Abstract
Bakgrunn
Økt uttrykk av cyklooksygenase-2 enzymet (COX2) er en av de viktigste kjennetegnene på magekreft (GC), som er en ledende årsak til død i verden, spesielt i Asia og Sør-Amerika. Selv om Wnt /β-catenin signalveien har vært involvert i transkripsjons aktivering av COX2 genet, er fortsatt ukjent nøyaktig mekanismen moduler dette svaret.
metodikk /hovedfunnene
Her er vi studerte den transkripsjonelle regulering av COX2-genet i GC-cellelinjer og vurdert om dette fenomenet er modulert av Wnt /β-catenin signalering. Vi først undersøkt ekspresjon av COX2 mRNA i GC-celler og funnet at det er en differensialuttrykksmønster i samsvar med høye nivåer av atom lokalisert β-catenin. Farmakologisk behandling med enten litium eller valproinsyre og molekylær induksjon med renset kanoniske Wnt3a betydelig forbedret COX2 mRNA-ekspresjon i en dose- og tidsavhengig måte. Serie sletting av en 1,6 kbp COX2 promoter fragment og gevinst-eller tap-av-funksjon eksperimenter mulig for oss å identifisere en minimal Wnt /β-catenin responsive region bestående av 0,8 kbp av COX2 promoter (pCOX2-0.8), som viste maksimal respons i gen-reporter analyser. Aktiviteten til dette pCOX2-0.8 promoter regionen ble ytterligere bekreftet ved seterettet mutagenese og DNA-proteinbindingsanalyser.
Konklusjon /Betydning
Vi konkluderer med at pCOX2-0.8 minimal promoter inneholder en romanen funksjonell T-celle faktor /lymfoid enhancer faktor (TCF /LSF) -response element (TBE Side II; -689 /-684) som svarer direkte til økt Wnt /β-catenin signalering og som kan være viktig for angrep /progresjon av GC
Citation. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino M, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-catenin Signa Forbedrer syklooksygenase-2 (COX2) transkripsjonen aktivitet i Gastric kreftceller. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10,1371 /journal.pone.0018562
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 05.11.2010; Godkjent: 11 mars 2011; Publisert: 06.04.2011
Copyright: © 2011 Nuñez et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CTI-kreft, Programa Bicentenario en Ciencia y Tecnología (PBCT) – Comisión Nacional de INVESTIGACION Científica y TECNOLOGICA (CONICYT) stipend nummer PBCT-6 fra den chilenske regjeringen (MM og GVD). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en multifaktoriell sykdom, preget av høyt ondartede svulster i mageslimhinnen, og representerer den nest største årsaken til kreftdød i verden med høyest forekomst i Asia og Sør-Amerika [1], [ ,,,0],2], [3]. Miljørisikofaktorer inkluderer kosthold, snus forbruk, fedme og
Helicobacter pylori
infeksjon [4]. Flere mutasjoner i tumor-suppressor-gener, inkludert P53, adenomatøs polypose coli (APC), E-cadherin og RUNX3 [3], [5], så vel som i onkogener som k-ras, HER2 og β-catenin [3], [6], [7], har blitt dokumentert i GC. I tillegg, i løpet av ekspresjon av forskjellige gener er blitt dokumentert, inkludert WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], og cyklooksygenase 2 (COX2) enzym, som katalyserer det avgjørende trinn i produksjonen av prostaglandin E2, en nøkkel mediator av leddbetennelse [10], [11].
det har blitt observert at ekspresjonen av COX2-genet er betydelig økt i human gastrisk adenokarsinom vev, sammenlignet med parvise gastrisk slimhinneprøver blottet kreftceller [10 ]. En slik øket ekspresjon har vært foreslått for å påvirke intensiteten av invasjon, størrelse, lymfeknutemetastaser, tumorutvikling og dårlig prognose [4], [12], [13]. I denne forbindelse, store datamengder beskrive kjemo-preventiv og anticancer aktivitet av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID), inkludert selektive COX2 inhibitorer som potensielle behandlinger for GC [10], [11], [14].
transkripsjonen kontroll av den COX2-genet avhengig av den molekylære maskineri samspill med COX2-promoteren, som synes å være styrt gjennom aktiviteten av forskjellige signalveier [15], [16], [17]. Ja, det ble opprinnelig etablert som CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) og NF-kB (-233 /-214) konsensussekvenser i COX2 promoter var nødvendig for uttrykket av genet [16]. Påfølgende funksjonelle studier i COX2-promoteren identifisert en rekke regulatoriske elementer som deltar i transkripsjonen av genet, inkludert AP-1, AP-2, Sp-1, C /EBPβ [18], [19], [20] og proteiner tilhørighet til T-Cell faktor /Lymfoid enhancer faktor (TCF /LEF) familie av transkripsjonsfaktorer som er avgjørende for Wnt /β-catenin signaltransduksjon [21].
Wnt /β-catenin signalveien er allment anerkjent som å spille en viktig rolle i human sykdom, spesielt i begynnelsen og utviklingen av kreft [22], [23], [24]. Interessant nok har nylige eksperimenter i GC-avledede celler vist en sammenheng mellom COX2 ekspresjon og inhibering av glykogensyntasekinase-3β (GSK3P) enzym [25], som er et nøkkel Wnt komponent som fosforylerer β-catenin og fremmer dens påfølgende degradering via proteasome [26]. Forholdet mellom Wnt /β-catenin og COX2 uttrykk i ulike kreftcellemodeller støttes videre fra følgende studier. For det første har det blitt observert i melke epitel som Wnt /β-catenin spiller en indirekte effekt på COX2 transkripsjon, som kan være mediert av oppregulering av en mellomliggende faktor PEA3 [27]. For det andre, og i motsetning til en indirekte virknings Araki og kolonner. [21] rapporterte at i tykktarm kreft celler er det en induksjons i COX2 uttrykk gjennom en β-catenin /TCF avhengig mekanisme, og delvis preget konsensus TCF /LSF bindingssete (TBE: core CTTTG) posisjonert 1079 bp oppstrøms fra transkripsjonsstart området i COX2 promoter. For det tredje ble det observert at i kolon kreftpasienter og avledede cellelinjer der er en sammenheng mellom overekspresjon av Wnt sti-assosierte proteiner LEF-1 og Pontin52 /TIP49a og oppregulering av COX2 uttrykk [28]. Til slutt, ved hjelp av kondrocytter, har det blitt demonstrert at LEF-1, sammen med β-catenin, regulert COX2 ekspresjon ved direkte binding av LEF-1 /β-catenin komplekset til 3’UTR regionen av COX2 genomiske lokuset [29] . Derfor, i dag er det ikke et klart bilde av om Wnt signal er involvert i COX2 genekspresjon, eller som sin rolle i GC utbruddet /progresjon. Her søkte vi å forstå hvorvidt det er en direkte regulering av COX2 genekspresjon via Wnt /β-catenin signalering og til å identifisere Wnt /β-catenin regulatoriske elementer i promoterregionen av COX2 gen som kan oppregulere COX2 transkripsjon i GC-celler.
Materialer og metoder
Cells og kulturforhold
humane cellelinjer MKN45 (japansk Innsamling av Forsknings Bioressurser, Japan), N87, SNU1, SNU16, KATOIII, AGS, WI38 og HEK293 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ble anvendt i denne studien. MKN45, N87, SNU1 og KATOIII celler ble dyrket i RMPI media (Gibco); AGS i F12K medium (Hyclone); WI38 i EMEM (Gibco); og HEK293 i DMEM (Gibco). Kulturmediet ble supplert med 10% FBS (Gibco) (AGS med 20%) og 1% penicillin /streptomycin. Cellelinjer ble opprettholdt ved 37 ° C i 5% CO
2 og mettet fuktighet.
plasmider og seterettet mutagenese
SuperTOPFlash-luciferase og PRL-TK renilla- luciferasepreparater plasmider [30], det konstituerende aktive β-catenin (S33Y) [31] og de dominerende negative ΔTCF4 ekspresjonsplasmider [32] har blitt beskrevet tidligere. Chimeriske COX2 promoter-luciferase-fragmenter ble generert ved hjelp av PCR av humant genomisk DNA ved å bruke spesifikke primere inneholdende restriksjonsseter og deretter satt inn i pGL3-Basic vektor (Promega). Mutasjonene i TBE-II-setet (-689 /-684) av COX2-promotoren ble samlet ved anvendelse av primere pCOX-0,8-TBEMUT med Quickchange seterettet mutagesis kit (Stratagene). Konstruksjonene ble bekreftet gjennom direkte sekvensering (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Primere sekvenser er beskrevet i tabell S1.
semikvantitative og Real Time RT-PCR
Totalt RNA ble ekstrahert i RNase frie betingelser ved anvendelse av TRIZOL (Invitrogen) og 2 ug av RNA ble reverstranskribert med 200 U of Superscript II revers transkriptase (RT) (Invitrogen) ved anvendelse av 500 ng oligo (dT) primere. Eksperimentell bestemmelse av COX2, c-myc og CCND1 mRNA-nivåer ble utført ifølge [33]. Kort fortalt cDNA ble utsatt for Real-Time PCR i en iCycler iQ System (Bio-Rad Laboratories). Hver 25 ul reaksjonsvolum inneholdt 1 enhet av platina Taq DNA-polymerase (Invitrogen), 1X reaksjonsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,4, og 50 mM KCI), 1,5 mM MgCl
2, 2,5 ug BSA, 0,01% Glycerol , 200 uM av dNTP, 0.3X SYBR grønn oppløsning og 0,4 uM av spesifikke primere (se tabell S1). PCR-betingelsene var som følger: 90 sekunder ved 94 ° C og deretter 30 sykluser på 30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 62 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C. Alle reaksjoner ble utført i tre paralleller og resultatene som ble oppnådd for hvert gen ble normalisert til de som ble oppnådd i parallell med β-aktin. Kvaliteten av RNA og PCR-produktene ble overvåket gjennom forsøkene via elektroforese på 1% agarosegeler, farget med etidiumbromid.
Induksjon av Wnt /β-catenin signalveien
Wnt signal var farmakologisk indusert i MKN45 cellene sådd i 6 brønners kulturplater ved 80-90% konfluens over (dvs. en, to, fire og åtte timers inkubering) enten med 10-20 mM LiCl (Sigma) eller 5-10 mM av valproinsyre (VA; Sigma) som tidligere beskrevet [34], [35]. Deretter ble cellene samlet opp for mRNA-ekstraksjon og sanntids-PCR-bestemmelse som beskrevet ovenfor. På samme måte ble MKN45 cellene stimulert i 2 timer med 200 og 400 ng /ml renset Wnt3a protein. Rensing av Wnt3a ble utført som beskrevet [36].
transkripsjonen aktivitet av COX2-promoteren
Aktiviteten av COX2-promoteren ble målt i 80-90% konfluent MKN45, AGS, WI38 og HEK293 -celler sådd ut i 6 brønners kulturplater. I korthet ble cellene ko-transfektert ved hjelp av Fugene (Roche) i 24 med den pCOX2-luciferase eller pSuperTOPFlash reportere og enten konstitutiv aktiv β-catenin (S33Y) [31] eller den dominerende-negative ΔTCF4 [32] konstruksjoner. PRL-TK Renilla luciferase plasmid ble brukt som en intern kontroll. Firefly og Renilla luciferasepreparater aktiviteter ble bestemt ved bruk av Dual-luciferaserapportørplasmid Assay (Promega) i en Victor-tre multiplate leser instrument (Perkin Elmer), som beskrevet tidligere [30]. Relative luciferasepreparater aktiviteter ble uttrykt ved å dele ildflue luciferase aktivitet med Renilla luciferase aktivitet for hver prøve (N = 3, hver i tre eksemplarer).
Chromatin immunoutfellingsstudier (chip) analyser
chip studiene ble utført i MKN45-celler som tidligere beskrevet [37]. Fraksjonen av atom β-catenin bundet enten til TBE steder I, II, III eller IV i det menneskelige COX2-promotoren ble immunopresipitert med anti β-catenin antistoffer (Santa Cruz) og vurdert ved sanntids-PCR ved anvendelse av spesifikke primere (tabell S1) . I tillegg er den fraksjonen av RNA-polymerase II (Pol-II) og acetylerte histoner H3 og H4 (H3ac og H4ac) bundet enten til TBE-II-region (-793 /-594) eller den proksimale region (-118 /+ 62 ) av COX2 arrangøren var tilsvarende vurdert (anti-Pol-II, Santa Cruz, H3ac og H4ac, Upstate). Som en positiv kontroll brukte vi c-myc TBE området [38]. Antistoffspesifisitet ble analysert med normal kanin-IgG (Santa Cruz).
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA)
EMSA ble utført ved anvendelse av oligonukleotider inneholdende enten villtype COX2 TBE-II konsensussekvensen (se tabell S1) eller tidligere rapporterte mutante TBE sekvenser [39]. I korte trekk, villtype og muterte
32P-merkede oligonukleotider ble inkubert i bindingsbuffer med nukleære ekstrakter av MKN-45-celler i 30 minutter ved 30 ° C. Deretter ble DNA-proteinkomplekser separert fra frie oligonukleotider på en 5% ikke-denaturerende polyakrylamidgel. Etter elektroforese ble gelen tørket og eksponert for film i 1 dag. Visualiseringen av radioaktive bånd ble analysert ved autoradiografi. Bindingsspesifisiteten ble undersøkt ved å inkubere DNA-proteinkomplekser i nærvær av et overskudd av ikke-merket villtype eller muterte oligonukleotider [21], [39].
Statistisk analyse
Hver forsøket ble gjentatt minst tre ganger med tre replikater. Data er vist som gjennomsnitt ± SD. Multiple gruppesammenligninger ble utført ved en-veis ANOVA med STATISTICA 9,0-programvaren.
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
COX2 uttrykk korrelerer med atom β-catenin nivåer i GC celler
Vi i utgangspunktet bestemt uttrykket nivåer av COX2 mRNA i humane GC cellelinjer MKN45, N87, SNU1, SNU16, KATOIII og AGS [40], [41], [42], så vel som WI38 fibroblaster som brukes her som en kontrollcellelinje [43], undersøker enten de var korrelert med Wnt /β-catenin signalering. Som vist i figur 1, ble sterke nivåer av COX2 ekspresjon observert så tidlig som etter 26 sykluser med PCR-amplifikasjon med metastatisk cellelinjer MKN45, SNU16 og KATOIII, og også i den AGS cellelinje som er avledet fra en primærtumor. Dette resultatet er i tråd med COX2 uttrykk nivåer oppdaget tidligere i MKN45, KATOIII og AGS celler [44], [45], [46]. I motsetning til dette, COX2 mRNA-nivåer var enten meget lav i WI38 fibroblaster eller påvises i N87 og SNU1 celler (figur 1A), noe som tyder på at denne differensial mønsteret av ekspresjon ikke er relatert til metastatiske stadier eller nivået av celletransformasjon. Bemerkelsesverdig, kjerne β-catenin nivåene var nært beslektet med COX2 ekspresjon, siden høye nivåer av proteinet ble sett i MKN45, AGS, SNU16 og KATOIII celler, sammenlignet med N87, SNU1 og WI38-celler (figur 1B), noe som tyder på en rolle for Wnt signalering i COX2 mRNA uttrykk i GC-celler.
(A) COX2 mRNA uttrykk i kontroll (WI38) og GC cellelinjer (MKN45, AGS, SNU1, SNU16, KATOIII og N87). Total RNA ble ekstrahert fra dyrkede celler og semikvantitativ RT-PCR ble benyttet for å bestemme COX2 og p-aktin RNA-nivåer som en intern kontroll. Twenty-seks sykluser ble valgt som en tilstrekkelig PCR syklus. (B) Kjerne nivåer av β-catenin protein i samme celle-linjer, som vist i (A), ble undersøkt ved Western Blot analyse ved hjelp av kjerneekstrakter. Den TFIIB generelle transkripsjonsfaktor ble brukt som en intern kontroll.
Forbedring av COX2 uttrykk via Wnt /β-catenin signale
For å undersøke om Wnt kaskade er involvert i COX2 uttrykk, MKN45 celler ble farmakologisk stimulert i forskjellige tidsperioder (dvs. 1, 2, 4 og 8 h) med enten litium (LiCl) eller valproinsyre (VA), siden begge stoffene tidligere har blitt vist å modulere Wnt signalering via hemming av GSK3p-aktivitet og dermed øker atom nivåer av β-catenin [34], [35]. Interessant, observerte vi en markert forbedring av COX2 ekspresjon indusert med 10-20 mM LiCl eller 5-10 mM VA, som startet like etter inkubering med forbindelsene, og som nådde en topp etter to timers behandling (figur 2A). Sanntid fastsettelse av COX2 mRNA nivåer i MKN45 celler behandlet på lignende måte med LiCl eller VA (2 h) indikerte at COX2 var signifikant oppregulert (figur 2B), og at denne effekten Parallelt med den observert på Wnt /β-catenin målgener c-myc [47] og cyclin D1 [48]. Neste, for å utelukke muligheten for at den observerte fenomenet reflektert uspesifikke effekter av legemidler som virker på proteiner som påvirker ulike signalkaskader, vi påføres direkte en fullt funksjonell renset Wnt3a protein til MKN45 celler (se Methods). Disse forsøk viste klart at 200-400 ng /ml renset Wnt3a betydelig forbedret COX2 mRNA-ekspresjon etter korte perioder med inkubasjon (figur 2), delvis forklarer den raske virkning av LiCl og VA og understøttelse av en direkte sammenheng mellom kanonisk Wnt /β-catenin aktivering og stimulering av COX-2 transkripsjon i GC-celler.
(A) COX2 mRNA-ekspresjonsnivåer i MKN45 celler behandlet i 1 til 8 timer med enten 10 til 20 mM av litium (LiCl) eller 5-10 mM av valproinsyre (VA) ble evaluert ved RT-PCR. Som en intern kontroll, ble p-aktin nivåer bestemt. (B) Q-PCR for COX2, c-myc og CCND1 mRNA uttrykk stimulert farmakologisk med litium (LiCl) og valproat (VA) i løpet av 2 timer (øverste panel). Nedre panel, Q-PCR for COX2 i MKN45 celler stimulert med renset Wnt3a i 2 timer. Q-PCR-resultater ble uttrykt som relative mengden (DRN) og p-aktin mRNA-nivåer ble anvendt som intern kontroll. Hver figur svarer til minst 3 uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt gjennom ANOVA test (* p 0,05, ** p 0,01)
Identifisering av nye TBE nettsteder arrangøren av COX2 genet
Tidligere studier indikerte. at en Wnt /β-catenin som reagerer TBE område (konsensus kjerne: CTTTG) er plassert på -1079 /-1074 bp oppstrøms fra transkripsjonsstartsetet (TSS) av det humane COX2-genet [21] (Site IV; figur 3A, se også figur S1). Videre skanning av 1600 bp oppstrøms sekvens fra TSS [49] tillot oss å identifisere 3 nye antatte TBE sider: -877 /-872 bp (Site III; følelse orientering), -689 /-684 bp og -318 /-313 bp (steder II og i, henholdsvis, begge i antisense orientering) (figur 3A), som ikke er konservert mellom de humane og murine gener COX2 (figur S1). Vi klonet derfor den 1600 bp-segmentet fra den humane COX2 promoter (pCOX2), inkludert alle fire TBE områder, inn i den pGL3-basisvektor fusjonert til luciferase-genet som skal brukes senere i rapportør analyser (figur 3A). Bemerkelsesverdig, parallelt transfeksjon av 10 ng av denne konstruksjon i MKN-45 og HEK293-celler viste at pCOX2 viste en signifikant høyere (9-fold) basal promoter-aktivitet i MKN45 celler (figur 3B og C). Vi antok at dette høyere pCOX2 basal promoter-aktivitet kan være relatert til forhøyet innhold av kjernefysisk β-catenin i denne GC cellelinje (figur 1B). Derfor MKN45 og HEK293-celler ble ko-transfektert med pCOX2 i nærvær av lavere doser av en konstitutiv aktiv β-catenin protein (S33Y) [31]. Som observert i figur 3, ble pCOX2 aktivitet faktisk forbedret i begge celletyper, noe som tyder på at β-catenin kan bindes, og deretter aktivere TCF /LEF transkripsjonsfaktorer på de funksjonelle TBE områder innenfor den pCOX2 promoteren.
(A) skjematisk tegning som viser genomisk sammenheng med ca. 1,6 kbp fra transkripsjonsstart nettstedet (TSS) av den menneskelige COX2 promoter, herunder plassering av kjente transkripsjons regulatorer (hvite bokser) og plasseringen av de tre roman TCF /LSF-bindende elementer (TBE: core CTTTG; svarte bokser) bestemmes
i silico
. (B 0,05, ** p 0,01). Atom nivåer av β-catenin protein ble undersøkt i samme cellelinjer gjennom Western Blot analyse (høyre panel). Den TFIIB generelle transkripsjonsfaktor ble brukt som en intern kontroll.
Bidrag av TBE nettsteder til COX2 promoter aktivitet i GC celler
For å dissekere bidrag av Wnt /β-catenin responsive TBE nettsteder på transkripsjonen aktivitet av COX2 arrangøren fire pCOX2 slettinger konstruksjonene ble generert: pCOX-1.2 (-1123 /+ 35 bp); pCOX-0,8 (-741 /+ 35 bp); pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp); og pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (figur 4A). Disse konstruksjonene ble deretter analysert med hensyn på deres aktivitet gjennom forbigående transfeksjoner i MKN45 og AGS-celler, ved hjelp av WI38 fibroblaster som en kontrollcellelinje. I samsvar med de endogene COX2 uttrykk nivåer i disse GC cellelinjer (figur 1A), pCOX2 delesjoner beholdt forskjellige nivåer av aktivitet i MKN45 og AGS-celler (figur 4B og C). I motsetning til dette ble ingen promoter-aktivitet påvist i WI38 fibroblaster (figur 4D), selv når transfeksjon doser i disse cellene ble øket til 8 ganger (det vil si 50 til 400 ng) (figur S2). Viktigere, og i overensstemmelse med tidligere rapporter [50], WI38-celler effektivt uttrykt luciferase-reporter konstruksjon inneholdende promoteren til p21-genet (figur S2), som indikerer at i disse kontrollceller molekylære maskineri ansvarlig for indusering av COX2 transkripsjon er ikke aktivert . Ytterligere eksperimenter viste at transfeksjon i MKN45 og AGS-celler med pCOX2-0.8 konstruksjon, som har 859 bp fjernes fra 1,6 Kb pCOX2 reporter (figur 4A), resulterte i en betydelig økning i promotoraktiviteten sammenlignet med pCOX2-1.2 reporteren (Figur 4A-C). Som ble det ikke observert signifikante forskjeller mellom 1,6 Kb pCOX2 og pCOX2-1.2 konstruksjoner (figur S3), gjorde vi ikke utføre ytterligere analyser med større konstruksjon. Viktigere, representert pCOX2-0.8 minimumsstørrelsen promoterfragmentet som oppviser den maksimale basal aktivitet, ettersom ytterligere delesjon av enten 159 eller 370 bp fra 5′-enden, slik det er tilfelle med den pCOX2-0.65 eller pCOX2-0.4 konstruksjoner, henhold , redusert mer enn to ganger nivåene av pCOX2 basal aktivitet. Disse resultatene indikerer at området på mellom 0,8 og 0,65 kbp oppstrøms for TSS av COX2-genet, og som omfatter en ny TBE-responselement (TBE Side II; -689 /-684), kan være en viktig komponent i reguleringen av basalnivået COX2 genuttrykk i GC-celler.
(A) Skjematisk fremstilling av pCOX2 slettinger. (B-D) Gene reporter analysen i MKN45 (B), AGS (C) og WI38 (D) cellelinjer transient transfektert med 50 ng pCOX delesjoner (pCOX2-1.2; pCOX2-0.8, pCOX2-0.65 og pCOX2-0.4) og 50 ng av tom vektor. I alle forsøkene-celler ble transfektert med 1 ng av PRL-SV40 Renilla som en intern kontroll. Arrangøren aktivitet ble normalisert som forholdet mellom ildflue luciferase og Renilla luciferase enheter. RLU: Relative luciferase Units. Hver figur svarer til minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt gjennom ANOVA test (* p 0,05, ** p 0,01)
oppregulering av pCOX2-0.8 via Wnt /β-catenin signale
Vi neste undersøkt. effekten av Wnt /β-catenin signal på romanen TBE nettstedet II. Vi transfekterte MKN45 celler med den pCOX2-0.8 reporter-konstruksjonen og co-uttrykte den konstitutive aktive β-catenin S33Y protein observere at det var en signifikant (2 ganger) økning av den transkripsjonelle aktivitet av pCOX2-0.8. Dette β-catenin-mediert økning var spesifikk siden den pCOX2-0.4 konstruksjonen ikke var stimulert i dette β-catenin overekspresjon tilstand (figur 5A og B). For å kontrollere for Wnt /β-catenin signalisering i MKN45 celler vi brukte Wnt /β-catenin som reagerer SuperTOPFLASH (STF) reporter bærer 12 kopier av en TBE i tandem [32], som ble transfektert alene eller i nærvær av det plasmid som koder for mutant β-catenin S33Y protein. Interessant, mens ko-ekspresjon med det mutante β-catenin S33Y protein i MKN45 celler var i stand til å forbedre (1,9 ganger) av aktiviteten i STF reporter, høyt nivå av basal STF-aktivitet ble påvist i fravær av den mutante β-catenin (figur 5C). Dette resultatet er i overensstemmelse med våre tidligere funn av høye nivåer av endogen atom β-catenin i denne celle-typen (se figur 1B), og bekrefter at dette nukleær faktor er funksjonell. For ytterligere å bekrefte dette, utførte vi identiske eksperimenter i HEK293-celler og ble oppnådd i det vesentlige tilsvarende resultater, selv om i dette tilfellet en klar dose-responskurve ble oppnådd da pCOX2-0.8 ble transfektert i nærvær av økende konsentrasjoner av den konstitutivt aktive β-catenin S33Y protein (figur S4). I tillegg fant vi at STF aktivitet i HEK293 celler var svært lydhøre for nivåer av eksogene mutant β-catenin (figur S4C).
Gene reporter analyser i MKN45 celler transient transfektert med enten 10 ng pCOX2-0.8 ( A) eller pCOX2-0.4 (B), samt 5-10 ng β-catenin S33Y og 10 ng av tom vektor som kontroll. (C) SuperTOPFlash (STF; 10 ng) ble ko-transfektert med 10 ng av β-catenin S33Y som en positiv kontroll for Wnt /β-catenin signaleringsaktivitet. (D) Virkning av en dominant negativ TCF-4 (ΔTCF) konstruere på aktiviteten av pCOX2-0.8. MKN45 celler ble transient ko-transfektert med 50 ng pCOX2-0.8 og 20-50 ng av ΔTCF. (E) Sammenligning mellom aktiviteten av villtype-pCOX2-0.8 og en mutant MpCOX2-0.8 konstruksjon, som inneholder muterte rester i TBE Side II i pCOX2-0.8 promoteren som bakgrunn. Celler ble transfektert med økende konsentrasjoner av pCOX2-0.8, MpCOX-08, eller like mengder av tom vektor som en kontroll. I alle eksperimentene 1 ng av PRL-SV40 Renilla ble transfektert som en intern kontroll. Arrangøren aktivitet ble normalisert som forholdet mellom ildflue luciferase og Renilla luciferase enheter. RLU: Relative luciferase Units. Hver figur svarer til minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt gjennom ANOVA test (* p 0,05, ** p 0,01)
For ytterligere å undersøke effekten av Wnt /β-catenin sti på aktiviteten i pCOX2-0.8. vi har utført tap-av-funksjon eksperimenter med en dominant negativ TCF4 (ΔTCF) konstruere, som koder for en transkripsjonsfaktor som mangler 30 rester fra sin amino-terminale ende, og som er i stand til å binde β-catenin [32]. Vi har funnet at i MKN45 celler ΔTCF ekspresjonen reduserte den høye nivåer av pCOX2-0.8 basal transkripsjon i en doseavhengig måte (figur 5D). Dette resultatet bekrefter nøkkelrolle av TCF /LEF transkripsjonsfaktorer blant regulatorer av aktiviteten i pCOX2-0.8 promotersekvensen, og ytterligere støtter ideen om at TBE nettstedet II (-689 /-684) er involvert i respons til Wnt /β-catenin signalering.
til slutt, for å direkte adresse rolle TBE nettstedet II i Wnt /β-catenin-mediert regulering av COX2 arrangøren, introduserte vi ved seterettet mutagenese en endring i to nøkkel nukleotider i konsensus sekvensen av TBE Side II-kjerne (dvs. pCOX2-0.8: CTTTG; MpCOX2-0.8: CCTCG). Disse endringene har vist seg tidligere for å avskaffe Wnt /β-catenin-mediert transkripsjon [39]. Forbigående transfeksjon studier viste at mutasjon av TBE Side II signifikant redusert (2-3 ganger) den basale aktivitet av pCOX2-0.8 konstruere i MKN45 celler (figur 5E) sammenlignet med villtype-promotoren pCOX2-0.8 konstruksjon. Videre og etter avtale til våre tidligere resultater, mutasjon av dette TBE nettstedet II nesten fullstendig blokkert β-catenin-mediert forbedring av pCOX2-0.8 konstruksjon (figur S4). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at TBE nettstedet II (-689 /-684) er en funksjonell komponent i COX2 genet transkripsjonsregulering.
β-catenin binder seg til COX2 genet promoter-regionen inneholder TBE nettstedet II
Fordi et transkripsjonelt aktive konformasjon av kromatinstruktur er reflektert av et forhøyet nivå av histon acetylering [51], utfelt vi tverrbundne fragmenter kromatin (gjennomsnittlig størrelse 300-500 bp) isolert fra MKN45 celler ved hjelp av polyklonale antistoffer som er spesifikke for acetylert histoner H3 og H4. På samme måte, vi har oppdaget binding av RNA-polymerase II (Pol II) som en parameter som normalt forbindes med transkripsjonen aktivitet. Vi undersøkte berikelse i våre utfellinger av to promotersekvenser: proksimale promoter (PP) region (-118 /+ 62 fra TSS) og distal region (-793 /-594) av COX2 arrangøren inneholder konsensus TBE nettstedet II ( -689 /-684). Spesielt ble det TBE Side II målrettet siden forrige forsøk indikerte fortrinnsvis binding av β-catenin til denne promoter-regionen (figur S5). Som en positiv kontroll, evaluerte vi binding på TBE området i promoteren til c-myc-genet (-1447 /-1144 fra TSS), som tidligere ble beskrevet i tykktarmskreftceller [38].
acetylert histoner H3 og H4 og Polimerase II-enzym ble funnet å binde i det proksimale promoter-regionen (figur 6A), noe som indikerer at kromatinstruktur rundt COX2-promoteren i MKN45 celler er i en åpen konformasjon, og dermed i overensstemmelse med våre tidligere resultater viser at den COX2 genet er aktivt transkribere. Spesielt ble den β-catenin protein immunoutfelt fra MKN45 prøver for det meste i forbindelse med den promotorområdet som spenner over -684 /-689 TBE-sekvensen i COX2-genet (figur 6B). Denne faktoren var nesten umulig å oppdage ved den proksimale promoter-regionen, noe som indikerer at endogent atom β-catenin er primært rekruttert til TBE Side II i disse GC-celler. Som ventet ble endogen β-catenin samme måte bundet til c-myc promoter TBE området, på nivåer som er sammenlignbare med de som ble observert i COX2 genet promoter (figur 6C).
(A-C) Chip analyser i MKN45 celler ved hjelp av spesifikke antistoffer for β-catenin (β-cat), polymerase II (Pol), H3 og H4 acetylerte histoner (H3ac; H4ac) og immunoglobulin G (IgG). Kvantifisering ble utført ved sanntids-PCR ved å bruke spesifikke primere for den proksimale promoter (PP) region (A), den TBE Side II (-689 /-684) i det humane COX2 promoter (B) og en TBE-område i løpet av c-myc promotor, som en positiv kontroll (C). (D) EMSA analysen i atom ekstrakter fra MKN45 celler. DNA-proteinkomplekser dannet ved å inkubere nukleære ekstrakter (N.E.) fra MKN45 celler med radioaktivt merkede prober inneholdende det intakte og en mutert TBE Side II (søyle 3 og 5) ble løst i native polyakrylamidgeler ved 5% og avdekket gjennom autoradiografi. For å bestemme spesifisiteten av bindingen et 50 ganger overskudd av ikke-radioaktivt merket villtype (linje 4) og mutant (6 og 7) oligonukleotider ble tilsatt. Felt 1 og 2 tilsvarer villtype og mutant-radiomerkede oligonukleotider uten inkubering med N.E. Disse testene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
