Abstract
Pescadillo er en nukleolært protein som har blitt foreslått å være involvert i fosterutviklingen og ribosom biogenesis. Deregulert uttrykk for menneskelig pescadillo (PES1) ble beskrevet i noen svulster, men dens presise roller i tumorigenesis fortsatt uklart. I denne studien genererte vi tre monoklonale antistoffer som gjenkjenner PES1 med høy spesifisitet og sensitivitet, med hvilken PES1 ekspresjon i humane tykktarmskreft ble analysert immunhistokjemisk. Ut av 265 tykktarm kreft vev, 89 (33,6%) viste positiv PES1 uttrykk, som var betydelig høyere enn i ikke-cancerous vev (P 0,001). Stanse av PES1 i tykktarm kreft celler resulterte i redusert spredning, redusert vekst av xenografter, og cellesyklus arrest i G1 fasen, noe som indikerer PES1 fungerer som et onkogen. Vi deretter utforsket mekanismen som PES1 ekspresjon blir styrt i humane tykktarmkreftformer og vist at c-Jun, men ikke JunB, JUND, c-Fos, eller mutant c-Jun, positivt regulert PES1 promoter transkripsjonsaktivitet. I tillegg kartla vi -274 /-264 regionen PES1 promoter som c-Jun bindende sekvens, som ble godkjent av kromatin immunpresipitering og elektromobilitet skift analyser. Dessuten viste vi en positiv sammenheng mellom c-Jun og PES1 uttrykk i tykktarm kreft celler og tykktarm kreft vev. Upstream av c-Jun, ble det avslørt at c-Jun NH2-terminal kinaser (JNK) er avgjørende for å kontrollere PES1 uttrykk. Vår studie, i første omgang, avdekker onkogene rolle PES1 i tykktarmskreft og belyser den molekylære mekanismen regi PES1 uttrykk
Citation. Xie W, Feng Q, Su Y, Dong B, Wu J, Meng L, et al. (2012) Transkripsjonell Regulering av PES1 Expression av c-Jun i Colon Cancer. PLoS ONE syv (7): e42253. doi: 10,1371 /journal.pone.0042253
Redaktør: Antonio Moschetta, University of Bari Consorzio Mario Negri Sud, Italia
mottatt: 20 januar 2012; Godkjent: 05.07.2012; Publisert: 30.07.2012
Copyright: © Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National 973 Program of China (2009CB521805) og Nature Science Foundation National of China (81172367). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pescadillo
koder for et nukleolært protein med flere motiver, blant annet en BRCA1 C-terminal (BRCT) domene, klynger av sure aminosyrer domener, flere kjernefysiske lokalisering signaler, og en fredet område for SUMOylation [1]. Det ble først identifisert som et gen vesentlig for sebrafisk embryonal utvikling [2]. De etterfølgende studier har funnet at pescadillo ble svært konservert fra gjær til menneske [1], [3] – [5]. Humant ortolog av Pescadillo (PES1) danner et stabilt kompleks med Bop1 og WDR12 (PeBoW kompleks), noe som er avgjørende for nukleolært lokaliserings og dens funksjon i rRNA behandling [6] – [8]. BRCT-slettet eller -mutated form av PES1 er mindre stabil og kan ikke bli innlemmet i PeBoW komplekset [9]. En annen nukleolært protein B23 fysisk samhandler med PES1 og er involvert i å kontrollere nukleolært lokalisering av PES1 [10]. Pescadillo har vist seg å spille en viktig rolle i normal embryoutvikling, ribosom biogenese, DNA-replikasjon, kromosomstabilitet, og cellesyklusprogresjon. Forstyrrelse av pescadillo eller dets ortologer i gjær, zebrefish og mus svekket embryoutvikling [2], [3], [11], [12]. PES1 spiller en kritisk rolle i pre-prosessering rRNA og 60S ribosomale subenhet modning, ved dannelse av PeBoW komplekset [3], [7], [9], [13]. Dessuten knockdown av PES1 indusert cellesyklus-stans og redusert fosforylering av retinoblastom protein (Rb) [14]. Videre PES1 har vært vist å binde DNA direkte, og for å regulere gentranskripsjon [15], som tyder på at PES1 er et multifunksjonelt protein som bidrar til forskjellige biologiske prosesser.
Nylig ble deregulert ekspresjon av PES1 funnet å være assosiert med kreftutvikling [1], [16] – [18]. PES1 ble unormalt oppregulert hos voksne mennesker glioblastomas [1], hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCCs) [19], og magekreft [20]. PES1 uttrykket ble også betydelig økt i bryst kreft celler og vev hos både mRNA og protein nivå [21], og ble muligens kontrollert av østrogen [22]. I tillegg har PES1 vært knyttet til kromosomal ustabilitet [18], [23] og transformasjon av pattedyrceller [16]. Til tross for disse funnene, er lite kjent om den nøyaktige rollen PES1 i tumorigenesis og de faktorer regi PES1 uttrykk fortsatt ikke bestemt.
I denne studien, viste vi høy uttrykk for PES1 i tykktarm kreft vev. Vi fant ut at PES1 spiller en onkogen rolle i å fremme spredning av tykktarmskreftceller og tumordannelse i naken mus modell. Transkripsjonsfaktor c-Jun forbedrer PES1 uttrykk ved å binde seg til arrangøren regionen PES1 og positiv korrelasjon mellom c-Jun og PES1 uttrykk er tydelig i tykktarm kreft celler og vev.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
samlingen av vevsprøver ble godkjent og overvåket av forskningsetiske komité for Peking University Cancer Hospital Institutt. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før operasjon. Dyrestudier, inkludert antistoffproduksjon og xenograft tumor modell, ble godkjent og overvåket av forskningsetiske komité for Peking University Cancer Hospital Institute.
Material
Expression plasmider for c-Jun, JunB, Jund og c-Fos ble vennlig levert av Dr. Zhihua Liu (Peking Union Medical College, Kina). Den doble mutant c-Jun-S63A /S73A var en gave fra Dr. Dirk Bohmann (University of Rochester Medical Center). pGL3-Basic og PRL-SV40 plasmider ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA). Antistoffer mot c-Jun (H-79, SC-1694) og c-Fos (sc-52) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mot JunB (D253, BS1196) og JUND (V249, BS1198) var fra BioWorld Technology (St. Louis Park, MN, USA). Antistoff mot JNK1 (ab27709) var fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-β-actin ble kjøpt fra California Biovitenskap (Coachella, CA, USA). Anti-GAPDH var fra ProteinTech (Chicago, IL, USA). Kinase hemmere U0126 og LY294002 ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). SP600125 ble kjøpt fra Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Generering av monoklonalt antistoff
Hybridomer som utskiller anti-PES1 antistoffer ble generert i henhold til en standard protokoll. Kort fortalt ble fem kvinnelige BALB /c mus (kjøpt fra Animal Center of the Chinese Academy of Medical Sciences) immunisert med rekombinant GST-PES1 protein (50 mikrogram per mus) emulgert i Freund adjuvans (Sigma) fire ganger på tre ukers mellomrom. På dag 4 etter den siste immunisering ble milten fjernet fra en immunisert mus og cellene ble fusjonert med SP2 /0-myelomceller, ved bruk av 50% (volum /volum) polyetylenglykol 4000 (Merck, Darmstadt, Tyskland). Hybridomer ble dyrket i et HAT (hypoxantin, aminopterine, og tymidin, Sigma) seleksjonsmediet. Etter 14 dager ble supernatantene høstet og undersøkt for tilstedeværelse av spesifikke anti-PES1 monoklonale antistoffer (mAbs) ved hjelp av ELISA. De stabile hybridomer ble utvidet og mAbs ble renset ved protein A /G-koblede Sepharose perler (Invitrogen) kromatografi.
Cell kultur og transfeksjon
HCT116, SW480, RKO, og AGS cellene innhentet fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler ble opprettholdt i DMEM eller RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en 5% CO
2 miljø. For transfeksjon ble cellene sådd i kultur plater, vokst til 50-80% konfluens og transfektert med plasmider eller siRNA bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. I DNA plasmid transfeksjon, ble 1,6 mikrogram DNA brukes per brønn for 12-brønn kultur plate. I siRNA transfeksjon, ble 50 pmol siRNA benyttes per brønn i 12-brønners kulturplate. Etter transfeksjon ble cellene inkubert i ytterligere 48-72 timer før de ble høstet for luciferase-assay eller genekspresjon testing. Alternativt, etter transfeksjon i 48 timer, ble cellene behandlet med de angitte kinaseinhibitorer for en annen 36 timer. siRNA sekvenser som brukes til å slå ned uttrykket av c-Jun og JNK1 var som følger: siRNA-c-Jun, GCAAAGAUGGAAACGACCUUCUAUGTT; siRNA-JNK, AAAGAAUGUCCUACCUUCUTT.
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i en modifisert RIPA-buffer inneholdende 50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM Na
3VO4, 20 mM NaF, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS og 1 x protease inhibitor cocktail (Roche, Mannhelm, Tyskland). Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkering med 5% fettfri melk i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 2 timer ved romtemperatur ble membranene inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff konjugert til pepperrotperoksidase (Jackson, West Grove, PA). Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence deteksjon (Pierce, Rockford, IL, USA). Relative optiske tettheter av proteinbåndene til at lastekontroll (GAPDH) ble kvantifisert ved Scion Bilde programvare.
Immunhistokjemisk analyse
For immunhistokjemisk farging, alle kliniske prøvene ble løst i nylaget 10% nøytral bufret formalin, innstøpt i parafin, og skåret i 5 mikrometer seksjoner. Etter baking ved 60 ° C over natten, ble seksjoner avvokset og rehydrert. Deretter ble antigenet retrievaling utført via høytrykkskoke i EDTA (pH 8,0, Zymed). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering i 3% hydrogenperoksid i 10 minutter ved romtemperatur. Etter blokkering med 5% fettfri melk ble snittene inkubert med spesifikk PES1 mAb 3b1 (1:500) ved 4 ° C over natten etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff fra EnvisionTM kit (Dako Cytomation, Cambridge, UK) i 45 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsproduktet ble visualisert med diaminobenzidin (DAB, Sigma) i 5 minutter ved romtemperatur og ble seksjonene motfarget med hematoksylin. Renset IgG fra normalt museserum ble anvendt som en negativ kontroll. Resultatene ble vurdert uavhengig av to patologer (Q.F. og bd). Prøven med mer enn 20% farging celler ble klassifisert som positive saken.
Hemming av PES1 av RNA interferens
Å stabilt slå ned endogen PES1 uttrykk, brukte vi lentivirus pakking shRNA uttrykk vektor ( kjøpt fra GenePharma, Shanghai, Kina) for å infisere celler. Målceller ble infisert med lentivirus for 24-48 timer i henhold til produsentens instruksjoner. Den RNAi oligonukleotider sekvensen brukt til å slå ned endogen PES1 uttrykk er som følger: PES1-RNAi-en, GGAACACTGTAGAGCGTTTAA; og PES1-RNAi-2, GAAGATGCAGAGGCTGGTTCA.
proliferasjonsanalyse
Cellene ble sådd ut på 96-brønners plater ved initial densitet på 1,0 x 10
3 per brønn. På hvert tidspunkt ble cellene farget med steril MTT (Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium, 0,5 mg /ml, Sigma) i fire timer ved 37 ° C, etterfulgt av fjerning av kulturmedium og tilsetting av 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO). Absorbansen ble målt ved anvendelse av en mikroplateavleser ved en bølgelengde på 490 nm. Alle forsøk ble utført in triplo.
kolonidannelse assays
Cellene ble sådd ut på 6-brønners plater (1 x 10
3-celler per brønn) og dyrket i to uker. Koloniene ble farget med 0,5% krystallfiolett i 30 min etter fiksering med metanol i 30 minutter ved romtemperatur.
cellesyklusanalyse
Cellene ble høstet ved sentrifugering, vasket to ganger med iskald PBS og fiksert i 75% etanol (i PBS) ved 4 ° C over natten. Etter vasking to ganger med kald PBS, ble cellene resuspendert i PBS inneholdende 0,1 mg /ml RNase (Sigma). Etter 30 minutter ved 37 ° C, ble cellene resuspendert i PBS inneholdende 50 ug /ml propidiumjodid (PI) og deretter analysert med et strømningscytometer (BD, Ironman). Cellesyklus distribusjon ble beregnet ved hjelp av Cell Quest og Mod-fit programvare.
Tumor xenograft analysen
nu /nu hunnmus (fra Vital River Laboratories, Beijing, Kina) mellom 7 og 8 uker ble brukt for
in vivo
studier. Hver forsøksgruppe besto av 4-5 nakne mus. 4 x 10
6-celler i 100 ul PBS ble injisert subkutant inn i armhulen på nakne mus. Etter 22 dager, ble musene scarified og tumorene ble fjernet og veiet. Dataene som vises, er middelverdier ± SD fra mus i hver gruppe.
Genekspresjon mikromatriser
RNA ble ekstrahert fra celler med Trizol reagens (Invitrogen) ifølge protokollen foreslått av leverandøren. Genuttrykk profiler i PES1-forstummet HCT116 og kontrollceller ble undersøkt ved hjelp av Agilent Human Genome CGH Microarray 44K. Etter normalisering ble foldendring uttrykket beregnes. AP verdi mindre enn 0,05 og fold-endring terskel 2 ble valgt for å identifisere de statistisk signifikante transkripsjons endringer.
Luciferase assay
For å analysere promoter aktivitet PES1, 5′-flankerende område pluss 172 bp av transkribert PES1 sekvensen ble generert ved PCR ved anvendelse av de følgende primere: forover, 5′- CCGCTCGAGCTGGCATTATCCTGGAGTCAC-3 «(Xhol sete er understreket), Reverse, 5′- CCCAAGCTTGAAAAGAGTCGACCCCATGC-3′ (HindIII-setet understreket). Det amplifiserte fragment fra det genomiske DNA av HCT116-celler ble innsatt i pGL3-basis plasmidvektor, og det resulterende plasmid ble benevnt som pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). De luciferase reporter plasmider, pGLB-PES1 (-1413 /+ 172), pGLB-PES1 (-902 /+ 172), pGLBPES11 (-416 /+ 172), pGLB-PES1 (-315 /+ 172), pGLB-PES1 (-282 /+ 172), pGLB-PES1 (-274 /+ 172), pGLB-PES1 (-264 /+ 172), pGLB-PES1 (-254 /+ 172) og pGLB-PES1 (-75 /+ 172 ) ble samlet inn pGLB-PES1 (-2060 /+ 172). pGLB-PES1-promoter eller 5»-sletting konstruksjonene ble transfektert med PRL-SV40 inn i cellene. Etter transfeksjon i 72 timer, ble cellene høstet i passiv Lysis Buffer (Promega) og cellelysatene ble analysert for luciferaseaktivitet med den doble luciferase reporter Assay System (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Luciferase aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase aktivitet.
Chromatin immunoprecipitation (chip)
Celler ble fiksert med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av vasking to ganger med iskald PBS og høstet ved skraping. Etter sentrifugering ble cellepelletene lysert i 400 ul lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 x protease inhibitorer cocktail). Prøvene ble inkubert på is i 10 minutter og lydbehandlet fire ganger i 15 sekunder hver gang med intervaller på 15 sekunder for å oppnå kromatin fragmenter på omtrent 200-1000 bp nukleotider. Prøvene ble sentrifugert ved 12.000 rpm, 4 ° C i 10 min. Etter fjerning av en styrings aliquot (20 ul supernatanter ble fortynnet i 80 ul fortynningsbuffer og lagret ved -20 ° C), ble supernatanter fortynnet med 9 volumer chip fortynningsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 1 x protease inhibitorer cocktail). Prøver ble preinkubert med protein A /G-perler pluss 10 ug laksesperm-DNA ved 4 ° C i 2 timer, og deretter sentrifugert ved 1000 rpm, 4 ° C i 2 min. Supernatanter ble inkubert ved 4 ° C over natten med 0,2 ug c-Jun-spesifikt antistoff eller IgG som hadde blitt forinkubert med protein A /G-perler og 10 pg laksesperm-DNA. Perlene ble deretter vasket med TSE I (0,1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% NP-40), TSE II (0,1% SDS, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NaCl), TSE III (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% deoksykolat) buffere slår for en tid, etterfulgt av vasking to ganger med TE-buffer (pH 8,0). Etter den siste vasking ble immunopresipitatene eluert og omvendt tverrbundet ved inkubering over natten ved 65 ° C i elueringsbuffer (1% SDS, 100 mM NaHCO
3). DNA ble deretter renset med en PCR-rensesett (Qiagen, Hilden, Tyskland). Elueres DNA ble PCR-forsterket med primere som omfatter den c-Jun bindingssete for PES1 promoter. Det kromosomale DNA-inngang og chip-DNA med ikke-spesifikk IgG ble underkastet den samme PCR-amplifisering. PCR-produktene ble separert på en 2% agarosegel inneholdende etidiumbromid, og detektert via ultrafiolett belysning. De følgende primere ble anvendt for PCR. Spesifikke primere for c-Jun binding (Primer-S, 139 bp fragment, -363 til -225 regionen PES1 promoter), Forward primer, CTTGACAACGCAATCCTATCG; Omvendt primer, CCTGATGACGATTCATTGACTGT; og negative kontroll primere (Primer-N, 110 bp fragment, -1473 til -1364 regionen PES1 promoter), Forward primer, CAACTAGCTGGGGTTACAGG; Omvendt primer, GAGATCAGGAGTTTGAGAC. Følgende antistoffer ble brukt. Kanin polyklonale anti-c-Jun (H-79, Santa Cruz) og kanin normal IgG (Santa Cruz)
Elektro mobilitet skift analyse (EMSA)
Celler ble vasket to ganger med iskald PBS og høstet ved skraping. Etter sentrifugering ble cellepelletene resuspendert i 160 ul iskald buffer A (10 mM Hepes, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF), og inkubert på is i 20 min. Og deretter ytterligere 40 ul buffer A inneholdende 2,5% NP-40 ble tilsatt til prøven med intermitterende virvling i 10 sek. Etter sentrifugering 12 000 rpm ved 4 ° C i 5 minutter, ble cellepelletene resuspendert i 40 ul iskald buffer B (20 mM Hepes, 400 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) og plassert på is med periodisk virvelblanding i 25 min. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering. Supernatanter inneholdende kjerneprotein ble lagret ved -70 ° C. Bindingsanalyser ble utført ved inkubering av 8 ug kjerneprotein i bindingsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 10 pg laksesperm DNA) med 30 fmol biotin-merkede oligonukleotider i et endelig volum på 20 ul i 20 minutter ved romtemperatur. For kald konkurranse, ble et 1000 gangers overskudd av de umerkede oligonukleotider tilsatt til bindingsreaksjon 20 min før tilsetning av de merkede oligonukleotider. For supershift assays, ble 0,1 ug antistoff inkubert med bindingsblandinger inneholdende 10 fmol biotin-merket probe i 40 minutter ved romtemperatur. DNA-proteinkomplekser ble separert ved elektroforese gjennom en 6% polyakrylamidgel innebygd i 0,5 x TBE ved 100 V i 180 minutter ved 4 ° C. Gelene ble deretter overført til en positivt ladet nylonmembran. De bundne probene ble visualisert ved hjelp av HRP-konjugert streptavidin og kjemiluminescerende substrat (Thermo Chemiluminescent nukleinsyre deteksjon kit). Oligonukleotid-prober som brukes i EMSA var som følger: Probe1, CTTCCGCCCCTCTCCGTCCCAACATGCAAC (-284 /-255 sekvens av PES1 promoter); Probe-W (som inneholder tidligere identifiserte villtype c-Jun bindende sekvenser), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCTGACTCACCCGGGCCCGGG; Probe-Am (inneholdende muterte AP-1 bindende sekvenser), GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCGTCGGATCCCGGGCCCGGG [24]. De prober ble syntetisert og merket med biotin av SBS Genetech (Beijing, Kina). Den komplementære oligonukleotider ble varmebehandlet i 20 mM Tris (pH 7,6), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, og 1 mM DTT.
Sanntids revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon
Total cellulær RNA ble ekstrahert fra celler med TRIzol reagens (Invitrogen) og revers transkribert til cDNA ved hjelp ImProm-II ™ Reverse Transcription System (Promega). Den kvantitative PCR ble utført med ABI StepOne Real-Time PCR system (Applied Biosystems) med SYBR Grønn Realtime PCR Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Alle reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Relativ genekspresjon ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode å følge produsentens instruksjoner. Housekeeping genet glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
(GAPDH)
ble brukt som intern kontroll til å normal
PES1
mRNA uttrykk. Følgende primere ble brukt:
PES1
, frem CCCAAGCAGAGGCAAAGG, reverse CTGACATCTCCCCATCGG;
c-Jun
, fremover CGCCCCTGTCCCCCATCG, reverse TGTGCCACCTGTTCCCTG;
GAPDH
, frem CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG, omvendt CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG. Grunning av kvantitativ RT-PCR for validering av resultatene av microarray ble oppført i tabell S1.
Statistisk analyse
Dataanalyse ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). En to-halet uavhengig-prøve
t
test ble anvendt for å bestemme signifikans av forskjeller mellom ulike forsøksgrupper. Korrelasjonen av c-Jun og PES1 i tykktarm kreft vev ble analysert ved Pearson korrelasjonskoeffisient med SPSS programvare. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant ved P 0,05
Resultater
PES1 er overuttrykt i tykktarmskreft
Vi først genererte tre monoklonale antistoffer (mAbs) anerkjenner menneske PES1.. Gjennom ELISA og Western blot-analyse, ble disse tre mAbs vist til spesifikt å binde til GST-PES1 protein, men ikke til GST (fig. S1A og S1B). Videre kan disse mAb’er gjenkjenne endogent PES1 i Western blot-assay (fig. S1C). Deretter fikk vi bekreftet spesifisiteten av mAb 3b1 ved å analysere totale cellelysater av kontroll og PES1 shRNA-transfekterte AGS magekreftceller. Et proteinbånd som tilsvarer den forventede molekylstørrelse av PES1 (69 kD) ble ablateres med en kort hårnål RNA (shRNA) mot PES1 (fig. S1D). I tillegg demonstrerte vi at mAb 3b1 kunne anvendes i ELISA, Western blot og immunocytokjemi analyse med høyere følsomhet og affinitet, sammenlignet med en kommersiell antistoff (fig. S1E-G).
For å undersøke ekspresjon av PES1 i tykktarm kreft vev, utførte vi immunohistochemistical analyse av humane tarmkreft vev og matchet tilstøtende vev med mAb 3b1. Som vist i figur 1A og 1B, PES1 oppviste sterk nukleær farging (brun kjerner) i kreftceller og lymfeknuter, respektivt. Ut av de 265 tykktarm kreft vev, 89 (33,6%) var positive for PES1 uttrykk, mens bare 2,7% (7/265) av tilstøtende vev viste PES1 farging (Fig. 1E). Forskjellen fra PES1 uttrykk mellom tykktarmskreft vev og ikke-cancerøse vev var signifikant (P 0,001). Videre, 20/40 (50%) av lymfeknuter viste positiv farging PES1, også signifikant høyere (P 0,001) enn i ikke-cancervev. Derfor er disse resultatene indikerte PES1 uttrykk var oppregulert i humane tarmkreft vev.
Immunhistokjemisk analyse av PES1 uttrykk i menneskelige kolon kreft vev. Tallene viser den sterkeste kjerner farging av PES1 i colon cancer vev (A) og lymfeknuter (B). Negativ farging av PES1 i ikke-cancervev i tilknytning til tumoren ble vist i (C). Normal mus IgG ble anvendt som en negativ kontroll i tykktarmskreft vev og vist i (D). Representant lav (× 100) og høy (× 400) forstørrelse vises. (E) Sammendrag av PES1 uttrykk i menneskelige tykktarm kreft vev, matchet tilstøtende vev, og lymfeknuter. en indikerer signifikant forskjell mellom tykktarmskreft versus matchet nærliggende vev. b indikerer signifikant forskjell mellom lymfeknuter versus tilstøtende noncancerous vev.
PES1 fremmer tykktarmskreft cellevekst og vekst
in vitro Hotell og
in vivo
for å undersøke den biologiske funksjonen til PES1 i patogenesen av tykktarmskreft, ble lentiviral-mediert stabil ablasjon av PES1 utført i HCT116, RKO, og SW480 kolon kreftceller med to par shRNAs. Begge shRNA effektivt dempet ekspresjonen av endogene PES1 i disse cellelinjer (Fig. 2A). In vitro-analyser avdekket at uttømming av endogent PES1 resultert i betydelige inhibering av celleproliferasjon (fig. 2B) og kolonidannelse (Fig. 2C). Cellesyklusanalyse videre vist at cellene tendens til å akkumuleres i G1 fasen, men mindre i S-fasen, etter PES1 ablasjon (Fig. 2D), en indikasjon på G1 /S arrest. Imidlertid, ingen signifikant forskjell ble funnet i den stadige nivåene av apoptotiske celler mellom kontroll og shRNA PES1-spesifikke shRNAs-transfekterte celler (data ikke vist). Videre inokulert vi den PES1-ablateres HCT116 og RKO celler inn i nakne mus for å undersøke effekten av PES1 på xenograft tumordannelse. Som vist på fig. 2E, stanse av PES1 hemmet tumorvekst
in vivo
.
(A) Western blot analyse for PES1 protein i HCT116, RKO, og SW480 celler transduced med shRNA-kontroll og PES1 shRNA konstruerer ( PES1-shRNA-en og PES1-shRNA-2), henholdsvis. (B) Vekstkurver av angitte celler transdusert med PES1 shRNAs, som undersøkt ved MTT-assay. Verdier presentert representerer middel ± SD fra tre uavhengige forsøk. (C) stanse av PES1 redusert kolonidannelse. Bildene viser resultatene av koloni-dannelsen analyse av celler i platen (venstre panel). De relative koloninummer (høyre panel) ble oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter. (D) stanse av PES1 resulterte i cellesyklus arrest. Kvantifisering av cellesyklus fordelinger ble avledet fra tre uavhengige eksperimenter. Verdier representerer betyr ± SD. (E) Dempe endogene PES1 hemmer tumorvekst av HCT116 og RKO celle i nakne mus. Høyre panel viser tumor vekten av shRNA-kontroll og shRNA-en. Verdier presentert representerer gjennomsnitt ± SD.
For å få innsikt i PES1 biologiske funksjoner, utførte vi microarray analyse med PES1 stabilt forstummet HCT116-celler og kontrollceller. Gener med samme mønster av endringer i både shRNA-1- og shRNA-2-transfekterte celler ble plukket opp. Totalt 633 gener ble identifisert til å være annerledes uttrykt (enten to gangers økning eller reduksjon) ved PES1 stanse, inkludert 305 oppregulert og 328 nedregulert gener. Bioinformatical analyse ble utført for å identifisere trasé berørt av PES1 ablasjon med Gene Ontologi analyseverktøyet (Fig. S2A). Disse banene ble rangert slik signifikans (p-verdier). I samsvar med resultatene av funksjonell analyse, gener knyttet til kontroll av celleproliferasjon utgjør den primære kategorien påvirket av PES1 ablasjon (Fig. S2A). Vi deretter undersøkt uttrykk for fire nedregulert gener (
BCL2
,
fgf9
,
satb1
, og
AVP
) og fire oppregulert gener (
id3
,
msx2
,
gdf11
, og
smad3
) ved kvantitativ RT-PCR i HCT116 og SW480 celler, og bekreftet resultatene av microarray analyse (fig. S2B).
PES1 uttrykk er regulert av c-Jun i tykktarm kreft celler
Vi var interessert i å finne ut den faktoren (e) som kontrollerer PES1 overekspresjon i tykktarm kreft vev . Foreløpige data antydet at det var høyere nivå av PES1 mRNA-ekspresjon i colon cancer vev enn i kamp tilstøtende vev, men ingen deregulert metylering ble funnet i promoterregionen av PES1-genet (data ikke vist). Videre ble flere potensielle transkripsjonsfaktorbindingssteder innenfor PES1 promoter identifisert, inkludert aktivator protein-1 (AP-1) bindingssteder. For bedre å forstå den transkripsjonelle regulering av PES1, ble 2060 bp av 5′-flankerende sekvens av PES1-genet og 172 bp av den transkriberte sekvens klonet fra HCT116-celler og subklonet inn i pGLB luciferase reporter plasmid. Vi neste undersøkt om AP-en kan regulere PES1 transkripsjon. Den transkripsjonsfaktor AP-1 består av flere komponenter, for eksempel c-Jun, JunB, JUND og c-Fos, som danner homo- eller hetero-dimer for å binde promotersekvensene nedstrøms gener [25]. Reguleringen av disse AP-1-underenheter på PES1 promotoren ble undersøkt ved hjelp av luciferase reporter-analyse. Den pGLB-PES1-promoter (-2060 /+ 172) var co-transfektert med c-Jun, JunB, Jund eller c-Fos inn HCT116 og SW480 celler, hvis uttrykk ble validert av Western blot (Fig. 3A). PES1 promoter aktivitet ble sterkt økt med c-Jun, men minimalt av andre subenheter (Fig. 3B). Vi testet også synergieffekter av c-Jun og c-Fos på PES1 promoter aktivitet. For å oppnå dette, pGLB-PES1-promoter (-2060 /+ 172) var co-transfektert med c-Jun pluss c-Fos. Luciferaseaktiviteten indusert av co-trans med c-Jun pluss c-Fos ble ikke signifikant økt, og enda lavere enn ved c-Jun alene (figur 3B.), Noe som tyder på at heterodimerisering mellom c-Jun og c-Fos er utilstrekkelig for å fostre arrangøren aktivitet PES1. Fosforylering av serin-63 og serin-73 i NH
2-terminale trans domenet av c-Jun ved JNK (c-Jun NH
2-terminale kinaser) er avgjørende for den transkripsjonelle aktivitet av c-Jun [ ,,,0],26]. Vi la merke til at substitusjon av disse serinresidua med alaniner (c-Jun-S63A /S73A) sterkt svekket fosforylering (Fig. 3C) og PES1 promoter aktivitet (Fig. 3D), noe som tyder på at fosforylering av c-Jun er kritisk for å aktivere PES1 uttrykket.
(A) Western blot analyse påvise ektopisk c-Jun, JunB, Jund og c-Fos i HCT116 og SW480 celler. GAPDH er vist som en lasting kontroll. (B) Luciferase reporter analysen i tykktarm kreft celler. pGLB-PES1-promoter (-2060 /+ 172) var co-transfektert med angitt plasmider inn HCT116and SW480 celler. Relativ luciferaseaktivitet ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. Den tomme vektor ble anvendt som kontroll, og den relative luciferaseaktiviteten ble satt til 1. (C) Ekspresjon av vill-type, og c-Jun-S63A /S73A i HCT116 og SW480-celler. Fosforylering av c-Jun ble også påvist. (D) pGLB-PES1-promoter (-2060 /+ 172) var co-transfektert med c-Jun eller c-Jun-S63A /S73A i HCT116 og SW480 celler, så reporteren analysen ble utført som i (B).
c-Jun regulere PES1 promoter aktivitet ved direkte binding til PES1 arrangøren
for å kartlegge c-Jun bindingssete på PES1 arrangøren, en serie av 5′-delesjonsmutanter ble generert og analysert ved co-transfeksjon med c-juni Sammenlignet med regionen -2060 /+ 172, videre sletting,
dvs.
-1413 /+ 172, -902 /+ 172, -416 /+ 172, -315 /+ 172, -282 /+ 172, og -274 /+ 172, ikke markert endre reporter aktivitet, men ytterligere sletting -274 til -264 forårsaket en ~80% reduksjon i luciferase aktivitet (fig. 4A). I mellomtiden, analyserte vi delesjonsmutanter i fravær av eksogent c-Jun, og også funnet at sletting -274 til -264 markert redusert rapportøraktivitet (fig. 4A) .Disse data tyder på -274 /-264 er en potensiell c -Jun bindende sekvens på PES1 promoter. Vi neste gjennomført kromatin immunoprecipitation (chip) analyse for å underbygge c-Jun sin binding til PES1 arrangøren. Som vist på fig. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting.
