Abstract
Bakgrunn og Objective
prognose varierte blant pasienter med samme scene, derfor var det behov for nye prognostiske og prediktive faktorer. Målet med denne studien var å evaluere forholdet mellom apoptose relaterte biologiske markører som p53, BCL-2, Bax, og c-myc, og clinicopathological funksjoner og deres prognostiske verdi.
Metoder
Fra 1996 til 2007 hadde 4426 pasienter gjennomgått kurativ D2 gastrektomi for magekreft ved Fudan University i Shanghai Cancer Center. Blant 501 pasienter uttrykket nivåer av p53, BCL-2, Bax, og c-myc ble undersøkt ved immunhistokjemi. Den prognostisk verdi av biologiske markører og sammenhengen mellom biologiske markører og andre clinicopathological faktorer ble undersøkt.
Resultater
Det var 339 menn og 162 kvinner med en gjennomsnittsalder på 57. Prosent positive ekspresjon av p53, bcl-2, Bax, og c-myc var 65%, 22%, 43% og 58%, respektivt. Det var en sterk sammenheng mellom p53, Bax, og c-myc uttrykk (
P
= 0,00). Det var signifikant sammenheng mellom BCL-2, og Bax uttrykk (
P
0,05). p53 uttrykk korrelert med histologisk grad (
P
= 0,01); BCL-2 uttrykk med patologisk stadium (
P
= 0,00); Bax uttrykk med menn (
P
= 0,02), histologisk grad (
P
= 0,01), Borrmann type (
P
= 0,01), tumor plassering (
P
= 0,00), lymfeknutemetastase (
P
= 0,03), og patologisk stadium (
P
= 0,03); c-myc uttrykk med Borrmann type (
P
= 0,00). BCL-2 uttrykk var knyttet med god overlevelse i univariat analyse (
P
= 0,01). Multivariat analyse viste at BCL-2 uttrykk og patologisk stadium ble definert som uavhengige prognostiske faktorer. Det var signifikante forskjeller i samlede 5-års overlevelse etter BCL-2 uttrykk eller ikke i stadium IIB (
P
= 0,03).
Konklusjon
uttrykk for bCL-2 var en uavhengig prognostisk faktor for pasienter med magekreft; det kan være en kandidat for magekreft iscenesettelse system
Citation. Liu X, Cai H, Huang H, Long Z, Shi Y, Wang Y (2011) den prognostiske betydningen av apoptose relaterte biologiske markører i kinesiske Gastric kreftpasienter. PLoS ONE 6 (12): e29670. doi: 10,1371 /journal.pone.0029670
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 29 juni 2011; Godkjent: 02.12.2011; Publisert: 28.12.2011
Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Selv om forekomsten av magekreft er betydelig fallende. i flere tiår, var det fortsatt den fjerde vanligste kreftformen og den nest hyppigste årsaken til kreftdød [1], [2]. Det var svært viktig å forutsi nøyaktig risikoen for dårlig prognose for å maksimalisere den terapeutiske effekten, og for å minimalisere de ugunstige effekter ved behandling av kreftpasienter. Blant de prognostiske faktorer som nå er tilgjengelig for magekreft, den mest presise og viktigste prognostiske faktoren var UICC TNM stadium. Som et resultat av variasjonen av prognose i samme stadium av magekreft, var det umulig å forutsi nøyaktig prognose gjennom konvensjonelle fremgangsmåter staging. Derfor var det nødvendig å søke etter de andre spesifikke forhold for å identifisere undergrupper av pasienter med mer aggressiv forløpet av sykdommen. Nylig har noen studier har vist at andre patologiske faktorer, slik som antall positive lymfeknuter, nærværet av ekstrakapsulær spredning til lymfeknuter, og tumorstørrelsen hadde ytterligere prognostisk verdi [3] – [5]. Gitt at noen biologiske markører som onkogener, tumor-suppressor gener, celle-syklus regulatorer, og DNA-reparasjonsgener, var relatert til tumor tilblivelse, vekst, invasjon og metastasering, mange forskere var dedikert til å lete etter nye prognostiske faktorer med disse molekylære markører. Til tross for det faktum at noen få studier har evaluert prognostisk betydning av markører, slik som p53, bcl-2, Bax, og c-myc i magekreft, var resultatene kontroversielle [6] – [11]. Videre ble disse tidligere studier gjennomført for å undersøke ytterligere prognostisk verdi av markørene til sjette UICC TNM stadium, det hastet å belyse forholdet mellom disse stakere og syvende UICC TNM stadium. Endelig var det ingen studier som evaluerer uttrykk for disse molekylære prognostisk betydning i mage kreftpasienter i Kina. Derfor, vurderte vi ekspresjonen av biologiske markører som for eksempel p53, bcl-2, Bax, og c-myc i denne studien.
p53-proteiner var produktene av tumor-suppressor-gener, som fungerte ved å modulere celleproliferasjon via kontroll av G1 arrest sjekkpunktet av cellesyklusen [12], [13]. bcl-2 og bax tilhørte den bcl-2-familien, og den sistnevnte var en av de mest relevante klasser av apoptose regulatoriske molekyler. BCL-2 familien ble klassifisert i to underfamilier: anti-apoptose proteiner (BCL-2, BCL-XL, BCL-w, BFL-en, skryter-en, og MCL-1) og pro-apoptose proteiner (Bax, bak , bCL-Xs, dårlig, bud, og HRK) [14]. Det er blitt vist at bax til Bcl-2 kan påvirke den relative sensitivitet eller resistens av celler til apoptotisk simuli [15]. c-myc-proteinet var en type transkripsjonsfaktor. En tidligere studie viste det c-myc ekspresjonen ble koblet med celleproliferasjon [16].
I denne studien evaluerte vi ekspresjonen av biologiske markører som for eksempel p53, bcl-2, Bax, og c-myc, korrelert deres uttrykk til clinicopathological egenskaper og evaluert deres prognostisk verdi.
Materialer og metoder
pasienter
i løpet av januar 1996 og desember 2007 4426 pasienter med histologisk bekreftet primært adenokarsinom i ventrikkel gikk kurativ D2 gastrektomi ved Institutt for magekreft og bløtvevssarkom i Fudan University i Shanghai Cancer Center. Ut av disse pasientene ble 501 tilfeller valgt som sine eksemplarer ble farget immunohistochemically etter operasjon med rutinemessig histologisk undersøkelse. Data ble hentet fra pasientenes operative og patologiske rapporter, og oppfølgingsdata ble innhentet via telefon, brev, og poliklinisk kliniske database. Denne studien omfattet 339 menn og 162 kvinner i alderen fra 22 til 82 år, gjennomsnittsalder var 57 år. Staging ble utført i henhold til UICC TNM staging Klassifisering for Carcinoma av magen (Seventh Edition, 2010). En oppfølging av alle pasienter ble gjennomført i henhold til vår standard protokoll (hver tredje måned i minst 2 år, hvert halvår for de neste 3 år, og etter 5 år hver 12. måned for livet). Innsjekking-up elementer inkludert fysisk undersøkelse, tumor-markør undersøkelse, ultralyd, røntgen thorax, computertomografi skanning, og endoskopisk undersøkelse. Median oppfølgingstid var 44,6 måneder på tidspunktet for analyse. Den skriftlig informert samtykke var innhentet fra alle pasientene, og denne studien ble godkjent av etisk komité Shanghai Cancer Center of Fudan University. Studien var retrospektiv.
Immunhistokjemisk farging
p53, BCL-2, Bax, og c-myc ble oppdaget av immunhistokjemisk metode. Alle primære antistoffer og mus monoklonale antistoffer ble kjøpt fra Dako (Hamburg. Tyskland). Immunhistokjemisk farging ble utført av styrke merket polymer system (ELPS) metoden med 10% formalinfikserte, parafininnstøpte materialer. Serielle 5 um paraffin-snitt ble deparaffinised med xylen og hydrert med ehanol /deionisert vann. Seksjonene ble deretter inkubert med metanol /0,3% H
2o
2 i 10 minutter og blokkert med ikke-spesifikk farging blokkerende reagens. Etter inkubering over natten ved 4 ° C med anti-p53, bcl-2, Bax, og c-myc-antistoff (fortynnet 1:100, 1:100, 1:100, 1:100, henholdsvis), Snittene ble behandlet i henhold til standard immunoperoxidase metoder ved hjelp av et streptavidin biotin peroxidise kompleks kit (LSAB + Kit /HRP, Dako). Den peroxidise Reaksjonen ble deretter utviklet med diaminobenzidin (Dako). Negative kontroll seksjonene ble underkastet den samme prosedyre, bortsett fra at det første antistoffet ble erstattet med PBS. Ingen positiv farging ble observert i kontrollene. Plasseringen av flekker var hovedsakelig i cellen cytoplasma for Bax og c-myc, cytoplasma og cytomembrane for BCL-2, kjernen for p53.
Immunhistokjemisk farging scoring
Alle skivene ble evaluert av to patologer uten kjennskap til klinisk utfall. Prosentandelen av immunreaktive celler og fargeintensitetene ble evaluert i hver prøve. Prosentandelen av immunreaktive celler ble gradert på en skala fra 0 til 4: ingen farging er scoret som 0, 1-10% av celler farget scoret som en, 11-50% som 2, 51-80% som tre, og 81- 100% for eksempel 4. De fargeintensitetene ble gradert fra 0 til 3: 0 er definert som negativ, en så svak, 2 som moderert, og tre like sterk, respektivt. Rådata ble konvertert til immunhistokjemiske score (IHS) ved å multiplisere mengde og intensitet score. En IHS score på 9-12 ble vurdert som en sterk immunoreaktivitet (+++), 5-8 som moderat (++), 1-4 som svak (+),, 0 som negativ (-). På den endelige analysen, sakene hadde en score på mindre enn 1 ble ansett som negativt, og ≥1 ble sett på som positivt.
Statistisk analyse
Sammenhengen mellom clinicopathological faktorer og biologiske markører ble evaluert av Chi-kvadrat test. Fem års overlevelse ble beregnet ved Kaplan-Meier-metoden, og forskjellene mellom overlevelseskurver ble undersøkt med log-rank test. Alle de viktige variabler observert i univariat analyse ble inkludert i multivariat overlevelse analyse ved hjelp av Cox modell. Den aksepterte nivået av betydning var
P
0,05. Statistiske analyser og grafikk ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 statistikkpakke (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultater
Clinicopathological egenskaper
Det var 339 menn og 162 kvinner (2.09: 1) med en gjennomsnittsalder på 57 år. Det var 57 (11,4%) tidlig mage kreft og 444 (88,6%) avansert magekreft. Ifølge histologisk type var godt differensierte tumorer observert i 9 (1,8%) pasienter, moderat differensiert i 164 (32,7%) pasienter, og dårlig differensiert svulster i resterende 328 (65,5%) pasienter. Ifølge Borrmann type, 57 (10,4%) var typen 0, 36 (7,2%) type I, 15 (3,0%) type II, 371 (74,0%) type III, 22 (4,4%) type IV. Av 501 pasienter, 159 (31,7%) hadde svulster som befinner seg i den øvre tredjedel, 72 (14,4%) hadde svulster i den midtre tredjedel, 244 (48,7%) hadde svulster i den nedre tredjedel av magen, og 26 (5,2%) hadde svulster okkupert to tredjedeler eller mer av magen. Lymfeknutemetastase ble observert hos 356 pasienter, metastase rente var 71,1%. Fordelingen av patologisk trinn var som følger: 35 (7,0%) pasienter tilhørte stadium IA, 52 (10,4%) IB, 60 (12,0%) IIA, 83 (16,5%) IIB, 88 (17,6%) IIIA, 83 ( 16,5%) IIIB, og 100 (20,0%) IIIC.
p53 uttrykk
p53 uttrykk var positiv i 64,9% av alle mage kreft vev. p53 farging ble observert i kjernen av carcinoma-celler (figur 1). p53-ekspresjon var assosiert med bax og c-myc (tabell 1). Godt differensiert histologi korrelert med p53 uttrykk. Det var ingen korrelasjon med kjønn, alder, Borrmann typen, tumor plassering, lymfeknutemetastase, og patologisk trinn (tabell 2).
A) Positiv ekspresjon av p53. B) Positiv uttrykk for BCL-2. C) Positive uttrykk for Bax. D) Positiv ekspresjon av c-myc. (Original forstørrelse: all × 100).
BCL-2 uttrykk
BCL-2 uttrykk var positiv i 22,2% av alle mage kreft vev. bcl-2-farging ble observert i cytoplasma og cytomembrane av carcinoma celler (figur 1). bcl-2 ekspresjon er assosiert med bax (tabell 1). Det var sammenheng med patologisk stadium, men ingen sammenheng med kjønn, alder, histologisk type Borrmann type svulst beliggenhet, lymfeknutemetastase, og (tabell 2).
Bax uttrykk
Bax uttrykk var positiv i 42,9% av alle gastrisk kreft vev. bax farging ble observert i cytoplasma av carcinomceller (figur 1). bax ekspresjon var assosiert med p53, bcl-2 og c-myc (tabell 1). Kvinnelige kjønn, moderat differensiert, Borrmann II, øvre tredje sted, og lymfeknutemetastase korrelert med Bax uttrykk. Som patologisk trinnet økes, vil ekspresjon av Bax ble hyppigere. Det var ingen sammenheng med alder (tabell 2).
c-myc uttrykk
c-myc uttrykk var positiv i 58,1% av alle mage kreft vev. c-myc farging ble observert i cytoplasma av carcinomceller (figur 1). c-myc ekspresjonen var assosiert med p53, og Bax (tabell 1). Borrmann III korrelert med c-myc uttrykk. Det var ingen korrelasjon med kjønn, alder, histologisk type tumor plassering, lymfeknutemetastase, og patologisk trinn (tabell 2). I tillegg ble rådata om clinicopathological funksjoner og immunoreaktivitets evalueringer for 501 tilfeller av magekreft viste som et supplerende bord i et Excel-format (Tabell S1).
Univariat analyse
Den over-all fem -års overlevelse var 53,7% for alle 501 pasienter. Fem års overlevelse var 64,9% og 50,5% i BCL-2 positive og BCL-2 negative pasientene, og denne forskjellen var statistisk signifikant (fig. 2). Bortsett BCL-2 uttrykk, de betydelige prognostiske faktorer inkludert: tumorlokalisering, Borrmann type, status av lymfeknuter, og patologisk stadium. Tabell 3 viser resultatene ved univariat analyse for prognostiske faktorer.
Det var signifikante forskjeller mellom BCL-2 + og BCL-2- (
P
= 0,005).
multivariatanalyse
multivariat overlevelsesanalyse, inkludert alle viktige prognostiske faktorer som er nevnt i univariat analyse ble utført for å bestemme de uavhengige prognostiske faktorer for magekreft. Multivariat analyse ved hjelp av Cox modellen viste at BCL-2 uttrykk og patologisk stadium var uavhengige prognostiske faktorer (Tabell 4).
Sammenligning av overlevelse i henhold til biologiske markører på samme scene
ifølge syvende UICC TNM Staging System, ble magekreft delt inn i 7 stadier: stadium IA, stadium IB, stadium IIA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC. Basere på BCL-2 uttrykk, ble hvert trinn delt inn BCL-2 positive og BCL-2 negativ gruppe. Det var signifikante forskjeller på over-all 5-års overlevelse mellom BCL-2 positive og BCL-2 negativ gruppe i henhold til stadium IIB (
P
= 0,003). I tillegg fant vi at det var store forskjeller på over-all 5-års overlevelse mellom BCL-2 positive og BCL-2 negativ gruppe ifølge Borrmann III (
P
= 0,002); ingen signifikante forskjeller i henhold til stadium II og fase III (figur 3).
A) Det var signifikante forskjeller mellom BCL-2 + gruppe og BCL-2-gruppen ifølge Borrmann III (
P
= 0,002). B) Det var ingen signifikante forskjeller i henhold til stadium II. C) Det var ingen signifikante forskjeller i henhold til stadium III.
Diskusjoner
Identifiseringen av prognostiske faktorer i magekreft var avgjørende for å forutsi pasientens overlevelse og bestemme optimale terapeutiske strategier. Mange studier har indikert at dybden av invasjon og lymfeknutemetastase var de viktigste prognostiske faktorer i magekreft, [17], [18]. Som et resultat av variasjonen av prognose innenfor samme patologisk stadium av magekreft, har det vært en rekke forskere for spesifikke biologiske markører for å identifisere pasienter med dårligere prognose [19] – [21]. I mellomtiden ble uttrykket av p53, BCL-2, Bax, og c-myc kjent for å være beslektet med tumorogenesis. Derfor er målet med denne studien var å undersøke om disse biologiske markører kan brukes som ekstra prognostiske faktorer til tradisjonell TNM stadium i magekreft. I denne studien ble uttrykket av disse proteinene undersøkt i 501 tilfeller av resected primære humane mage kreft.
De immunhistokjemiske ekspresjonshastigheter av p53, BCL-2, Bax, og c-myc var 64,9%, 22,2% , 42,9%, 58,1%, henholdsvis, og disse resultatene var i samsvar med uttrykket forekomst av andre studier rapportert som 17 til 84,1%, 12,7 til 67%, 42,4 til 58,0%, 23,5 til 72,9%, henholdsvis [9], [12 ], [22] – [26]. p53 spilte en viktig rolle i apoptose. Det endret oftest i menneskelig kreft. Vill-type p53-protein indusert veksthemming ved G1 /S-fasen av cellesyklus i respons til DNA-skade, og dermed hindre spredning av cellene. Dempet-type p53 tapt funksjon, og tillot celler med skadet DNA til å spre seg. I denne studien ble en omvendt korrelasjon mellom p53 og histologisk type som, som viste at deregulering av p53 kan føre til ukontrollert proliferasjon i magekreft. Det var i overensstemmelse med en tidligere studie [22]. Det var uenighet som for den prognostiske verdien av p53, har noen studier rapportert at p53 var assosiert med dårlig prognose [27], [28], mens andre rapporterte at p53 har ingen innflytelse på prognose [29], [30]. Vår forskning viser at p53 var ikke knyttet til prognosen for magekreft. Bax fungerte som en akselerator av apoptose på celle livet. En tidligere studie foreslår at forholdet mellom Bax til bcl-2 spilte en viktig rolle i regulering av tilbøyelighet for apoptose [31]. I denne studien ble det uttrykk for Bax forbundet med at av BCL-2, og Bax overekspresjon korrelerte signifikant med noen clinicopathological funksjoner som kjønn, histologisk type Borrmann type svulst plassering, og lymfeknutemetastase. Vi fant at pasienter med positiv ekspresjon av bax var tilbøyelige til å presentere lymfeknutemetastase, og Bax var ikke en uavhengig prognostisk faktor. Dette resultatet var forskjellig fra tidligere forskning. Anagnostopoulos et al. [24] rapporterte at negative Bax uttrykk i mage var assosiert med lymfeknutemetastase og dårlig klinisk prognose. Årsakene til de motstridende resultatene var ikke klart. Det var mulig at genet forskjellene mellom vestlige mennesker og østlige mennesker bidratt til dette. Proto-onkogen c-myc var en mester regulator av celledeling og transformasjon gjennom både transkripsjons og nontranscriptional midler, og ofte ble deregulert i menneskelige kreftformer. Ninomiya et al. [26] rapporterte at overflødig reaktivitet til c-myc produkt forekom oftere hos invasiv kreft enn i lokaliserte kreft, og c-myc produksjon uttrykk i kreftvev korrelert godt med peritoneal formidling, og pasienter med c-myc positivt uttrykk hadde dårligere prognose enn de med c-myc negative uttrykk. I denne studien, fant vi ikke noen sammenheng mellom c-myc uttrykk og invasive atferd og prognose enn Borrmann type. Vi fant ut at c-myc uttrykket ble mer assosiert med Borrmann III.
BCL-2-genet ble først beskrevet som et onkogen i follikulært lymfom. Det var godt kjent for å hemme apoptose [32], men noen studier har rapportert at overekspresjon av bcl-2 undertrykte cellulær proliferasjon og er forbundet med mindre aggressiv oppførsel biologisk [33], [34]. bcl-2 har blitt rapportert i en rekke humane epitel-maligne tumorer inkludert gastrisk karsinom. Men den eksakte rolle og kliniske betydningen av BCL-2 forble ikke klarlagt. Tidligere studier har vist at ekspresjon av bcl-2 var assosiert med bedre prognose i ikke-småcellet lungecancer og magecancer [35], [36]. Pietenpol et al. [37] rapporterte at overekspresjon av bcl-2 hemmet veksten av flere solide tumorcellelinjer. Saegusa et al. [33] har vist at majoriteten av BCL-2 + kreftceller var i en nonproliferative tilstand, og den gjennomsnittlige ekspresjon av Ki-67-merkeindeksen og apoptotisk-merkeindeksen i BCL-2 + foki var betydelig lavere enn den i bcl-2- foci. Aizawa et al. [36] viste at uttrykket av BCL-2 i avansert magekreft ble assosiert med en lavere apoptotisk indeks og en bedre prognose. Alle disse studier antydet at bcl-2 ikke bare inhibert apoptose, men også undertrykkes cellulær proliferativ aktivitet. I foreliggende studie, karakterisert vi for første gang ekspresjonen av BCL-2-proteiner i kinesisk magekreftpasienter. Våre data viste at BCL-2 var signifikant korrelert med bedre overlevelse.
Identifiseringen av prognostiske faktorer i magekreft var avgjørende for å forutsi pasientens overlevelse og bestemme optimale terapeutiske strategier. Det var velkjent at dybden av invasjon og tilstedeværelse eller fravær av lymfeknutemetastaser var de viktigste prognostiske faktorer i magekreft. Det var imidlertid umulig å forutsi nøyaktig prognose gjennom konvensjonelle fremgangsmåter stillasanordninger som følge av variasjonen av prognose i samme stadium av magekreft. Liu et al. [5] funnet ut at det var signifikante forskjeller mellom større størrelse svulst gruppen og liten størrelse tumor gruppe i henhold til Steg IIIB og IV. Derfor var det viktig å søke etter de andre spesifikke faktorer for å identifisere subgrupper av pasienter med mer aggressiv sykdomsforløpet, spesielt i det 7. utgaver av UICC TNM Staging System. Ifølge syvende UICC TNM klassifisering, ble hvert stadium av magekreft videre delt inn i BCL-2 positive og BCL-2 negativ gruppe. Våre data viser at ekspresjon av bcl-2 sterkt påvirket prognose i stadium IIB. Resultatene indikerte at uttrykket av BCL-2 kunne gi ytterligere prognostisk informasjon hos pasienter med magekreft.
Noen begrensninger i denne studien bør bli anerkjent. For det første, status for Helicobacter pylori ble ikke beskrevet. Som et viktig kreftfremkallende av magekreft, kan Helicobacter pylori være knyttet til en del andre parametre som bcl-2. For det andre forholdet mellom tumorresidiv og bcl-2 ble ikke undersøkt.
Som konklusjon kan ekspresjon av bcl-2 tjener som en nyttig indikator for å forutsi prognosen for pasienter med magekreft. Derfor kan det være en kandidat for iscenesettelsen system i tillegg til konvensjonelle faktorer.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Rådata om clinicopathological funksjoner og immunoreaktivitets evalueringer for 501 tilfeller av magekreft
doi:. 10,1371 /journal.pone.0029670.s001 plakater (XLS)
