Abstract
I denne studien vi evaluert uttrykk for mellom konduktans kalsiumaktiverte kalium (KCa3.1 ) kanal i menneskelig glioblastom stilk-lignende celler (cscs) og undersøkt sin rolle i cellen motilitet. Mens KCa3.1 kanalen ikke blir uttrykt i neuronal- og glial-avledet vev hos friske individer, både KCa3.1 mRNA og protein som er til stede i den glioblastom tumor befolkning, og er betydelig forbedret i cscs avledet fra både etablert cellelinje U87MG og en primær cellelinje, FCN9. I samsvar med disse dataene, ble spenningsuavhengig og TRAM-34 sensitive kaliumstrømmene imputable til KCa3.1 kanal registrert i murine GL261 cellelinje og flere primære humane glioblastom cellelinjer. Dessuten ble en betydelig høyere KCa3.1 strøm tatt opp i U87MG-CD133-positive celler sammenlignet med den U87MG-CD133 negativ subpopulasjon. Videre fant vi at svulsten cellemotilitet er sterkt assosiert med KCa3.1 kanal uttrykk. Blokade av KCa3.1 kanal med den spesifikke inhibitor trikke 34 har nemlig en større effekt på motilitet av cscs (reduksjon på 75%), som uttrykker et høyt nivå av KCa3.1 kanal, for på den FCN9 foreldre populasjonen ( reduksjon på 32%), hvor det KCa3.1 kanal uttrykkes på lavere nivå. Lignende resultater ble også observert med cscs avledet fra U87MG. Fordi invasjon av omliggende vev er en av de viktigste årsakene til behandlingssvikt i glioblastom, kan disse funnene være relevant for fremtidig utvikling av nye kreft terapeutiske legemidler
Citation. Ruggieri P, Mangino G, Fioretti B, Catacuzzeno L , Puca R, Ponti D, et al. (2012) hemming av KCa3.1 Channels aktivitet reduserer cellemotilitet i Glioblastoma Avledet kreftstamceller. PLoS ONE 7 (10): e47825. doi: 10,1371 /journal.pone.0047825
Redaktør: Massimo Avoli, McGill University, Canada
mottatt: May 30, 2012; Godkjent: 17 september 2012; Publisert: 22 oktober 2012
Copyright: © Ruggieri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Fondazione Cassa di Risparmio, Perugia (FF) og fra COFIN-MIUR (Minis dell’Università e della Ricerca SCIENTIFICA) 812,111, 2007 (AC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
glioblastoma multiforme (GBM) er den vanligste formen for ondartet sentralnervesystemet (CNS) svulst i voksen, og den mest vanskelig å kurere tross for fremskritt innen kirurgi og adjuvant behandling [1]. Det representerer 30 til 60% av CNS primære tumorer, med en forekomst på 2 til 3 tilfeller per 100 000 mennesker per år [2], [3]. Kun 30% av GBM pasientene lever lenger enn ett år etter diagnose, og gjennomsnittlig levealder er fortsatt ca 14-18 måneder [4], [5]. Den dårlig prognose for GBM pasienter har ikke bedret seg betydelig i løpet av de siste tiårene, hovedsakelig på grunn av vanskelighetene og utfordringene i å oppdage og behandle denne dødelig kreft.
Flere eiendommer kreft, inkludert glioblastom, er påvirket av misregulation av ion kanal ekspresjon eller funksjon [6] – [8]. Redusert ekspresjon av indre likeretter K kanaler, [9] og økt ekspresjon av amilorid-sensitive Na-kanaler [10], spennings-aktivert Cl kanaler [11], og BK-kanaler [12] har blitt rapportert i flere gliomer, sammenlignet med normale astrocytter. KCa3.1 kanal uttrykk kan også bli deregulert i glioblastom. Den KCa3.1 kanal, også kjent som IK1, SK4, KCNN4, er IKCa et medlem av kalsiumaktiverte kalium- (KCA) kanal familie, med en enhetlig ledningsevne på 20-60 pS i symmetriske 150 MMK [13], [14 ]. Det skiller seg fra de funksjonelt relatert kalsiumaktiverte kaliumkanaler av større (100-200 pS; BK) og mindre (2-20 pS; SK) enhetlig konduktansen av dens farmakologi, biofysikk og fysiologi [13], [14]. Alle tre familiemedlemmer av Kca-kanaler ble vist ved Sontheimer gruppe til å bli transkribert i glioma-celler, selv om bare BK-kanaler var funksjonelt i svulsten, og deres hemming sterkt påvirket cellemigrering in vitro [15]. Nylig vår gruppe rapporterte den funksjonelle ekspresjon av den KCa3.1 kanal i glioblastoma cellelinjer og vist at disse kanalene få alvorlige konsekvenser for å fremme cellemigrering, slik som vist ved transwell migrasjon assay i nærvær av spesifikke KCa3.1 kanalblokkere [16]. Deretter ekspresjon og funksjonell aktivitet av KCa3.1 kanalen ble fast etablert i to glioma cellelinjer og i celler fra en primær kultur [17].
Nylige bevis antyder at glioblastom stammer fra en pool av stem- lignende celler som deler egenskaper til felles med nevronale stamceller. Stemness atferd og vandrende evne er nært knyttet og regulert av felles signalveier [18]. Basert på disse dataene vi satt ut for å undersøke om de KCa3.1 kanaler er involvert i vandrende ferd med stilk-lignende celler isolert fra svulsten avledet primære og permanente cellelinjer. Vi fant en markant uttrykk for aktivt funksjonelle KCa3.1 kanaler i anriket brøkdel av celler med stilk-lignende egenskaper, og at deres selektiv blokkering dramatisk hemmet cellular motilitet.
Resultater
Funksjonell KCa3.1 kanaler er uttrykt i U87MG og GL261 cellelinjer
for å bestemme nivået av KCa3.1 mRNA i glioblastom kreftceller, vi målte deres uttrykk ved real-time PCR på to godt karakteriserte cellelinjer, menneske U87MG og murine GL261.
KCa3.1
mRNA er klart påvist i begge cellelinjer og uttrykkes på et høyere nivå i forhold til menneskelige og murine normale astrocytter. Deres nivåene var 118.47 ± 14,6 ganger høyere i U87MG og 76,13 ± 16,52 i GL261 celler (data ikke vist). Western blot-analyse av hel-cellelysater, utført for å vurdere den proteinekspresjon, viste et bånd av -48 kDa i begge cellelinjene ko-migrerer med den positive kontroll gitt av produsenten spesifikke antistoff (figur 1A). Mengden av KCa3.1 protein detektert i U87MG er tydelig høyere enn det som ble observert fra den GL261 cellelinje. Optisk tetthet (OD) målinger av båndintensitet, etter normalisering, beregnet KCa3.1 nivået i U87MG til å være omtrent fire ganger høyere enn i GL261. Vi evaluerte også frekvensen av positive celler i de to cellelinjer ved cytometrisk analyse (figur 1 B, C). Prosentandelen av KCa3.1 positive celler var 72,66% i U87MG cellelinje og 37,51% i GL261 cellelinje. Disse frekvensene er relativt høy hvis sammenlignet med den i KCa3.1 positive celler (2,82%) som ble funnet i mus normal voksen astrocytter, tatt som kontrollceller (figur 1D).
(A) Immunoblot-analyse av U87MG og GL261 viste et uttrykk for KCa3.1 kanaler korrelert til transkripsjonsnivåer. (B) (C) Cytofluorimetric analyse av KCa3.1 på U87MG, GL261 og mus normal voksen astrocytter (NMA). Celler ble inkubert med anti-KCa3.1 fulgt av AlexaFluor488-konjugert geit anti-kanin-antistoff som angitt i avsnittet Materialer og metoder. Ti tusen hendelser ble registrert og analysert med Cyflogic. Grå histogrammer: cellular autofluorescence; svart histogrammer: AlexaFluor488-konjugert geit anti-kanin alene; grønne histogrammer: anti-KCa3.1 (D) Typisk tidsforløpet for den KCa3.1 strøm fra en celle GL261, tatt opp fra IV-kurver ved 0 mV, i kontrollforhold, etter anvendelse av DC-EBIO (100 uM) + ionomycin ( 500 nM), og etter påføring av tre mikrometer TRAM-34 i kontinuerlig tilstedeværelse av DC-EBIO + ionomycin. Spenning ramper ble brukt hver 5 s. Fylte sirkler er datapunkter innhentet rett før IV kurvene vist i panelet E. (E) Representant IV kurver som oppnås ved å påføre spenning ramper -100 til 50 mV fra et holdingselskap potensial fra 0 mV, i kontrollforhold (CTRL), etter påføringen av DC-EBIO + ionomycin, og etter tilsetning av sporvognen 34 i den kontinuerlige nærvær av DC-EBIO + ionomycin. (F) Mean KCa3.1 strømtetthet måles i mus NMA, som kontroll, i GL261 og U87MG glioblastoma cellelinjer ved 0 mV, måles som forskjellen mellom den høyeste strømtetthet i DC-EBIO + ionomycin og den reststrøm etter tilsetning av trikk-34 (jf fylte sirkler i panelet D).
den funksjonelle uttrykk for KCa3.1 kanaler i U87MG og GL261 glioblastom celler ble bekreftet med patch-clamp målinger i hel-celle perforert konfigurasjon. TEA (3 mm) og Oktylalkohol (1 mm) var til stede i alle løsninger for å blokkere BK og gapet junctional kanaler, vanligvis co-uttrykt med KCa3.1 kanaler i glioblastom celler (se metoder, [16]). Et typisk eksperiment som illustrerer protokollen som brukes til å vurdere KCa3.1 strøm er vist på figur 1E og F. Cellene ble gjentatte ganger stimulert med spennings ramper -100 til 50 mV fra et holdepotensial fra 0 mV, og den KCa3.1 strøm ble bestemt ved først å påføre den KCa3.1 /SK kanal aktivator DC-EBIO (100 uM) pluss ionomycin (500 nM; DC-EBIO + ionomycin), og deretter tilsette den spesifikke KCa3.1 kanal inhibitor trikke-34 (3 pM) i den kontinuerlige nærvær av DC-EBIO + ionomycin. I begge cellelinjer, som følge av ekstracellulære perfusjon med DC-EBIO + ionomycin, observerte vi utviklingen av en spenningsuavhengig strøm med en reversering potensial (bety -85 ± 3 mV for GL261 celler, n = 3, og -82 ± 4 for U87MG celler, n = 4) nær K likevektspotensialet i våre opptaksforhold (-90 mV). DC-EBIO + ionomycin-indusert strøm hadde i de fleste cellene en innledende forbigående fase før en vedvarende platå. Både den forbigående og vedvarende komponenter kan i virkeligheten tilskrives KCa3.1 gjeldende, da de aldri ble observert ved anvendelse av DC-EBIO + ionomycin i trikke-34-preinkuberte celler. Gjennomsnittlig KCa3.1 strømtetthet av U87MG og GL261 celler (forbigående pluss vedvarende vurdert til 0 mV) var 16,2 ± 5,0, n = 18, og 11,5 ± 3,9, n = 7, henholdsvis. I motsetning til dette ble ingen DCEBIO + Ionomycin-aktivert trikke 34 følsomme strøm observert hos normale mus voksne astrocytter (n = 7) (fig 1G).
Induksjon av Neurosfærer og CD133 etterfølges av Stimulering av KCa3.1 kanaler Expression, i U87MG cellelinje
neste søkt å undersøke uttrykk og funksjon KCa3.1 kanaler i U87MG celler dyrket i stamcellegivende medium. Cellekondisjonering ble målt med optisk mikroskopi og cytofluorimetry ved å bekrefte forekomsten av neurosfærer og CD133
+ celler, som ble overvåket inntil tre uker etterpå (figur 2A, B, C). CD133 er en markør for de fleste kreft stilk-lignende celler, spesielt i hjernesvulster [19]. CD133
+ celler kumulerte til maksimalt 6,3% (figur 2D) etter 10 dager av klimaanlegg (U87MG-NS), og de var fortsatt positiv etter 16 dager (4,6%, data ikke vist).
(A) fase-mikroskopi-bildet viser U87MG-celler Subkonfluente og U87MG-avledede neurosfære etter 7 (B) og 14 dager (C) i serumfritt medium kondisjonering. (D) Cytofluorimetric analyse av CD133 på U87MG og U87MG-NS. Cellene ble farget med PE-konjugert anti-CD133 (1) eller histotype matchet antistoffer som beskrevet i Materialer og metoder delen. Ti tusen hendelser ble registrert og analysert med Cyflogic. Gray histogram: cellular autofluorescence; svart histogram: Isotyp kontroll; orange histogram: anti-CD133 (1) (E) Immunoblot-analyse av U87MG og U87MG-NS viste en ekspresjon av KCa3.1 kanaler korrelert til transkripsjonsnivåer. (F) Fasekontrast (øverst) og immunfluorescens (nederst) bilder av mekanisk dissosiert U87MG-NS-celler etter 30 min inkubering med anti-CD133 antistoff, som viser CD133
+ og CD133
– celler (angitt med tykk og tynne piler, henholdsvis). (G) Bar plott som viser gjennomsnitts KCa3.1 strømtetthet målt en 0 mV i CD133
+ og CD133
– U87MG-NS celler. Forsøk ble utført som beskrevet i forklaringen til figur 1D-F. * ANOVA test, p. 0,05
For å verifisere stammen lignende egenskaper U87MG-NS vi utførte Real-time PCR for å undersøke uttrykket av
nestin Hotell og
GFAP.
endringer i uttrykket av
nestin
, en markør for nevrale stamceller, og
GFAP
, en markør for differensierte astrocytter, er tegn på differensiering
i vitro
av stilk-lignende celle avledet fra glioblastom [1]. Sammenlignet med ubehandlet U87MG,
nestin
uttrykk ble økt 2,68 ± 0,56 ganger (p 0,001), mens
GFAP
ble funnet å redusere (0,516 ± 0,05, p 0,05). Disse resultatene ble bekreftet av immunfluorescens farging av U87MG og U87MG-NS med antistoffer mot CD133, GFAP, og nestin (se Utfyllende data).
Vi undersøkte KCa3.1 kanal uttrykk i U87MG-NS. Ekspresjonen av
KCa3.1
mRNA var 2,02 ± 0,10 ganger høyere enn i ubehandlede celler (p 0,001). Også mengden av KCa3.1 protein detektert i U87MG-NS er høyere enn i U87MG (OD-forholdet er 1,8), som forventet fra den høye mRNA-nivåer (figur 2E). Den elektrofysiologiske analyse utført på den CD133
+ celler avledet fra U87MG-NS demonstrerte også den høyere aktivitet av kanalene i disse cellene. Spesielt utførte vi patch-clamp målinger på enten CD133 negative eller positive celler, etter farging med anti-CD133 antistoffer ved immunfluorescens (figur 2F). Som vist i figur 2G, begge cellene viste KCa3.1 strømninger, som evaluert ved å anvende standardprotokollen i det hel-celle-konfigurasjon. Spesielt ble CD133
+ celler funnet å uttrykke et betydelig høyere nivå av KCa3.1 strømtetthet (21,3 ± 3,7 pA /pF, n = 7, vs 8,1 ± 3,5 pA /pF, n = 5, henholdsvis; p 0,05).
undergruppe av CD133
+ U87MG celler uttrykker høyere nivåer av
KCa3.1
mRNA
Siden viktigste fokus for våre studier er
KCa3.1
kanal uttrykk i hjernen tumorceller med stamceller-lignende egenskaper, vi deretter ledet etterforskningen mot CD133
+ subpopulasjoner fraksjonert fra U87MG-NS. Ved hjelp av cellesortering vi har fått cellefraksjoner med opp til 32% av CD133
+ celler (figur 3) og med et nivå på
CD133
transkripsjoner mer enn 11 ganger høyere (11,63 ± 3,23, p 0,001 ).
KCa3.1
mRNA nivå i CD133-beriket fraksjoner, også analysert ved real-time PCR, var ca 4 ganger høyere (3,99 ± 0,195, p 0,05). Enn i CD133-utarmet undergrupper
Cytofluorimetric analyse av kondisjonert U87MG-NS ble utført ved farging celler med PE-konjugert anti-CD133 antistoff som rapportert i Materiale og metode delen. Andel CD133
+ celler før (venstre panel) og etter sortering prosedyre (høyre panel) er vist i rødt. Ti tusen hendelsene ble kjøpt og analysert ved hjelp av FACS DiVa programvare.
Den KCa3.1 spesifikk hemmer TRAM-34 Reduserer motilitet av U87 MG-NS
Vi har tidligere vist at module av ion flukser gjennom membranen kanaler er avgjørende for stimulering av glioblastoma celle motilitet. Siden TRAM-34 selektivt hemmer ion strøm gjennom KCa3.1 kanaler, testet vi hypotesen om at svekke ion gjeldende med TRAM-34 vil ha en effekt på
in vitro
motilitet av U87MG-NS (evaluert av fibronectin- belagte Transwell analyser). Som vist i figur 4A har vi funnet at sporvognen 34 ved en konsentrasjon på 1 og 3 uM inhiberte motilitet med 49,5% ± 21,52 (n = 10, p 0,001), og 65,4% ± 27,46 (n = 10, p 0,001 ), respektivt.
(A) Kvantitativ analyse av celle invasjon med fibronektin-belagte Boyden kammer analysen er beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Forskjellige konsentrasjoner av sporvognen 34 (1 og 3 pM) hemmet celle motilitet på en doseavhengig måte. Inhibering var statistisk signifikant sammenlignet med ubehandlede celler (*** p 0,001). Stolpene er gjennomsnitt ± SD. (B, C, D) Representative mikroskopiske felt av U87MG-NS-glioblastom stilk-lignende celler som har migrert i 48 timer gjennom et 8 um porestørrelse filter i fravær (B) og i nærvær av 1 uM (C) og 3- mikrometer (D) TRAM-34.
KCa3.1 Kanaler er fraværende i Voksne sunn hjerne og lillehjernen, men sterkt uttrykt i glioblastom tumorprøver og Avledet primære cellelinjer
For å finne ut om våre funn kan være relevant for studiet av hjernesvulster, vi utvidet våre undersøkelser til KCa3.1 kanal uttrykk for normale menneskelige astrocytter (NHA), parafin-embedded seksjoner fra menneskelige gliaceller svulster, og tre menneskelige primære glioblastom cellelinjer (CRL8 , FCN9 og MZC12). Nivåene av KCa3.1 uttrykk i stor grad skilte seg blant de undersøkte prøvene. Gjennomsnittlig ganger endring i forhold til Human-Etisk Forbund var 318,9 ± 21,13 for CRL8, 176 ± 34,64 (FCN9) og 57,6 ± 2,4 (MZC12) (p 0,001) i de tre primære cellelinjer (figur 5A). Immunohistokjemisk farging viste at KCa3.1 kanaler var fraværende i normalt hvit substans hjerne, med unntak av endotelceller i blodkar (figur 5B), mens de ble sterkt uttrykt i seksjoner fra tre forskjellige tumorer (figur 5C, D, E). En klasse I astrocytom er vist i figur 5F med KCa3.1 positiv farging begrenset til områder anriket på nye blodkar. I figur 5G en vev avsnitt fra normal lunge er vist som positiv kontroll
(A) Real-time PCR på tre primære humane cellelinjer glioblastomas (CRL8, lane 1,. FCN9, kjørefelt 2; MZC12, kjørefelt 3) viste at KCa3.1 transkripsjoner uttrykk er høyere sammenlignet med NHA (kolonne 4). (B-G) Immunhistokjemisk farging på normal menneskelig hjernevev avslørt KCa3.1 protein nærvær i endotelceller i blodårer (B) mens vi observerte en diffus flekker i klasse svulster høy (CRL8, C, FCN9, D, MZC12, E ) og en KCa3.1 signal bare i neovaskularisering området (glio lav karakter, F). Som positiv kontroll vi brukte fysiologisk lungevev (G). (H) Typisk tidsforløpet av det aktuelle registrert ved -40 mV fra en FCN9 celle ved å bruke gjentatte (hver 5s) spenningsramper -100 til 100 mV. 3 mM TEA og 1 mM Oktylalkohol ble lagt for å blokkere BK og gapet junctional kanal, henholdsvis, vanligvis co-uttrykkes med KCa3.1 kanaler i glioblastom celler (21, 22). DC-EBIO (100 mm) + ionomycin (0,5 mm) og DC-EBIO + ion tre mikrometer TRAM-34 ble påført etter hverandre for å bekrefte den funksjonelle uttrykk for KCa3.1 strømninger (jf tekst). (I) Representant I-V relasjoner i nærvær av DC-EBIO + ionomycin, og DC-EBIO + ionomycin + TRAM-34. Dataene i panel (H) og (I) er fra det samme eksperiment.
Innfelt product:: I-V forholdet mellom KCa3.1 nåværende oppnådd ved å trekke dagens ramper registrert i DC-EBIO + ion + TRAM-34 fra det som registreres i DC-EBIO + ion. (L) Plot rapportere KCa3.1 strømtetthet på 0 mV (målt som i panel I) målt i de tre primær glioblastom cellelinjer. Siden det i flere celler en de spenningsstyrte K strøm aktivering ved membranpotensialer er høyere enn -20 mV var tilstede, i disse tilfellene målinger av KCa3.1 strømtettheten ble utført ved -40 mV, og den vurderte strømtettheten ble deretter ekstrapolert ved 0 MV ved å anta en lineær strøm-spenning forhold. * ANOVA test, p. 0,05
funksjonelle studier i Primær glioblastom cellelinjer
Den funksjonelle uttrykk for KCa3.1 kanaler i de tre primær glioblastom cellelinjer ble bekreftet med flekk- klem målinger i hel-celle perforert konfigurasjon (figur 5 H, i, L). I alle celler som ble testet (CRL8, n = 8; FCN9, n = 5, og MZC12, n = 4) KCa3.1 strøm ble identifisert som den utgående strøm aktivert av ekstracellulær perfusjon av DC-EBIO + ionomycin, og inhiberes ved KCa3.1 kanal-selektiv hemmer TRAM-34 (3 mm) (Figur 5 H, I). Figur 5L, som viser den midlere KCa3.1 strømtettheten vurdert i de tre cellelinjer, angir at CRL8 cellelinjen har en vesentlig høyere densitet enn FCN9 og MZC12 cellelinjer. Legg merke til at i motsetning til stabile cellelinjer, i primærceller de KCa3.1 strømninger å konstruere tomten er tatt på -40 mV i stedet for 0 mV fordi på dette mer depolarisert spenning en betydelig spennings gated DRK nåværende var noen ganger presentere som ble fornuftig hemmet av KCa3.1 aktivere løsningen DC-EBIO + ionomycin. Derfor, for å tillate en direkte sammenligning med den KCa3.1 strømtettheter som er vurdert i glioblastoma cellelinjer, data som er vist i figur 5 L er gitt ved 0 mV. Dataene ble innhentet ved lineær tilpasning polering av IV forhold i -100 /-40 spenningsområde.
motiliteten Stem lignende Cell subpopulasjoner Avledet fra primære cellelinjer er sterkt hemmet av TRAM-34
Sist vi undersøkte
KCa3.1
mRNA uttrykk og migrasjon evne henhold TRAM-34 behandling i en primær cellelinje (FCN9) og dets clonally avledet subkultur med stilk-lignende egenskaper (2B5) [ ,,,0],20].
KCa3.1
mRNA-transkripsjon og protein ekspresjon ble funnet å bli forbedret i 2B5 celler sammenlignet med FCN9 (1,5 ganger ± 0,2, p 0,05 til mRNA, og se figur 6B for immunblotting). En vesentlig forskjell mellom de to cellelinjene ble også funnet ved flowcytometri (en midlere fluorescerende intensitet på 1061,97 og 1716,37 for KCa3.1 ble funnet i FCN9 og 2B5, henholdsvis). Prosentandelen av positive celler var også forskjellig i de to cellelinjer (51,86% i FCN9 og 70,68% i 2B5). Videre histogrammet form (det vil si en overlappende bimodal gaussisk kurve i 2B5 sammenlignet med en gaussisk kurve i FCN9) avslører tilstedeværelsen i 2B5 celler av en underpopulasjon som uttrykker høye nivåer av KCa3.1, som er fraværende i FCN9 (figur 6A). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at stammen lignende 2B5 avledet klone uttrykker høyere KCa3.1 nivåer enn foreldre FCN9 cellene.
(A) Cytofluorimetric analyse av KCa3.1 på FCN9 (øvre panel) og avledet 2B5 klone (nedre panel). Cellene ble farget med anti-KCa3.1 fulgt av AlexaFluor488-konjugert geit-anti Rabbit. Ti tusen hendelser ble registrert og analysert med Cyflogic programvare. Grey histogrammer: cellular autofluorescence; grønn histogram anti- KCa3.1; svart histogram: AlexaFluor488-konjugert geit-anti Rabbit. (B) immunoblotanalyse av FCN9 og 2B5 viste en forbedret uttrykk for KCa3.1 kanaler i clonally avledet subkultur med stilk-lignende egenskaper (2B5). (C) Kvantitativ analyse av celle invasjon utført på fibronektin-belagte Boyden kammer, ved anvendelse av 3 mM trikke-34. Resultatene, representert som prosentandel av motilitet inhibering sammenlignet med ubehandlede celler, var statistisk signifikant (p *** 0,001). Stolpene er gjennomsnitt ± SD.
En betydelig reduksjon av bevegeligheten ble indusert av tre mikrometer TRAM-34 i begge cellelinjer. Reduksjonen observert i 2B5 celler (75%) var imidlertid mye større enn i FCN9 celler. (32%; figur 6C)
diskusjon
Sammen med de fleste faste tumorer som består av heterogene kreftceller som samt vasculatures, stromale elementer og betennelsesceller [21], GBMS vise bemerkelsesverdig intratumoral heterogenitet og cellulær hierarki. Økende bevis også sterkt støtter konseptet at en subpopulasjon av kreftceller i svulsten masse har større potensial for kreft initiering og repopulation [22] – [27]. Disse celler er kjent som kreft Stem Cells (cscs) eller tumor-Initiere celler som de deler flere kritiske egenskaper med typiske stamceller, inkludert evne til selvfornyelse, multilineær differensiering, og opprettholdt proliferasjon [28] – [31] . Ifølge nyere litteratur, glioma stamceller også fremme radioresistance, tumor angiogenese [32], [33] og kjøre metastase [34]. Ett stort problem med GBM celler er deres svært infiltrerende natur. Som en konsekvens, aggressiv invasjon av GBM kreftceller inn i det normalt hjernevev og ryggmarg hindrer ofte fullstendig fjerning av tumorceller [35]. Migrasjon begynner når en celle reagerer på et ytre signal som fører til polarisering og utvidelse av en «ledende front» i retningen av bevegelsen [36]. Økende bevis viser at ionekanaler er nødvendige komponenter av den komplekse maskiner ansvarlig for celle migrasjon. Spesielt ionekanaler gjøre migrasjon mulig gjennom osmotiske strømmer og påfølgende krympende og hevelse av cellen kroppen. De er plassert både på baksiden av cellen og på den ledende foran, hvor de utøver også en invasiv rolle ved surgjøring av ECM-området og fremming av metalloproteinase proteolytisk aktivitet [37]. Krenkelse av homeostatic epitel arkitektur, sammen med oppkjøpet av en trekkfugl fenotype, er et avgjørende øyeblikk i tumor progresjon av alle solide tumorer. Det er ennå ikke klart om det er hovedsakelig stamcelle del av svulsten, som allerede viser invasive egenskaper in vivo, som overtar den vandrende fenotype [34]. Begrenset kunnskap er tilgjengelig om trekkegenskapene til glioma kreftceller in vitro i forbindelse med KCa3.1 kanal aktivitet. Den KCa3.1 kanal hovedsakelig er aktiv i den bakre kant av cellen [38] og letter den cellulære svelling og krymping i tumorceller under trekket [37]. I tillegg har KCa3.1 kanalen vært involvert i vandrende svar anmodet ved CXCL12, chemokine ligand av CXCR4 [39]. Nylig har vi vist at strømtettheten hemming av både KCa3.1 og klorid kanaler i U87MG nesten helt hindrer migrasjon uten at det påvirker spredning [40]. Ionekanaler har blitt undersøkt på stamceller fra ulike typer normalt vev, som KCa3.1 kanaler i stamceller avledet fra mus benmarg [41]. Imidlertid er kunnskapen i forhold til ionekanaler i cscs stedet svært begrenset [41]. Dette fikk oss til å undersøke tilstedeværelse og funksjon KCa3.1 kanal i menneskelige glioblastom cscs og hvordan de forholder seg til den mobile fenotype i disse cellene.
Først viser vi at KCa3.1 kanal transkripsjoner er uttrykt i forskjellige typer av dyrkede celler som er fast etablert og primære cellelinjer. Nivåene registrert av Real Time-PCR er opp til 118 ganger høyere i U87MG, 76 ganger i GL261, og 318,9, 176 og 57,6 ganger i tre primære cellelinjer, sammenlignet med normale astrocytter. Lavere men like signifikante forskjeller er funnet mellom cscs og foreldre motstykke i U87MG og den primære cellelinje FCN9. Forskjeller i fluorescensintensiteten av KCa3.1 kanal -bundet antistoff og fraksjonen av positive celler ble også observert for første gang, ved cytofluorimetry.
I normal voksen hjerne murine har den KCa3.1 strøm eneste Det er rapportert på aktiverte mikroglia [42], hjerne kapillære endotelceller [43], Purkinje-celler [44], og i en subpopulasjon av astrocytter som er involvert i nevrovaskulær koblingen [45] – [47] [8]. Til sammen vil disse data at i murine hjerne den funksjonelle ekspresjon av den KCa3.1 kanal er begrenset til spesifikke astrocytic celle subpopulasjoner. Følgelig vi her rapporterer at normale voksen mus astrocytter nesten ikke uttrykke KCa3.1 strøm. Dette funn er også i overensstemmelse med den meget lav fraksjon (ca. 2,5%) av KCa3.1-positive celler ble funnet ved FACS-analyse i normale astrocytter. Vi har også undersøkt tilstedeværelse av Ca-aktiverte K kanaler ved immunoistochemistry i vevssnitt fra både menneskelige normale og tumorprøver. Den KCa3.1 kanal presentert med en diffus og sterk farging bare i prøvene fra svulster høy klasse.
Kanal uttrykk tillater oss å undersøke spørsmålet om rollen til KCa3.1 kanal på cellen vandrende evne ved utføre Transwell motilitet analyser, i nærvær og fravær av en spesifikk inhibitor av kanalen. Slående forskjeller ble observert i migrasjon evne under påvirkning av KCa3.1 kanal hemmer, TRAM-34. I en tidligere papir fant vi at tre mikrometer TRAM-34 hemmet U87MG motilitet med 58,5% [40]. I dette arbeidet viser vi at den samme konsentrasjonen av kanalblokker reduserte bevegeligheten av U87MG-NS, stammen lignende avledet undergruppe U87MG, med 66%.
Ved å ansette patch-clamp teknikkene vi har også vært i stand for å undersøke med hensyn til gjeldende aktivitetsforskjeller mellom CD133 positive og negative fraksjoner som er tilstede i U87MG-NS befolkning. Dette tillot oss å anslå en K dagens 2,6 ganger høyere i CD133
+ prøven. Enda mer slående var reduksjonen av 2B5 motilitet (-75%) under påvirkning av trikke-34 sammenlignet med den reduksjon observert i FCN9 (-32%). Den observerte nedgangen i motilitet godt korrelerer med nivåene av KCa3.1 kanal uttrykk i de to cellelinjer, på grunn av større følsomhet for 2B5 å TRAM-34. Det finnes korrelasjon vises mer signifikant i lys av det faktum at den KCa3.1 kanalen er bare en av et antall forskjellige typer av ionekanal som fremmer cellemobilitet. Samlet sett viser våre resultater at KCa3.1 kanalen uttrykk og funksjon er mer uttalt i mindre differensierte bestander, favoriserer en mer innflytelsesrik rolle på motilitet fenotype.
Den svært invasive evne in vivo er et kjennetegn på stilk celler. Videre har det også vært en teori om at det finnes to typer av cscs, en stasjonær og den andre mobile [48]. Dette reiser spørsmålet om hvorvidt ion flyt reduksjon drives av TRAM-34 endrer cellemotilitet direkte eller via et signal som virker på den fenotypiske overgang fra stasjonær til mobil, gjennom en ukjent regulatorisk vei. Denne siste hypotese er attraktivt i lys av de meget nylige observasjoner som viser at blokkering av plasmamembranen natrium-kanal-komplekset inhiberer proliferasjon av gliomceller, i tillegg til migrasjon, og at dette mest sannsynlig involverer endringer i genekspresjon program gjennom en mekanisme som ikke ennå løst [49]. Også for de KCa3.1 kanaler vi kan ikke utelukke en sammenheng mellom modulering av gjeldende aktivitet og genuttrykk omprogrammering. Dette spørsmålet forblir uløst.
Materialer og metoder
cellekulturer
De etablerte mus og menneske glioblastom cellelinjer, (GL261 og U87MG) ble dyrket i henholdsvis D-MEM F -12 og D-MEM-medium (Invitrogen) supplementert med 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1% L-glutamin, 100 IU /ml penicillin, 100 IU /ml streptomycin og 10% føtalt kalveserum (FCS, Flow Laboratories) ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktig atmosfære i luft. Mus og menneske glioblastom kulturer GL261 og U87MG ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rochville, MD, USA). Astrocytom primære MZC12, CRL8 og FCN9 (WHO grad IV) ble gjort i et tidligere arbeid av vår gruppe fra vevsprøver av pasienter [50]. Detaljer om institusjonell komiteen godkjenning og informert samtykke fra pasientene er oppgitt i ovennevnte referanse.
