Abstract
Den lange ikke-kodende RNA hotair har blitt rapportert å være en dårlig prognostisk biomarkør i en rekke ondartede svulster. Men lite er kjent om foreningen av hotair med magekreft. Vi undersøkte uttrykk for hotair i 68 mage kreftprøver ved hjelp av kvantitativ real-time RT-PCR og analysert dens korrelasjon med de kliniske parametre. Den funksjonelle rollen til hotair ble undersøkt ved å generere humane magecancercellelinjer med øket eller undertrykkes hotair uttrykk. Forankrings-uavhengig vekst ble bedømt ved soft agar assay. Den økte eller undertrykkes hotair uttrykkmagekreftceller ble injisert inn i halevenen eller bukhulen til immunodefekte mus for å undersøke effekten av dette molekyl på metastase og peritoneal formidling. Ekspresjonen av varmluft var signifikant høyere hos kreft lesjoner enn i tilstøtende ikke-cancervev i humane mage kreft. I den diffuse typen magekreft, High-hotair gruppe (hotair /GAPDH 1) viste signifikant mer venøs invasjon, hyppige lymfeknutemetastaser og en lavere total overlevelse sammenlignet med lav-hotair gruppe (hotair /GAPDH 1). Kolonidannelse i bløt agar ble forbedret i en varmluft-avhengig måte. Hotair-uttrykk MKN74 dannet mer levermetastaser sammenlignet med kontroll når de ble injisert i halevenen til mus. I tillegg redusert uttrykk for hotair i KATO III trykt peritoneal formidling. Disse resultatene tyder på at hotair spiller en sentral rolle i utviklingen av magekreft
Citation. Endo H, Shiroki T, Nakagawa T, Yokoyama M, Tamai K, Yamanami H, et al. (2013) Enhanced Expression of Long ikke-kodende RNA hotair er assosiert med utvikling av magekreft. PLoS ONE 8 (10): e77070. doi: 10,1371 /journal.pone.0077070
Redaktør: Dajun Deng, Peking University Cancer Hospital og Institute, Kina
mottatt: 10. juni, 2013, Godkjent: 05.09.2013; Publisert: 10. oktober 2013
Copyright: © 2013 Endo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI tilskuddet numbers24791480 og 24591022 (https://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html), og tilskudd-i-hjelp fra HIROMI Medical Research Foundation (http: //www.smtb jp /personlig /betrodd /ledelse /offentlig /eksempel /pdf /naturlig 06a.pdf) og Daiwa Securities Health Foundation (https://www.daiwa-grp.jp/dsh/grant/outline.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomst og dødelighet av magekreft har sunket dramatisk de siste 50 årene i de fleste områder av verden, men det er fremdeles den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i verden [1]. Til tross for nylige fremskritt i diagnostiske teknikker, for eksempel forstørrelsesendoskopi med smalt bånd imaging (NBI) [2], og i behandling inkludert target terapi [3,4], er det fortsatt et stort antall mage kreftpasienter med dårlig prognose. Sykdomsfremkallende mekanisme som bidrar til den aggressive biologisk funksjon i denne kreft er fortsatt ikke avklart.
genomet sekvense prosjekter avslørte at det humane genom består av mindre enn 2% proteinkodende gener, og mer enn 90% av genomet blir transkribert som ikke-kodende RNA (ncRNA) [5-7]. Disse ncRNAs er klassifisert i to grupper avhengig av nukleotid størrelse. Mikro RNA er omtrent 18-25 nukleotider i lengde, mens lange ikke-kodende RNA består av mer enn 200 nukleotider. Hotair er en lang ikke-kodende RNA som ble identifisert fra en egendefinert tilling utvalg av HOXC locus. Hotair ble vist til trimethylate Histon H3 lysin-27 av HOXD locus med polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2) og hemme HOXD genuttrykk, som ligger på en annen kromosom [8]. Hotair fremmer metastasering gjennom interaksjon med PRC2 å undertrykke transkripsjon av flere metastaser suppressor gener ved brystkreft [9]. Den økede ekspresjon av varmluft er forbundet med invasivitet, metastase og dårlig prognose i en rekke kreftformer så som bryst, tykktarm, bukspyttkjertel og lungekreft [9-12]. Men lite er kjent om uttrykket og /eller funksjonen av hotair i magekreft utvikling. I denne studien undersøkte vi involvering av hotair i human magekreft utvikling og undersøkt om dens uttrykk ville korrelere med den aggressive oppførselen til magekreft.
Materialer og metoder
Vev
68 magekreft vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Miyagi Cancer Center (Natori, Japan), mellom 2007 og 2011. Alle prøvene ble umiddelbart frosset like etter reseksjon i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C eller i fast 10% bufret formalin og innstøpt i parafin voks. Mage kreft ble histopathologically klassifisert som tarm type (n = 36), diffus type (n = 32) i henhold til klassifiseringen av Verdens helseorganisasjon og tidligere rapporter [13]. Ingen pasienter fikk kjemoterapi og strålebehandling før operasjonen. For statistisk analyse, ble totaloverlevelse definert av død uansett årsak, og Kaplan-Meier overlevelseskurver ble brukt.
Cellelinjer
Den magekreft cellelinjer MKN74 (intestinal type) [14] og KATO III (diffus type) [15] ble oppnådd fra Riken Bioresource senter (Tsukuba, Japan). Begge cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 (Gibco /Life Technologies Co, CA) inneholdende 10% inaktivert FBS (EuroClone, Milano, Italia) med 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco /Life Technologies Co. , CA) og dyrket i en fuktig 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
RNA forberedelse, revers transkripsjon og kvantitativ real-time PCR
Total RNA fra frosne prøvene og cellelinjer ble ekstrahert med ISOGENE (NIPPON GENE, Tokyo, Japan) ifølge produsentens protokoll. cDNA fra alle prøvene ble syntetisert fra 1,0 mikrogram total RNA ved PrimeScript® første cDNA Synthesis Kit (Takara Bio, Siga, Japan) etter produsentens protokoll. Uttrykket av hotair ble kvantifisert ved LightCycler Brilliant SYBR Grønn QRT-PCR kit (Roche Applied Science, IN) etter produsentens protokoll med de spesifikke primer sett i henhold til den forrige studien [9]. Nivået av varmluft ekspresjon i hver prøve ble normalisert til den respektive GAPDH-ekspresjonsnivået. Spesifisiteten av hver PCR-reaksjon ble bekreftet ved smelting kurve analyser.
hotair uttrykk retrovirale vektor
Humant hotair cDNA (Addgene, Cambridge, MA) ble amplifisert ved PCR og ble innsatt i pBabe puro vektor (pBabe -HOTAIR). Rekombinant retrovirus ble produsert med Platinum-A (Plat-A, Levert av Prof. Kitamura) emballasje cellelinjer som beskrevet tidligere [16]. Kort fortalt ble Plat-A-celler transfektert med pBabe -HOTAIR eller pBabe-puro Vector (EV). Fugene-6 (Roche Applied Science) og Opti-MEM I (Gibco /Life Technologies Co.) tilsatt etter produsentens protokoll. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble retrovirus inneholdende supernatanten oppsamlet og sendt gjennom et 0,45 um filter. MKN74-celler ble infisert med de rekombinante retrovirus og deretter velges med puromycin.
RNA interferens
For å knockdown hotair i KATO III, vi brukte Knockout ™ RNAi Systems (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, vi utviklet fire shRNA sekvens målrettet hotair som vist i tabell 1. Etter gløding av de komplementære oligonukleotider shRNA, ligert vi de rekombinerte oligonukleotidene inn i pSIREN vektor (shHOTAIR). Deretter transfektert vi Plat-A-celler med shHOTAIR eller pSIREN Vector (EV), og infisert KATO III med de rekombinante retrovirus og valgt med puromycin. Cellene transduced med sh-HOTAIR2 og -3 vektor ble valgt for videre studier. Hver
i vitrto
Forsøket ble utført i tre eksemplarer, gjentatt tre ganger og representative data vises.
shRNA
Sequence
shHOTAIR-1sensegatccgaacgggagtacagagagattttcaagagaaatctctctgtactcccgttcttttttganti-senseaattcaaaaaagaacgggagtacagagagatttctcttgaaaatctctctgtactcccgttcgshHOTAIR-2 sensegatccgccacatgaacgcccagagattttcaagagaaatctctgggcgttcatgtggttttttg anti-senseaattcaaaaaaccacatgaacgcccagagatttctcttgaaaatctctgggcgttcatgtggcgshHOTAIR-3 sensegatccgtaacaagaccagagagctgttttcaagagaaacagctctctggtcttgttattttttganti-senseaattcaaaaaataacaagaccagagagctgtttctcttgaaaacagctctctggtcttgttacgshHOTAIR-4sensegatccaattcttaaattgggctggttcaagagaccagcccaatttaagaattttttttganti-senseaattcaaaaaaaattcttaaattgggctggtctcttgaaccagcccaatttaagaattgTable 1. Sekvenser av shRNA setter inn for shHOTAIR uttrykke vektoren.
CSV ned CSV
Cell vekstanalyse
1 x 10
4-celler ble sådd per brønn i 96 brønners plater i normal cellevekst media. 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid, gul tetrazol (MTT) analysen ble utført ved anvendelse av en celle proliferasjon Kit I (GE Healthcare Life Sciences, NJ) ifølge produsentens protokoll. Målinger av absorbans ved 570 nm ved VersaMax (Molecular Devices, CA) ble gjort for å estimere MTT-formazan produksjonen etter 24, 48 og 72 timers inkubasjon. Indeksen ble evaluert ved 48 og 72 timer normalisert til den ved 24 timer.
myk agar-kolonidannelsesbestemmelsen
soft agar analyser ble utført i 6-brønns plater. Basislaget av hver brønn besto av 1 ml med sluttkonsentrasjoner på 1 x medium (RPMI-1640 pluss 10% inaktivert FBS) og 0,6% lavt smeltepunkt agarose. Platene ble avkjølt ved romtemperatur inntil det faste stoffet, ved hvilket punkt en 1-ml vekst agar lag ble hellet, bestående av 1 x 10
4 celler suspendert i 1 x media og 0,3% lavt smeltepunkt agarose. Plater ble igjen avkjølt ved romtemperatur inntil veksten lag stivnet. Ytterligere 1 ml av 1 x media uten agarosen ble lagt på toppen av veksten lag på dag 0 og igjen på dag 14 av vekst. Cellene fikk vokse ved 37 ° C i 4 uker, og totalt kolonier ble talt opp.
Dyr
6 uker gammel kvinne NOD /Shi-SCID-IL2Rγ
null (NOG ) mus ble innkjøpt fra sentral~~POS=TRUNC for forsøksdyr (CIEA, Kawasaki, Japan) og anvendt i dette eksperimentet. De fikk lov til å akklimatisere seg i en uke før forsøkene. De ble plassert i et rent rom av dyret omsorg anlegget ved Miyagi Cancer Research Center og holdt under standard temperatur, fuktighet og tidsbestemte lysforhold og gitt mus chow /vann ad libitum.
Tail vene analysen av kreft celle metastase
For å evaluere effekten av hotair uttrykk på blodbårne metastaser, injisert vi 1,0 x 10
5 celler av HOTAIR- (n = 9) eller EV-uttrykkende (n = 9) MKN74 med 0,2 ml PBS inn i halevenen til mus. Mus ble observert generelt for tegn på sykdom ukentlig i lengden av eksperimentet, og de ble avlivet 8 uker etter injeksjon. Lunger, lever, nyrer, binyrer, og milten av mus ble tatt ut og undersøkt makroskopisk om tilstedeværelse av metastasering.
Peritoneal metastase
1,0 x 10
6 celler av shHOTAIR- (n = 5) eller EV-uttrykkende (n = 5) KATO III ble injisert med 0,2 ml PBS inn i peritoneum av mus for å evaluere effekten av hotair uttrykk på peritoneal metastasering. Mus ble observert generelt for tegn på sykdom ukentlig i lengden av eksperimentet, og de ble avlivet 8 uker etter injeksjon. Tilstedeværelsen av knuter og ascites i bukhulen ble undersøkt.
Histologi og Immunohistochemistry
De skåret vev ble fiksert i 10% bufret formalin i 24 timer, deretter kuttet og dyppet i parafin for mikroskopisk etterforskning. Prøvene ble skåret i fire-mikrometer tykke seksjoner og farget med hematoksylin og eosin (H E). Vi undersøkte tilstedeværelse av mikrometastaser som ikke ble gjenkjent makroskopisk. Den anerkjente svulster ble videre undersøkt immunohistochemically bruker primært antistoff for human cytokeratin (Anti Cytokeratin lav, DC10 /5D3, Nichirei Co, Tokyo, Japan) for å sørge for at de ble hentet fra injisert human magekreftcelle. Etter deparaffinization, ble vevssnittene inkubert i metanol med 0,3% hydrogenperoksid i destillert vann i 20 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet. Antigen gjenfinning ble utført ved trykk koking ved 95 ° C i 5 minutter i 10 mM citratbuffer, pH 6,0, og deretter hensatt til avkjøling ved romtemperatur i 30 minutter. Endogen biotin- eller avidin-bindingsseter ble blokkert ved sekvensiell inkubasjon i 30 minutter. Seksjonene ble inkubert over natten ved 4 ° C med primært antistoff som er beskrevet ovenfor, og ble omsatt med det andre antistoff. Et avidin-biotin- peroksydase-kompleks ble benyttet for å detektere det andre antistoff. Fargingen ble visualisert med diaminobenzidin (DAB). Seksjonene ble kontra med hematoksylin, vasket og dehydrert ved hjelp av en gradient av etanol til xylen.
Statistisk analyse
Korrelasjonen av hotair uttrykk med pasientens clinicopathological variabler og frekvensen av metastaser i den injiserte -mus ble analysert ved chi-kvadrat-test. Statistisk signifikant forskjell mellom 2 grupper ble bestemt ved bruk av Wilcoxon test og
P
verdi (
0,05) ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk forskjell mellom 3 grupper ble evaluert med Steel Dwass test eller Bonferroni analyse og
P
verdi ( 0,017) ble ansett som statistisk signifikant Total overlevelse sannsynlighet ble analysert av Kaplan-Meier metoder og evaluert av log-rank test, og
P
verdi ( 0,05) ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Ekuseru-Toukei 2012 (Social Survey Research Information Co., Ltd., Tokyo, Japan).
P
verdi ( 0,05) ble ansett som statistisk signifikant
Etikk
Institutional Review Board av Miyagi Cancer Center (MCC) godkjent denne studien protokollen,. og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient (Permit Number: MCC-22-30). Protokollen fra dyreforsøk ble godkjent av MCC Animal Care og bruk Committee (Permit Number: MCC-AE-2011-12).
Resultater
Den hotair uttrykk for menneskelige magekreft prøver
de hotair uttrykk nivåer av kreft og tilstøtende noncancerous vev fra mage kreftpasienter ble undersøkt ved QRT-PCR og normalisert ved GAPDH uttrykket nivå. Gjennomsnittlig uttrykk nivået hotair var 4,952 ± 6,462 og 3,804 ± 6,721 (hotair /GAPDH ± standardavvik) i carcinoma og ikke til kreft, henholdsvis. Uttrykket nivåer av hotair var betydelig høyere i kreft lesjoner sammenlignet med de av ikke-kreft lesjoner (
P
= 0,019, figur 1A).
A, hotair uttrykk nivåer av kreft og tilstøtende noncancerous vev fra magekreftpasienter ble undersøkt ved QRT-PCR og normalisert ved GAPDH-ekspresjonsnivået. Uttrykket nivåer av varmluft var betydelig høyere i carcinoma lesjoner sammenlignet med de av ikke-cancerøse lesjoner (
P
= 0,019). B og C, ble De menneskelige mage kreft vev videre klassifisert i henhold til hotair uttrykk nivå inn i en High-hotair gruppe (hotair /GAPDH 1.0) og Low-hotair gruppe (hotair /GAPDH 1,0) i tarm (B ) og diffus type (C) av magekreft, henholdsvis.
Sammenhengen mellom uttrykket av hotair og clinicopathological faktorer i menneskelige mage kreft
den menneskelige mage kreft vev ble histopathologically klassifisert inn i tarm (n = 36) og diffuse typer (n = 32). De menneskelige mage kreft vev ble videre klassifisert i henhold til hotair uttrykket nivå i High-hotair gruppe (hotair /GAPDH 1.0) og Low-hotair gruppe (hotair /GAPDH 1,0) (Tall 1B og C). Foreningen av hotair uttrykk med clinicopathological funksjonene i tarm og diffuse typen magekreft er oppsummert i tabell 2 og 3, henholdsvis. I tarmtypen magekreft, ble ingen signifikant korrelasjon funnet mellom hotair uttrykk og de clinicopathological funn (tabell 2). I tillegg ble det ingen signifikant sammenheng sett mellom hotair uttrykk og total overlevelse, selv om Internett-hotair gruppe tendens til å vise kortere overlevelse enn lav-hotair gruppe (Figur 2A). På den annen side ble en signifikant sammenheng funnet mellom hotair uttrykk og lymfeknutemetastase (P = 0,043), venøs infiltrasjon (
P
= 0,0083), og kort total overlevelse (
P =
0,018) i den diffuse typen magekreft (tabell 3 og figur 2B). Imidlertid var det ingen sammenheng mellom scenen og hotair uttrykk.
hotair lav
hotair høy
P
verdi
Age73.07 ± 9.1870.87 ± 10.650.53Gender0.63Male1016female37T0.87T1, T2610T3, T4713N0.26N078N1, N2 , N3615Ly0.68ly069ly1, ly2, ly3714v0.19v089v1, v2, v3514Stage0.501,27153,4680.50Table 2. sammenslutning av hotair uttrykk med clinicopathological funksjoner i intestinal type magekreft.
CSV ned CSV
hotair lav
hotair høy
P
verdi
Age59.250 ± 10.7566.35 ± 10.160.07Gender0.71male812female48T0.87T1, T212T3, T41118N0.043*N086N1,N2,N3414ly0.40ly067ly1,ly2,ly3613v0.0083*v0119v1,v2,v3111Stage0.311,2783,4512Table 3. sammenslutning av hotair uttrykk med clinicopathological funksjoner i diffus type magekreft.
CSV ned CSV
A, I intestinal type magekreft, ble ingen signifikant sammenheng sett mellom hotair uttrykk og total overlevelse, selv om High-hotair gruppe tendens til å vise kortere overlevelse enn lav-hotair gruppe. B, High-hotair gruppen viste signifikant kortere overlevelse enn lav-hotair gruppe i den diffuse typen magekreft (
P
= 0,018).
Generering av hotair opp- og nedregulert celler og korrelasjon med celleviabilitet
for å vurdere den funksjonelle rollen hotair i magekreft utvikling, vi genererte stabilt hotair uttrykker MKN74 celler (MKN-hotair) og stabilt shHOTAIR uttrykker KATO III celler (KATO- shHOTAIR). QRT-PCR-analyse viste at MKN-hotair cellene uttrykte et nivå på hotair ca 10 ganger større enn EV uttrykke (MKN-EV) eller foreldre MKN74 celler og at uttrykket av dette molekylet ble redusert med 30 til 70% i KATO-shHOTAIR celler sammenlignet med EV omformet (KATO-EV) eller foreldre KATO III (KATO-EV) celler (figur 3A). Resultatene av MTT-analysen viste at hverken oppregulering eller nedregulering av varmluft påvirkes magekreft celleformering (figur S1).
A, Relative hotair uttrykk nivåer i mage cancer-cellelinjer ble analysert ved qRT- PCR-analyse. MKN-hotair cellene uttrykte omtrent 10 ganger høyere nivåer av hotair enn foreldre MKN74 celler og MKN-EV. På den annen side, ble ekspresjonen av varmluft i KATO-shHOTAIR-celler reduseres med 30 til 70% sammenlignet med foreldre KATO III og KATO-EV-celler. B, Den søylediagram viste den relative ekspresjon av varmluft i magecancercellelinjer, normale og karsinom vev i mage analysert i denne studien. Uttrykk for hotair ble normalisert til at av GAPDH. Verdiene er uttrykt i forhold til 1.00 for uttrykk i foreldre MKN74 celler.
Soft agar-kolonidannelse analysen
For å belyse funksjonene hotair i forankringsuavhengig vekst av magekreftceller, vi utnyttet en myk agar assay. MKN-hotair celler dannet et større antall kolonier enn MKN-EV celler (
P
= 0,009, figur 4A). I samsvar med dette funnet, KATO-shHOTAIR celler viste betydelige færre kolonier enn KATO-EV celler (figur 4B). I tillegg har de magekreftcellene med lignende hotair ekspresjonsnivået (MKN-hotair og shHOTAIR-3, figur 3B) som er utformet tilsvarende antall av kolonier, som indikerer at forankrings-uavhengig vekst av magekreftceller ble regulert i en varmluft-avhengig måte.
Potential av forankringsuavhengig vekst av magekreftceller ble vurdert av myk agar assay. MKN-hotair celler dannet vesentlig større antall kolonier enn MKN-EV-celler (
P
= 0,009) (A), mens KATO-shHOTAIR celler viste signifikant færre kolonier enn KATO-EV celler i hotair uttrykk måte (EV versus SH- HOTAIR2,
P
= 0,016 og EV versus sh-HOTAIR3,
P
= 0,0035) (B).
hotair uttrykk og magekreft celle metastase og peritoneal formidling
Siden hotair forbedret forankrings uavhengig, men ikke forankringsavhengig vekst av magekreftceller, hypotese vi at hotair kan bidra til fjernmetastaser og /eller peritoneal formidling snarere enn direkte invasjon til nærliggende organer. For å løse dette problemet vi ansatt en halevene analysen og peritoneal injeksjon av celler for å undersøke om hotair uttrykk fremmer blod -borne metastaser og peritoneal formidling, henholdsvis. Som forventet, MKN-hotair celler ofte utstilt levermetastaser (
P
= 0,01) sammenlignet med MKN-EV celler. I tillegg er tall og størrelser av metastatiske leversvulster var betydelig større med MKN-hotair celler enn med MKN-EV celler (
P
= 0,03 og
P
= 0,019, henholdsvis Tall 5A og B). Interessant nok en mus injisert med MKN-hotair viste metastasering til nyrene og binyrene i tillegg til leveren, mens med MKN-EV-celler metastatiske tumorer som dannes bare i leveren. Konsekvent, peritoneal formidling ble betydelig redusert (1/5,
P
= 0,009) når hotair ble inaktivert i KATO III celler, mens alle kontrollceller dannet peritoneal formidling (5/5) (6A og B). Den metastatiske tumorer ble histologisk bekreftet, og de viste intens positiv farging for human cytokeratin (figurene 5C og 6C).
A, Virkningen av varmluft på metastase ble undersøkt ved halevenen assay. 1,0 x 10
5 av varmluft uttrykkende celler (MKN-hotair, n = 9) og kontrollcellene (MKN-EV, n = 9) ble injisert i halevenen til mus. MKN-hotair celler viste oftere levermetastaser (
P
= 0,01) sammenlignet med MKN-EV celler (venstre panel). I tillegg tallene (midten panel) og størrelser av metastatiske leversvulster (panel høyre) var betydelig større med MKN-hotair celler enn med MKN-EV celler (
P
= 0,03 og
P
= 0,019, henholdsvis). B, kan metastatiske svulster klart forstås makroskopisk (pil). C, kreftceller dannet kjertler og ble antatt å være avledet fra de injiserte humane mage kreft cellelinjer (venstre panel, HE, orginal forstørrelse X40). Disse kreftcellene viste intens immunoreaktivitets for human cytokeratin (høyre panel).
A, Peritoneal spredning ble betydelig redusert (1/5,
P
= 0,009) når hotair ble inaktivert i KATO III celler ved shRNA transduksjon, mens alle kontrollceller dannet peritoneal formidling (5/5). B, Musen med peritoneal formidling viste blodige ascites (venstre panel) og knuter (pil i panelet til høyre) i bukhulen. C, The knuter i bukhulen besto av kreftceller, og noen av dem hadde mucin som en signetring cellekreft. De ble antatt å være avledet fra de injiserte humane mage kreft cellelinjer (HE, opprinnelig forstørrelse x 100) siden disse cellene viste intens immunoreaktivitets for human cytokeratin (høyre panel).
Diskusjoner
i denne studien undersøkte vi uttrykket av hotair i magekreft og undersøke dens korrelasjon med de clinicopathological funksjoner, inkludert pasientenes prognose. Våre resultater viste klart forbedret ekspresjon av varmluft i kreftvevet sammenlignet med ikke-cancervev i mage og at det høye nivået av ekspresjon av dette molekyl var forbundet med lymfeknutemetastase, invasjon og venøs dårlig overlevelse i den diffuse typen av magekreft. Disse funn er i overensstemmelse med den siste studien viser at oppregulering av varmluft er funnet i magekreft sammenlignet med normale vev, og er korrelert med tumorstadium og lymfeknutemetastase [17]. I tillegg hotair-uttrykke mage kreftceller utstilt forbedringen av forankringsuavhengig cellevekst
in vitro Hotell og metastaser til leveren
in vivo
mens redusert uttrykk for hotair i magekreftceller resulterte i redusert forankringsuavhengig vekst og peritoneal formidling, tyder på at hotair spiller en sentral rolle i magekreft progresjon.
Høyere uttrykk for hotair ble påvist i kreftceller enn i de tilsvarende ikke-tumorceller i ulike kreftformer, inkludert bryst, tykktarm, lever, bukspyttkjertel og nasofaryngeal kreft [9-11,18-20]. I disse kreftformer, ble hotair også vist seg å være assosiert med metastase og /eller dårlig prognose. Videre ble høye nivå av varmluft ekspresjon korrelerte med kort sykdomsfri overlevelse i lungekreft [12]. Derfor vår nåværende funn er i overensstemmelse med tidligere studier som indikerer at ekspresjon av varmluft er involvert i den forbedrede aggressivitet av ulike typer karsinomceller. På den annen side, kunne vi ikke finne negativ prognostisk effekt av hotair i tarm type magekreft, selv om Internett-hotair gruppe tendens til å vise kortere total overlevelse sammenlignet med lav-hotair gruppe. Dette kan være på grunn av det lave antallet pasienter i denne studien, ettersom tvungen uttrykk for hotair i en intestinal magekreft cellelinje (MKN74) fikk den aggressive fenotype
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre undersøkelser med et stort antall prøver i tillegg til den eksperimentelle studien bruker andre tarm mage kreft cellelinjer ville være nødvendig for å løse dette problemet.
I denne studien ingen sammenheng ble funnet mellom hotair uttrykk og cellevekst i magekreft. I bryst, tykktarm og leverkreft, har involvering av hotair i cellevekst ikke påvist [9,10,18], mens hotair forfremmet og redusert celledeling i bukspyttkjertelkreft [11] og lungekreft [12], henholdsvis. Videre ble ingen signifikant forskjell finnes i subkutan tumorvekst i mus nog mellom hotair-uttrykkende og kontrollceller i denne studien (data var ikke vist). Basert på disse funnene, er det sannsynlig at koblingen mellom hotair ekspresjon og celleproliferasjon er avhengig av hvilken type kreft. I motsetning til dette ble den forankrings-uavhengig vekst av magekreftceller tydelig forbedret i en varmluft-avhengig måte. I tillegg hotair uttrykk forårsaket flere metastaser i leveren og andre organer, og en defekt av varmluft trykkes peritoneal formidling av gastrisk karsinom celler. Disse observasjonene, sammen med det faktum at hotair uttrykk bidrar til metastaser i ulike karsinom [9-12,18], tyder på at hotair er hovedsakelig involvert i metastatisk prosess snarere enn i veksten av primærtumor.
I konklusjonen, forbedret hotair uttrykk i den diffuse typen magekreft var assosiert med forekomsten av venøs invasjon og dårlig prognose uavhengig av T faktor, og tvunget uttrykk for hotair i magekreftceller fremmet forankringsuavhengig cellevekst
in vitro Hotell og metastaser til leveren
in vivo
. Disse resultatene indikerer at varmluft er sannsynlig å være involvert i utvikling av magekreft og kanskje også et terapeutisk mål ved behandling av magekreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
sammenslutning av celleproliferasjon med hotair uttrykk. Resultatene av MTT-analysen evaluert ved 72 timer ble normalisert til den ved 24 timer. Ingen forhold ble funnet mellom hotair uttrykk og magekreft celleproliferasjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077070.s001 plakater (TIF)
Takk
Vi takker professor Kitamura (The University of Tokyo, Tokyo, Japan) for å tilveiebringe platina-A-cellene.
