ble deretter vurdert på proteinnivå i PSC avtaler.
fosforylering av p38 var den største endringen i PSC avtaler etter eksponering for CHG. Vi kunne ikke gi en entydig oppstrømsveien for hyperglykemi indusert økt fosforylering av p38 i pscs, men lignende resultater ble rapportert i dyrkede humane peritoneale mesothelial celler eksponert for høy glukosekonsentrasjon, noe som indikerer at p38 MAPK-aktivering spilte en rolle i (det peritoneale ) fibrose utvikling [27]. Aktivering av p38 sti var også vesentlig ved høye glukosekonsentrasjonen induserte epitel-mesenkymale overgang (EMT) av dyrkede humane renale tubulære epitelceller [28] og EMT av acini i bukspyttkjertelen kan bidra til den endelige PSC befolkning [29]. I tillegg er p38 veien aktiveres under gluco-lipotoxicity indusert apoptose i insulin sekresjon Ins-1-celler [30].
SP1 ble valgt for WB analyse på grunn av at den proksimale formidler av CXCL12 er okkupert av seks antatte SP1 bindingsmotiver som bekreftes av funksjonelle metoder (in vitro mutagenese) [31], og på grunn av at SP1 transkripsjonsfaktor binder seg også til 200 bp oppstrøms fra transkripsjons-initierings-setet av IGFBP2. SP1 induserer også transkripsjonen av p21 og gener CDC25 [32, 33]. Vi har funnet en signifikant økning i SP1 proteinmengden i pscs etter eksponering for Chg, og dette var uavhengig av effekten av TGF-β1. SP1 overekspresjon i kirurgisk reseksjon menneskelig Pac var assosiert med aggressiv sykdom og dårlig prognose [34] og SP1 ble beregnings spådd å være den viktigste regulatoren transkripsjonsfaktor i PAC [35].
