Abstract
DEAD boksen RNA helicase p68 (Ddx5) er en viktig androgen reseptor (AR) transkripsjonen co-aktivator i prostatakreft (PCA) og er over-uttrykt i sent stadium sykdommen. β-catenin er en multifunksjonell protein med viktige strukturelle og signaleringsfunksjoner som er oppregulert ved PCA og lignende til p68, samhandler med AR å co-aktivere uttrykk for AR målgener. Viktigere, danner p68 komplekser med kjernefysisk β-catenin og fremmer gentranskripsjon i tykktarmskreft indikerer en funksjonell samspillet mellom disse to proteinene i kreft progresjon. I denne studien undersøker vi forholdet mellom p68 og β-catenin ved PCA for å vurdere sitt potensial samarbeid AR-avhengige genuttrykk, som kan være av betydning i utviklingen av kastrering resistent prostatakreft (CRPCa). Vi bruker immunoutfelling å demonstrere en ny interaksjonen mellom p68 og β-catenin i kjernen av PCA-celler, som er androgen avhengig i LNCaP-celler, men androgen uavhengig i et hormon ildfast derivat av den samme cellelinje (representativ for CRPCa sykdom type). Forbedret AR-aktivitet er sett i androgen-avhengige luciferase reporter-analyser ved transient ko-transfeksjon av p68 og β-catenin som en additiv effekt, og p68-utarmet Kromatin-Immunoutfelling (chip) viste en reduksjon i rekruttering av AR og β- catenin til androgen responsive promoter regioner. I tillegg fant vi p68 immunoutfelt med processive og ikke-processive form av RNA polymerase II (rnap II) og showet p68 rekruttert til forlengelse regioner av AR mediert
PSA
genet, tyder på en rolle for p68 i å tilrettelegge rnap II transkripsjon av AR mediert gener. Disse resultatene tyder på p68 er viktig å legge til rette β-catenin og AR transkripsjonen aktivitet i PCA celler
Citation. Clark EL, Hadjimichael C, Temperley R, Barnard A, Fuller-Pace FV, Robson CN (2013) p68 /DdX5 Støtter β-catenin Rnap II under androgen Receptor mediert transkripsjon i prostatakreft. PLoS ONE 8 (1): e54150. doi: 10,1371 /journal.pone.0054150
Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrike
mottatt: Mai 29, 2012; Godkjent: 07.12.2012; Publisert: 17 januar 2013
Copyright: © 2013 Clark et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prostata Handling Charity [PCRF9 /07 til CNR ELC]; og Medical Research Council, Cancer Research UK, og Department of Health prostatakreft Mekanismer av progresjon og behandling (spørsmål) samarbeid [G0100100 /64424 til CNR]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
inntreden og utvikling av prostatakreft (PCA) er drevet av transkripsjonelle funksjon av androgenreseptoren (AR), og ablasjon av androgener er en effektiv strategi ved tidlige stadier av sykdommen [1]. Men, PCA kan utvikle seg til en kastrering resistent prostatakreft (CRPCa) fenotype som er for tiden botemiddel [1], [2]. Avvikende aktivering av AR antas å spille en fremtredende rolle i utviklingen av CRPCa; en prosess postulert å være delvis medieres via ukontrollert aktivering av ko-aktivator-proteiner som letter ekspresjonen av AR-responsive gener i en minimal hormon miljø [3]. Forstå de molekylære hendelser der progresjon til CRPCa oppstår, kan føre til identifisering av nye mål og forbedre overlevelse av pasienter med sykdom.
β-catenin er en integrert del av Wnt veien, spiller en rolle i signaltransduksjon. Den cytoplasmiske stabilisering og atom akkumulering av β-catenin er «kjennetegnet» for aktivering av Wnt signalveien (se vurderinger [4], [5]). I prostata-celler, er β-catenin funnet å være assosiert med liganded AR og virke som en AR ko-aktivator øker både Wnt og androgen responsiv gentranskripsjon (oversikt i [6] – [8]). Aktivert AR er i stand til pendel β-catenin inn i kjernen og forbedre AR transkripsjon, noe som indikerer en ligand avhengig interaksjon [9]. Men xenografter høstet fra kastrering resistente mus også vist økt samlokalisering og samhandling av AR og β-catenin [10]. I LNCaP PCA-celler i fravær av androgener, H2-relaxin mediert fosforylering av Akt og GSK-3β som skyldes den stabiliserte cytoplasmisk akkumulering av β-catenin som deretter bundet til AR og translokert til kjernen, noe som tyder på at tilstedeværelsen av androgener er ikke essensiell for interaksjonen mellom AR og β-catenin under visse betingelser [11]. Interessant, samlokalisering og samhandling av AR og β-catenin ble ikke sett i svulster høstet fra ikke-kastrerte mus, noe som tyder på at dette samspillet er spesifikk for progresjon av PCa til CRPCa og garanterer videre etterforskning. Direkte bevis for β-catenin som en del av AR transkripsjonen komplekset har blitt demonstrert gjennom Chromatin Immunoutfellingsunder (chip) studier som viser β-catenin rekruttert til promotorområdene for både androgen og Wnt responsive gener i nærvær og fravær av androgener [11 ], [12]. Ytterligere bevis tyder på at veksten av metastatiske prostata tumorceller i benet er via androgen-mediert aktivering Wnt [13], og økte atom p-catenin nivåer er blitt korrelert med prostatakreft sykdomsprogresjon [14], [15]. I tillegg, reduksjon eller tap av E-cadherin som normalt sequesters β-catenin i plasmamembranen er postulert for å øke nivåer av celle β-catenin og markeds AR-aktivitet [7]. Samlet tyder dataene på en viktig rolle for β-catenin i utviklingen av PCa til CRPCa fenotype. Men det er klart at de nøyaktige mekanismene som β-catenin formidler mellom AR transkripsjonen aktivitet og vekst av CRPCa i fravær av androgener, fortjener videre undersøkelser.
RNA helicase p68 (Ddx5) er en vekst- og developmentally- regulert prototypic medlem av DEAD boksen familie på heli. p68 fungerer på mange cellulære prosesser ofte dysregulerte i kreft inkludert prosessering av pre-mRNA og alternativ spleising, celleproliferasjon, mikroRNA behandling (anmeldt i [16], [17]), og ribosom biogenesis [18]. p68 er også kjent for å interagere med flere komponenter i transkripsjonskompleks og for å ko-aktivere forskjellige transkripsjonsfaktorer slik som tumor suppressor p53, Estrogen Receptor α (ERα) og β-catenin (oversikt i [16], [19], [20 ]). Vi har tidligere demonstrert p68 over-uttrykt i PCa og fungerer som en ko-aktivator av AR [21]. I tillegg til prostatakreft, er p68 over-uttrykt i mange andre kreftcelletyper som tykktarm og bryst, noe som tyder på at p68 fungerer som en potensiell svulst promoter ([22] og anmeldt i [17]). p68 og den meget homologe proteiner P72 (Ddx17), er over-uttrykt og danner komplekser med β-catenin i kjernen av tykktarmskreftceller til å aktivere gentranskripsjon og fremme celleproliferasjon [22] – [24]. Tyrosin 593-fosforylert p68 også assosiert med β-catenin i cytoplasma av tykktarm kreft celler, hvor det fremmet β-catenin kjernefysisk trans via en RanGTPase Wnt-uavhengig sti gjennom interaksjon med β-catenin og forskyvning av Axin [25], [26 ]. Men motstridende forskning fant ingen bevis for at p68 var nødvendig for kjernefysisk translokasjon av β-catenin i samme celletype [27], og tyrosin 593-fosforylert p68 var ikke forskjellig fra villtype i sin evne til å stimulere β-catenin avhengige transkripsjon i en annen studie [23].
i denne artikkelen bruker vi immunpresipitering, chip og luciferase reporter teknikker i kombinasjon med siRNA oligo nukleotid knockdown, for å utforske forholdet mellom p68 med β-catenin å forstå den molekylære mekanismen som de potensielt formidler avvikende aktivering av AR og vekst av PCA celler, som en del av AR transcriptional komplekset.
Resultater
p68 og β-catenin Interact i Nucleus fra PCA Cells
Gitt at androgen reseptor (AR) knytter selvstendig med β-catenin og p68 i PCA celler [21], [28], og p68 og β-catenin samhandle i tykktarm kreft celler [23]. Vi spekulere en mulig treveis-protein interaksjon mellom det AR, β-catenin og p68 i PCA-celler. Ligand fri AR blir sekvestrert i cytoplasma av PCA-celler og på hormone binding beveger seg hovedsakelig inn i kjernen [29]. Tidligere har vi funnet p68 å være en kjernefysisk protein i PCA celler som lokalisering var uendret av androgen behandling [21]. Imidlertid har p68 blitt funnet i cytoplasma i kolon kreftceller, hvor den forbinder med β-catenin [23], [25], og β-catenin har blitt vist å interagere med AR i cytoplasma av PCA-celler og beveger seg inn i det kjernen i nærvær og fravær av androgener [9] – [11]. I lys av disse funnene, forsøkte vi å bekrefte lokalisering av β-catenin og p68 i LNCaP og hormonet ildfaste LNCaP-AI PCa cellelinje (se materialer og metoder). Som forventet respons på behandling R1881 (10 nM), AR translokert til kjernen i både LNCaP og LNCaP-AI-celler (Figur 1a). Androgen behandling ikke vesentlig endre den nukleære lokalisering av p68 i enten LNCaP eller LNCaP-AI-celler og på samme måte, for lokalisering av β-catenin var uforandret ved R1881 behandling. Proporsjonalt mindre β-catenin er funnet i kjernen i forhold til cytoplasma av LNCaP-celler, med proporsjonalt høyere i LNCaP-AI-celletype. Dette gjenspeiler tidligere funn som viste AR konstitutivt transporterer β-catenin inn i kjernen av LNCaP-AI celler som en tilpasning til androgen uavhengige forhold [10], [12].
A. Beskjæres immuno-blot bildene viser cytoplasma og atom LNCaP og LNCaP-AI PCA cellelysater (+/- R1881 10 nM, 8 timer), undersøkt sekvensielt med β-catenin, AR, p68, α-tubulin og TATA bindende (TBP) antistoffer . B. Samspill ektopisk p68 og β-catenin i COS-7 celler. Helcellelysater av COS-7 celler transfektert med pcDNA
3-p68-myc og PCer
3 + -Myc
6-β-catenin konstruerer (+/- R1881 10 nM, 8 timer), var immunopresipitert med henholdsvis β-catenin og p68 antistoff. Beskjæres Immuno-blotter ble probet sekvensielt med β-catenin, p68 og myc antibody.C. Interaksjon av endogent p68 og β-catenin i kjernen av LNCaP og LNCaP-AI PCA-celler i nærvær og fravær av androgener. Beskjæres immuno-blot bilder av LNCaP og LNCaP-AI atomlysatene, immunoutfelt med p68 antistoff (+/- R1881 10 nM, 8 timer), og undersøkt sekvensielt med β-catenin og p68. Pakk prøvene inneholder enten hele cellen eller kjernekraft lysat og protein G sepharose uten antistoff tilstede. Control (Con) prøver inneholde antistoff og protein G Sepharose i utvinning buffer bare.
Samtidig immunoprecipitation av HCT-116 cellelysater med β-catenin antistoff identifisert en endogen p68 interaksjon med β-catenin i hele lysater av tykktarmskreftceller [23]. Videre analyser ved hjelp av Myc-merket trunkeringer av p68 viste at COOH endestasjonen p68 var ikke i stand til å samhandle med β-catenin, og samspillet var gjennom helicase (N-terminal) domene av p68. Etter våre immuno-blot funn i figur 1A der både β-catenin og p68 ble funnet i kjernen av LNCaP og LNCaP-AI celler i nærvær og fravær av androgener, undersøkte vi om p68 og β-catenin direkte interaksjon i kjernen av PCA celler. Figur 1B viser ektopisk ko-immunoutfelling av over-uttrykte myc-merket p68 og β-catenin fusjonsproteiner i androgen-negative COS-7-cellelinje, både i nærvær og fravær av R1881 (10 nM). Viser at under
in vitro
forhold, p68 og β-catenin er i stand til direkte å binde uavhengig av AR og androgener. (N.B. jo høyere bandet i β-catenin immunutfelling blot er et ikke-spesifikt bånd detektert av myc-antistoff). Imidlertid endogent protein immunutfelt fra atom LnCap ekstrakter viste β-catenin-p68 interaksjon ble lettes i nærvær av androgener (R1881, 10 nM), men omvendt i LNCaP-AI-cellelinjen interaksjonen ble tilrettelagt i fravær av androgener ( R1881, 10 nM) (figur 1C). (N.B. motsatt immunoutfelling ved å bruke β-catenin antistoff for å trekke ned p68-proteinet ikke vist noen interaksjon mellom de to proteiner i enten LNCaP eller LNCaP-AI celletype, til tross for utallige forsøk med forskjellige antistoffer mot p-catenin). Vi har også funnet noe endogent interaksjonen mellom p68 og β-catenin i AR negativ PC3 cellelinjen (se fig S1 i støtteinformasjon), noe som indikerer at tilstedeværelsen av en funksjonell AR er muligens viktig for en endogen interaksjon mellom p68 og β-catenin i PCA celler [21], [28].
p68 Samhandler rnap II og rekrutteres til funksjonelle regioner av
PSA
Gene
Vi har tidligere beskrevet p68 som fungerer som en «adapter» eller «kobling» protein som kan koordinere tett integrerte prosesser av transkripsjonen initiering, forlengelse og mRNA spleising i AR-regulert genekspresjon [30]. Rekruttering av p68 til endogene AR responsive gener kan lette spliceosome montering og øke frekvensen av RNA polymerase II (rnap II) forlengelse, påvirker spleisesete anerkjennelse og fremme ekson hoppe i gryende transkripsjoner. På grunn av de etablerte roller beta-catenin og p68 spill i transkripsjonsstart AR regulerte gener, forsøkte vi å utvide disse funnene og undersøke forholdet mellom p68 med rnap II i PCA celler. Vi har funnet p68 immunopresipitert med både endogene processive (fosforylering i ser-2) og ikke-processive (fosforylering ved Ser-5) former rnap II i PCA-celler, både i nærvær og fravær av androgener (figur 2A R1881, 10 nM behandlingen ). Noe som indikerer en mulig rolle for p68-aktivitet (i tillegg til AR ko-aktivator funksjon), i løpet av forlengelses stadier av AR regulert transkripsjon. Vi har tidligere demonstrert av Chromatin-Immunpresipitasjon (chip) og QPCR analyse over en 100 minutters androgen behandling (R1881, 10 nM) tid selvfølgelig, en co-rekruttering av p68 med AR på androgen responsive promoter og forsterker regioner av AR regulert
PSA
genet [21]. Utvider på disse funnene, optimalisert vi qPCR primere til andre områder av
PSA
genet (i-mellom enhancer og promoter region (EP), exon 1, intron 2, exon 3, intron 3, ekson 5 og 3’dsF regioner), for å fastslå om p68 ble rekruttert til andre enn transkripsjonsstartsider. (NB primer beliggenhet og sekvensinformasjon for disse regionene kan finnes i tabell S1 i saksdokumenter. Det var ikke mulig å optimalisere qPCR primere til intron 1, exon 2, intron 4 eller ekson 4 regioner av
PSA
genet). Figur 2B viser signifikant (
p
0,05 *) differensial berikelse av AR på R1881 behandling (10 nM) til faste tidspunkter (0, 15, 30, 45, 90 og 120 minutter) til ARE III region av
PSA
genet, som demonstrert tidligere [31]. Anriking av AR på andre områder ble ikke sett. Tilsvarende viser figur 2C signifikant (
p
0,005 **) syklisk dissosiasjon-foreningen rekruttering av p68 på R1881 behandling (10 nM) til ARE III regionen, selv om rekrutteringen ikke var begrenset til denne regionen som EP , exon 3, Intron 3, ekson 5 og 3’dsF regionene viste også betydelig berikelse. Rekruttering nådde ikke signifikans på ARE jeg, Exon 1 og Intron 2 regioner. Disse funnene antyder p68 er assosiert med både transkripsjonsstart og forlengelse former rnap II og beriket ikke bare på transkripsjonsstartsider av en AR regulert gen, men på exonic, intronic og 3’dsF regioner, som indikerer en mulig funksjon for p68 i lette behandling av AR gentranskripsjon ved rnap II.
A. Beskjæres immuno-blot bilder av LNCaP atom lysater immunopresipitert med rnap II H5 (ser-2), rnap II H14 (ser-5), rnap II CTD mus monoklonalt antistoff og p68 (+/- R1881 10 nM, 8 timer), probet sekvensielt med p68 og rnap II antistoff. Pakk prøvene inneholder atom cellelysat og protein G sepharose uten antistoff tilstede. Kontrollprøver inneholder antistoff og protein G Sepharose i atom utvinning buffer bare. B. Rekruttering av AR og C. p68 til regioner av
PSA
genet. LNCaP-celler ble behandlet med 10 nM R1881 og høstet ved 0, 15, 30, 45, 90 120 minutters tidspunkter. Prøvene ble immunopresipitert med AR, p68 eller kontroll IgG antistoffer og gjenvunnet materiale behandles av ChIP analysen. QPCR data er representative for n = 3 uavhengige chip analyser normalisert til inngangsnivåer (+/- SE). (N.B. qPCR primere kan ikke være optimalisert for alle exonic og intronic regioner av
PSA
genet). Den uavhengige paret prøve
t
test ble brukt for å sammenligne berikelse i rekruttering mellom forskjellige
PSA
regioner og viser betydning. D. Diagram av
PSA
genet viser ekson /intron grenser.
p68 funksjonen er nødvendig for rekruttering av AR og β-catenin til arrangøren Regions of Androgen Responsive Gener
Vi har tidligere vist en nedgang i mRNA og protein nivåer av AR og androgen responsive
PSA
genet på p68 knockdown av siRNA [21]. I samsvar med chip funnene beskrevet ovenfor, er β-catenin rekruttert til promoter- og forsterker regioner av androgen responsiv og wnt signale målgener i både nærvær og fravær av androgener [11], [12]. I lys av disse funnene, utførte vi chip eksperimenter i LNCaP celler utarmet av p68 av siRNA å fastslå om p68-funksjon var nødvendig for AR og β-catenin rekruttering til promotorområdene av androgen responsive gener. p68 målrettet siRNA knockdown uttrykk (demping av p68 mRNA -50%
p
0,0494 * og protein~90% ved 72 timer etter transfeksjon), ikke vesentlig endre beta catenin mRNA eller protein uttrykk nivåer i forhold til kontroll (ikke-stanse, NS) siRNA i LNCaPs celler, i (henholdsvis figur 3A, B og C) i nærvær eller fravær av R1881. Androgen stimulering tilrettelagt en beskjeden (0,8 ganger) rekruttering av AR til ARE jeg regionen i
PSA
promoter kontroll (NS) siRNA transfekterte LNCaP celler som forventet (figur 4A), som ble betydelig svekket til å kontrollere nivåer i p68 utarmet celler (
p
0,0077 **). Tilsvarende androgen stimulering økt AR rekruttering til ARE III Enhancer region av
PSA
genet ni ganger i kontroll (NS) siRNA transfekterte celler (figur 4B), mens i p68 utarmet celler, rekruttering til den samme regionen var redusert med 4 ganger (
p
0,0008 ***). Et lignende mønster av demping i AR rekruttering ble også sett på
KLK2 plakater (0,25 ganger,
p
= 0,1593 Figur 4C) og
TMPRSS2 plakater (en fold,
p
0,0016 ** figur 4D) promoter regioner i p68 målrettet siRNA utarmet celler ved R1881 behandling, selv om dette ikke nådde betydning og androgen stimulering viste ikke anriking av AR rekruttering på
KLK2
promoter . Vi har imidlertid sett rekruttering av AR til
KLK2
arrangøren på andre tidspunkter (data ikke vist). Interessant nok et lignende mønster i dempning av β-catenin rekruttering på p68 rettet siRNA knockdown ble også sett. Økt β-catenin rekruttering til både ER I (0,6 ganger), og er III (0,8 ganger) regioner ble observert på androgen stimulering kontroll (NS) siRNA transfekterte celler sammenlignet med ikke-behandlede celler (henholdsvis figur 4E og 4F), som forventet . Men i p68 utarmet celler, β-catenin rekruttering ble betydelig svekket til under kontroll (NS) siRNA nivåer i begge regioner (1,1 ganger,
p
0,0023 ** og 1,3 ganger, p 0,0011 ** henholdsvis). Et lignende mønster av β-catenin de-rekruttering ble gjentatt på
KLK2 Hotell og
TMPRSS2
promoter i p68 utarmet celler (1,25 ganger,
p
0,0003 ** * Figur 4G, og en fold,
p
0,0005 *** Figur 4H henholdsvis). Selv om det er verdt å merke at i motsetning til AR rekruttering, en økning i β-catenin rekruttering (1,75 ganger) er sett på
KLK2
promoter-regionen på dette androgen tidspunkt. Vi har rapportert en nedgang i AR mRNA og proteinnivåer på p68 uttømming i LNCaP celler tidligere [21], som støtter forestillingen om at p68 fungerer som en AR co-aktivator. Derfor vil en reduksjon i rekruttering av AR til promotorområdene av androgen responsive gener i p68 oppbrukt celler forventes som AR i seg selv er en androgen responsiv genet. Men i p68 utarmet celler, fant vi β-catenin rekruttering redusert til nivåer lavere enn ikke-behandlede celler på alle promotorområdene vurderes (ligner på IgG-nivåer). Tyder direkte p68 interaksjon kan være nødvendig for å lette lasting av β-catenin å transcriptionally aktive regioner av androgen responsive gener. Denne informasjonen fremhever betydningen av p68-funksjon i rekrutteringen av co-aktivator β-catenin og AR til promotorområdene av androgen responsive gener.
mRNA uttrykk nivåer av p68 A. og β-catenin B. i kontroll (NS) og p68 siRNA-transfekterte LNCaP-celler (+/- R1881 10 nM, 16 timer). QPCR data ble normalisert til GAPDH nivåer og brett endring beregnet i forhold til kontroll (NS) (-R1881) mRNA nivåer (angitt som 1). Den uavhengige prøve
t
test ble brukt for å sammenligne forskjeller i uttrykk nivåer og viser betydning. C. Kupert immuno-blot bilder av lysatene fra LNCaP celler behandlet med 10 nM R1881 (16 timer) og transfektert med kontroll (NS) og p68 siRNA. Blots probet sekvensielt med β-catenin, p68 og α-tubulin-antistoffer.
LNCaP-celler transfektert med p68 eller kontroll (NS) siRNA, behandlet med 10 nM R1881 i 90 minutter og immunopresipitert med enten AR ABC D. eller β-catenin E. F. G. E), ER III (B F),
KLK2 plakater (C G)
TMPRSS2 product: (D H) promotorområdene vurderes i forhold til 0 minutt tidspunkt. p68 uttømming i LNCaP celler viste redusert AR β-catenin rekruttering etter behandling med 10 nM R1881 i 90 minutter til alle områder som vurderes i forhold til kontroll (NS) siRNA-celler. Resultatene som vises representerer n = 3 uavhengige forsøk (+/- SD). Den uavhengige prøve
t
test ble brukt for å sammenligne forskjeller i uttrykk nivåer og viser betydning.
p68 og β-catenin additivt Forbedre transkripsjonen aktivitet av androgen reseptor regulerte gener
Gitt at p68 og β-catenin samhandle i PCA celler og p68 letter rekrutteringen av β-catenin til androgen responsive genet arrangører. Vi valgte ved siden av undersøke den kombinerte effekten av ko-ekspresjon av p68 og β-catenin på den transkripsjonelle aktivitet av AR ved hjelp av androgen-avhengige luciferase reporter assays i COS-7-celler. AR-mediert p (ER)
3 Luc reporter ble robust stimulert to ganger av AR på R1881 (10 nM) androgen behandling (Figur 5, sammenlign lysegrå linje + R1881 og mørk grå bar -R1881). Over-ekspresjon av β-catenin viste ubetydelig p (ER)
3 Luc reporter-aktivitet i nærvær eller fravær av R1881 som viser at β-catenin direkte påvirke p (ER)
3 Luc rapportøraktivitet, i fravær av AR. Men samtidig uttrykk for AR og β-catenin viste en 8 ganger økning i p (ER)
3 Luc reporter aktivitet på R1881 behandling, bekrefter β-catenin som en co-aktivator av AR i samsvar med tidligere funn [28 ]. Tilsvarende co-uttrykk for AR og p68 viste en 5 ganger økning i p (ER)
3 Luc reporter aktivitet etter R1881 behandling, også bekrefter p68 som en co-aktivator av AR i samsvar med tidligere funn. (N.B. p68 er blitt vist å ikke påvirke p (ER)
3 Luc rapportøraktivitet direkte i fravær av AR [21]). Men samtidig uttrykk for AR, β-catenin og p68 konstruerer viser en signifikant 18 ganger (
p
0,0011 **
)
økning i p (ER)
3 Luc reporter aktivitet på R1881 behandling, 10 ganger høyere enn AR og β-catenin co-uttrykk, viser p68 har en betydelig additiv effekt på AR og β-catenin transkripsjonen aktivitet. Dette ble også sett med en annen androgen regulert
PSA
promoter luciferase reporter (p (PSA) Luc), hvor co-uttrykk for AR, β-catenin og p68 konstruerer viste en signifikant 8 ganger (
p
0,0057 **) økning i reporter aktivitet, fem ganger høyere enn AR og β-catenin co-uttrykk, bekrefter additiv effekt av p68 på β-catenin og AR transkripsjonen aktivitet (se saksdokumenter, Figur S2). p68 har blitt rapportert til å danne heterodimerer med den meget homologe helikase P72 (DdX17), og ko-aktivere β-catenin mediert genekspresjon tidligere [23]. Vi fant ut at co-transfeksjon av AR, β-catenin og P72 konstruerer ikke har en betydelig additiv effekt på p (ER)
3 Luc reporter aktivitet sammenlignet med co-transfeksjon av AR, β-catenin og p68 konstruksjoner (se saksdokumenter, Figur S3
p
= 0,3646). Dette ligner på en tidligere rapport som fant P72 var ute av stand til å forbedre AR transkripsjonen aktivitet av p (ARE)
3 Luc reporter [21], og foreslår en spesifisitet for p68 i den transkripsjonelle aktivering av AR i PCa. Sammen er disse dataene antyder β-catenin og p68 kan fungere sammen som co-aktivatorer for å forbedre AR regulert transkripsjon.
COS-7 celler transient transfektert i tre eksemplarer med p (ER)
3Luc reporter og PCMV- β-galaktosidase plasmider sammen med pattedyr-ekspresjonsvektorer for AR, β-catenin og p68 (+/- 10 nM R1881). Luciferase-aktivitet ble korrigert for den tilsvarende β-galaktosidase-aktivitet for å gi relativ aktivitet. Utvalget av plasmid nivåer (+ og ++) svarer til 50 og 100 ng respektivt. Data vist i forhold til AR-aktivitet alene (-R1881) (angitt som 1), og er representative for minst n = 3 luciferase-assay-eksperimenter (+/- SE). Den uavhengige prøve
t
test ble brukt for å sammenligne forskjeller i uttrykk nivåer og viser betydning.
Diskusjoner
I denne studien beskriver vi en funksjonell interaksjon mellom p68 , β-catenin og AR i kjernen av PCA-celler. AR har vist seg å signalisere via Wnt /β-catenin bane i PCa som en tilpasning til kastrering nivåer av androgener [12], og β-catenin er kjent for å interagere med andre ko-aktivatorer av AR [32]. Her presenterer vi immunoprecipitation, p68-utarmet chip og
PSA
luciferaserapportørplasmid data for å bekrefte et samspill mellom p68, β-catenin og AR i PCA celler. Vi først bekreftet en direkte
in vitro
p68-β-catenin samhandling ved transient transfeksjon av konstruksjoner inn i AR negative COS-7 cellelinje (som ikke var androgen avhengige). Imidlertid ved videre undersøkelser har vi funnet i henhold endogene forhold p68-β-catenin interaksjon ble tilrettelagt i nærvær av androgener i LNCaP PCa-cellelinjen, men omvendt i hormon ildfaste (LNCaP-AI) derivat av denne cellelinjen (representative av den CRPCa sykdom type), ble samspillet lettes i fravær av androgener. Dette ligner på en oppdagelse av øket endogen AR /β-catenin kompleksdannelse i en kastrering motstandsdyktig PCa mus xenograft modell, hvor ingen interaksjon mellom AR og β-catenin ble påvist i nærvær av androgener [10]. Dette kan tyde på en tilpasset mekanismen som p68 og β-catenin co-aktivatorer samarbeide opprett transkripsjonen aktivitet av AR (og androgen regulert gener), tilrettelegging celle overlevelse av kastrering-resistente (CRPCa) sykdom type. Imidlertid er ytterligere arbeid er nødvendig for å underbygge den fulle molekylære mekanismen for denne påstanden. Immuno-blot-data bekreftet den cellulære lokalisering av p68 og β-catenin ble ikke påvirket av hormon (vi funnet p68 og β-catenin i kjernen av PCA-celler i både nærvær og fravær av androgener), og
PSA
luciferase reporter data viste ko-transfeksjon av p68 og β-catenin konstruksjonene hadde en additiv effekt på den transkripsjonelle aktivitet av AR i nærvær av androgener. Disse data antyder at p68 og β-catenin arbeider sammen som ko-aktivatorer for å additivt forbedre den transkripsjonelle aktivitet av AR som er interessant, kan ha implikasjoner i progresjonen av sykdommen CRPCa typen.
viste også ved hjelp av knockdown av p68-ekspresjon ved siRNA oligonukleotid i kombinasjon med chip, ble det p68 er nødvendig for optimal rekruttering av AR og β-catenin til promotorområdene av androgen regulerte gener. Androgen stimulering lettere rekruttering av AR både ER I og ER III regioner av
PSA
promoter, og
KLK2 Hotell og
TMPRSS2
promoter regioner i kontroll (NS) siRNA transfekterte LNCaP-celler, som deretter ble svekkes i p68 ferdigproduserte celler. Den observerte β-catenin rekrutteringen til de samme androgen regulert promoter-regioner ble redusert i p68 utarmet LNCaP-celler ved androgen behandling, men til nivåer lavere enn ikke-behandlede celler (tilsvarende til den IgG-kontroll). Dette er et interessant funn som det tyder på at en reduksjon i rekruttering av β-catenin til promotorområdene av androgen regulerte gener i p68 ferdigproduserte celler er ikke bare en konsekvens av mindre AR tilgjengelig for rekruttering, og innebærer at p68-funksjon er nødvendig for å last β-catenin til transcriptionally regulerte områder av androgen responsive gener.
rollen til p68 i alternative mRNA spleising er godt dokumentert (anmeldt i [19], [21], [33]). Vi har tidligere spekulert i at p68 kan virke som en «adapter» eller «kobling» protein som koordinerer tett integrerte prosesser for transkripsjon og RNA-bearbeiding, tilrettelegging krysstale mellom transkripsjon og RNA-prosessering i AR-regulerte gener, eventuelt ved å kontrollere hastigheten av transkripsjonsstart /forlengelse på rnap II [30]. Rnap II har to fysiologisk viktige fosforyleringsseter på den C-terminale ende som er viktige for overgang av polymerase fra et transkripsjonsstart form (fosforylering ved Ser-5), til etablering av forlengelsen transkripsjonen kompleks form (fosforylering i ser-2) . I denne studien viser vi ved hjelp av endogene nukleære ekstrakter av LNCaP PCA-celler, som p68 samvirker med både processive (fosforyleringen i ser-2) og ikke-processive (fosforylering ved Ser-5) form av rnap II, i nærvær og fravær
