Abstract
Bakgrunn
metastaser til skjelettet er en klinisk viktige trekk ved prostatakreft (PCA). Nåværende diagnostiske metoder kan ikke forutsi metastatisk PCa ved en herdbar stadium av sykdommen. Identifisering av metabolske veier involvert i veksten av skjelettmetastaser har derfor potensial til å forbedre PCa prognostication samt terapi.
Metodikk /hovedfunnene
Metabolomics ble søkt om studiet av PCA benmetastaser (n = 20) sammenlignet med korresponderende normale ben (n = 14), og dessuten av ondartet (n = 13) og godartet (n = 17) prostatavev og tilsvarende plasmaprøver oppnådd fra pasienter med (n = 15) og uten (n = 13) diagnostisert metastaser og fra menn med benign prostata sykdom (n = 30). Dette ble gjort ved hjelp av gass-kromatografi-massespektrometri for prøve karakterisering, og kjemometriske bioinformatikk for dataanalyse. Resultatene ble bekreftet i et annet testsett inklusive metastatisk og normalt benvev fra pasienter med andre kreftformer (n = 7). Signifikante forskjeller ble funnet mellom PCA skjelettmetastaser, benmetastaser av andre kreftformer, og normal bein. Videre har vi identifisert metabolitter i primær svulstvev og i plasma som var signifikant assosiert med metastatisk sykdom. Blant de metabolitter i PCA benmetastaser spesielt kolesterol ble notert. I en test angir midlere kolesterolnivået i PCA skjelettmetastaser var 127,30 mg /g sammenlignet med 81,06 og 35,85 mg /g i skjelettmetastaser av forskjellig opprinnelse og normalt ben, henholdsvis (P = 0,0002 og 0,001). Immunhistokjemisk farging av PCA benmetastaser viste intens farging av lav tetthet lipoprotein-reseptor og varierende nivå av scavenger-reseptor klasse B type 1- og 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym-reduktase i tumor epitelceller, noe som indikerer mulighetene for tilstrømning og
de novo
syntesen av kolesterol.
Konklusjon /Betydning
Vi har identifisert metabolitter forbundet med PCa metastaser og spesifikt identifisert høye nivåer av kolesterol i PCA benmetastaser. Basert på våre funn og tidligere litteratur, gjør dette kolesterol en mulig terapeutisk mål for avansert PCa
Citation. Thysell E, Surowiec jeg, Hornberg E, Crnalic S, Widmark A, Johansson AI, et al. (2010) Metabolomic Karakterisering av menneske prostatakreft skjelettmetastaser avslører økte nivåer av kolesterol. PLoS ONE 5 (12): e14175. doi: 10,1371 /journal.pone.0014175
Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 14 juni 2010; Godkjent: 04.11.2010; Publisert: 03.12.2010
Copyright: © 2010 Thysell et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte : den svenske Cancer Society, Vetenskapsrådet, Lions Cancer Research Foundation, KEMPE fundament, Knut og Alice Wallenberg fundament, og Nord-Sverige Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aggressiv prostatakreft (PCA), til slutt sprer seg til benet, er en vanlig og dødelig sykdom som krever tidlig diagnose og effektiv behandling. Aktuelle diagnostiske metoder; måle nivåer av prostata spesifikt antigen (PSA) i blodprøver og undersøker nålbiopsier fra prostata under lett mikroskopi, er imidlertid ikke spesielt effektiv i å skille tilfeller av aggressiv PCa fra den enda mer utbredt og lat former PCa som ofte kan stå uten behandling, eller ved separering av kreft fra andre ikke-maligne prostata lidelser [1], [2]. Ved hjelp av en rekke teknikker flere etterforskere har derfor forsøkt å finne nye diagnostiske metoder og prognostiske markører som kan skille aggressive fra mer lat former PCa (anmeldt i [3]).
Mye arbeid har blitt lagt inn i anerkjennelse av genetiske og proteomic profiler for PCa (gjennomgått i [4]), og magnetisk resonansspektroskopi har blitt brukt til å utnytte metabolske endringer knyttet til PCa [5], [6], [7]. Zakian og colleauges gi en god anmeldelse om emnet [8]. I en nyere artikkel, men Sreekumar og kolleger brukte væske og gass-kromatografi – flukttid massespektrometri (GC /TOFMS) for å profilere metabolomet i vev, urin og plasma fra PCA pasienter og identifisert forandringer assosiert med sykdomsprogresjon [9] . Nærmere bestemt, identifisert de sarkosin,
N
metyl derivat av glysin, som en potensielt viktig markør for PCa celle invasjon, migrasjon, og aggressivitet. Den Sreekumar undersøkelsen sammen med andre nylige studier [10], [11], [12], [13] virkelig indikerer at massespektrometri baserte metoder kan brukes for å karakterisere metabolomic endringer i løpet av kreft progresjon og videre for å identifisere mulige diagnostiske og prognostiske biomarkører eller biomarkør mønstre samt øke vår kunnskap om sykdomsutvikling.
Denne studien ble gjort med hypotesen om at potensielle nye markører for aggressiv PCa kan bli oppdaget ved å finne faktorer markert oppregulert i benmetastaser og deretter undersøke om samme faktorene er også økt i blodprøver og i primære svulster fra pasienter med metastatisk sykdom. Vi utførte derfor en metabolomic studie av PCA benmetastaser sammenlignet med tilsvarende normal bein, primær PCa tumor og normal prostata vev, ved hjelp av metastatisk vev samlet ved kirurgi for komplikasjoner av benmetastaser [14]. Videre, analyserte vi blodprøver fra pasienter med og uten diagnostisert benmetastaser, med det formål å identifisere metabolitter som kan brukes til å forbedre forutsigelse og behandling av avansert PCa. Resultatene ble bekreftet i en egen test satt også inkludert metastatisk benvev fra andre kreftformer. Dette ble gjort ved hjelp av gasskromatografi-massespektrometri for prøve karakterisering og kjemometriske bioinformatikk for dataanalyse og evaluering [15].
Resultater
Prostatakreft benmetastaser viser klare metabolske forskjeller til normal bein og til skjelettmetastaser fra andre kreftformer, inkludert økte nivåer av kolesterol
gasskromatografi-flukttid massespektrometri (GC /TOFMS) ble anvendt for å karakterisere PCA skjelettmetastaser fra 14 pasienter (7 hormon-naive pasienter PCA og 7 pasienter med CRPC) og tilgrensende normalt opptrer bein stykker som var tilgjengelig fra 10 pasienter (tabell 1). I alt ble 123 kromatografiske topper tilsvarende mulige metabolitter funnet av deconvolution [16] etter utelukkelse av toppene som stammer fra interne standarder, forurensning og gjenstander. Av de 123 antatte metabolitter, kan 49 bli tildelt en identitet ved deres massespektra og tilhørende oppbevaring indeks (figur 1). Ortogonale Partial Least Squares diskriminere analyse (OPLS-DA) viste en tydelig og statistisk signifikant separasjon (
P
0,001) mellom de normale bein og bein metastaseprøver, uavhengig av behandling, fastsatt ANOVA av tverr validert modellen (figur 2b). Signifikante forskjeller mellom utvalgsgrupper (VIP 0,9, Variable betydning i OPLS-DA-modellen eller
P
0,05, Mann Whitney U-test) ble funnet for 58,5% (71 av 123) av de antatte metabolitter (figur 2a, Tabell S1). Av de 71 betydelig skjønns metabolitter, kan 34 bli tildelt en identitet ved deres massespektra og tilhørende oppbevaring indeksen, mens 37 ble bare tildelt en mulig forbindelse klasse eller forble uidentifisert. For å validere oppdaget metabolomic signatur i beinmetastatisk vev og for å undersøke om et unikt metabolitt mønster for PCa eksisterer, ble et sett med ekstra prøver profilert i et eget løp. Denne «testsett» inkludert bein metastaseprøver fra prostata (6), bryst (3), nyre (2) og plateepitelkarsinom (2) adenokarsinomer samt normal beinprøver fra tilsvarende pasienter forberedt, profilert og spådd som en egen kontroll kohort (tabell 1). Prediksjon av PCA benmetastaser og tilsvarende normal beinprøver (blinde til modellen) inn i OPLS-DA-modellen viste en klar forskjellsbehandling mellom prøveklassene i testsettet (figur 2c). I tillegg er en egen OPLS-DA-modellen ga en signifikant forskjell (
P
0,001) mellom PCA benmetastaser og tilsvarende normale bein prøvene i testsettet og metabolitter betydelig skille disse utvalgsgrupper (tabell S2 ) overlappet i stor grad med de betydelige metabolitter oppdaget i modellen sett (tabell S1). Videre OPLS-DA utsatt en tydelig og signifikant (P 0,005) skille mellom PCA benmetastaser og metastaser fra andre kreftformer (figur S1)
identifiserte metabolitter er kategorisert i henhold til kjemisk klassen og antall. av metabolitter per klasse signifikant assosiert med metastase er indisert (
P
0,05, Mann Whitney U-test, eller VIP 0,9). Klassifisering av metabolitter i henhold til kjemisk klasse (human metabolomet DB, www.hmdb.ca). n = antall identifiserte metabolitter innenfor hver metabolitt klasse
A) Korrelasjons belastninger (p [1]) fra OPLS-DA analyse av betydelig differensierende metabolitter (
P
0,05, Mann Whitney U-test, eller VIP 0,9) mellom prostatakreft benmetastaser og normal bein viser positive verdier for metabolitter med økte nivåer i benmetastaser og negative verdier for metabolitter med redusert nivå i benmetastaser. Klassifisering av ikke-identifiserte forbindelser ifølge kjemisk klasse (human metabolomet DB; www.hmdb.ca) B) OPLS-DA poengsum plott som viser statistisk signifikant separasjon (
P
0,001) mellom normal bein og prostatakreft skjelettmetastaser. C) Test sett spådommer om prostatakreft benmetastaser og tilsvarende normal beinprøver (blinde til modellen) inn i OPLS-DA-modellen som viser en klar forskjellsbehandling mellom prøve klasser basert på oppdaget metabolomic signatur.
Blant de oppdagede metabolitter i PCA benmetastaser (figur 2a og tabell S1) fant vi økte nivåer av flere aminosyrer i forhold til normal bein, noe som indikerer høy aminosyre metabolisme. Følgelig, de 12 beste kanoniske trasé i PCA benmetastaser slått av systemer pathway analyse (Oppfinnsomhet Systems, Inc.) ble alle relatert til aminosyre syntese og metabolisme (tabell S3). Aminosyremetabolisme var også toppfunksjonen oppført av Oppfinnsomhet pathway analyse for PCa benmetastaser (tabell S4). Videre har vi oppdaget at høye nivåer av kolesterol, myo-inositol-1-fosfat, sitronsyre, fumarat, glycerol-3-fosfat, og fettsyrer (tabell S1), som er relatert til molekylære og cellulære funksjoner innenfor PCA benmetastaser som indikert i tabell S4.
Vi er spesielt bemerket høye nivåer av kolesterol i PCA benmetastaser som kolesterol viste den høyeste VIP verdi når differensiere PCA benmetastaser fra normal benvev (tabell S1, figur 2a), samt fra andre skjelettmetastaser (tabell S5). Videre har kolesterol blitt foreslått for å fremme kreftutvikling og progresjon (anmeldt i [17]), og ble derfor valgt for videre analyse. Den høyt kolesterolnivå i PCA benmetastaser i forhold til normal bein (
P
= 3.12E-5, figur 3a) ble tydelig bekreftet i testsettet data (
P
= 0,001, figur 3b). Interessant, kolesterolnivået i PCA benmetastaser var høyt også sammenlignet med nivåene i skjelettmetastaser fra andre kreftformer (P = 0,0002, figur 3b).
A. Boksplott for kolesterolkonsentrasjonen (mg kolesterol /g vev) viser betydelig høyere nivåer i prostatakreft (PCA) benmetastaser i forhold til normal bein. B. Box plot for kolesterolkonsentrasjonen (mg kolesterol /g vev) i testsettet viser betydelig høyere nivåer i PCA benmetastaser i forhold til normal bein samt sammenlignet med skjelettmetastaser fra andre kreftformer; bryst, nyre, og plateepitel kreft (BCA, KCA og SCA). C-E. Immunhistokjemisk farging av lav tetthet lipoprotein-reseptor (LDL-R), scavenger-reseptor klasse B type 1 (SR-B1), og den 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A reduktase (HMG-CoA red.) I PCa ben metastaser som viser intens farging og indikerer mulighetene for innstrømning samt
de novo
syntesen av kolesterol i tumor epitelceller, som foreslått i FF kolesterol tilstrømning og syntese stimuleres av androgenreseptoren (AR) handling delvis via aktivering av sterol regulerende element-bindingsprotein (SREBP) og påfølgende transkripsjon av LDL-R og HMG-CoA red [24], [25] og androgener kan bli gitt fra kolesterol ved sin omdannelse i flere trinn [27], [28].
Prostatakreft skjelettmetastaser har maskiner for opptak og
de novo
syntesen av kolesterol
kolesterol utgjør en potensiell terapeutisk mål og vi ønsket derfor å undersøke mulige årsaker til de høye kolesterolnivået i PCA benmetastaser. Celler kan oppnå kolesterol ved eksogent innstrømning via low density lipoprotein receptor (LDL-R), scavenger-reseptor klasse B type 1 (SR-B1), eller ved
de novo syntese
fra acetyl-CoA, hvor reduksjonen av 3-hydroksy-3-metylglutaryl-koenzym A (HMG-CoA) til mevalonat er ansett for å være det hastighetsbegrensende trinn [18], [19]. Parafininnstøpte stykker fra PCA metastaser inkludert i GC /TOFMS analyse ble derfor immunostained for LDL-R, SR-B1 og HMG-CoA reduktase. Alle PCA tilfeller viste sterk homogen LDL-R-farging av metastatiske epitelceller og noen ganger mindre intens farging av tilstøtende stromaceller, endotelceller, adipocytter, og beinceller (figur 3c, tabell 2). Epiteliale farging av SR-B1 og HMG-CoA-reduktase ble mer heterogen, som strekker seg fra svak til intens (tabell 2). Interessant, HMG-CoA-reduktase viste særlig intens farging i endotelceller, karvegger, immunceller, og beinceller (figur 3E), mens SR-B1 viste negativ stroma farging (figur 3d). Våre resultater viser at tumor epitelceller i PCa benmetastaser muligens syntetisere kolesterol
de novo
via HMG-CoA-reduktase, men også at andre celletyper i beinmetastaser mikro-miljø uttrykke dette enzymet eventuelt slik at de kan tilveiebringe kolesterol som kan tas opp av tumor-epitelceller via LDL og SRB-1-reseptorer (figur 3f). Det var ingen åpenbare forbindelse mellom heterogeniteten i SR-B1 og HMG-CoA-farging og de tilsvarende kolesterolnivået i PCA-benmetastaser (data ikke vist). Interessant, men PCA benmetastaser viste generelt sterkere farging av LDL-R og SR-B1 enn benmetastaser av ulik opprinnelse (tabell 2), eventuelt bidra til de relativt høyere kolesterolnivå sett i PCA metastaser (Fig. 3) .
Stoffskifte forskjeller mellom primær prostata tumorvev fra høyrisikopasienter med og uten etablerte benmetastaser
primær PCa vev hentet fra pasienter med høy risiko svulster (definert som lokalavansert eller dårlig differensiert kreft; stadium T3-4 og /eller GS 8-10) med (M1, n = 7) eller uten (M0, n = 6) diagnostisert skjelettmetastaser ble profilert i sammenligning med benign prostata prøver (n = 17, tabell 3). Dette resulterte i 157 antatte metabolitt topper av hvilke 59 kan være tildelt en identitet (figur 1). Klar og statistisk signifikant diskriminering (P 0,001), bestemt ved ANOVA av tverr validerte modell, mellom alle tre prostatavevet-timer (godartet, M0, og M1) ble avslørt ved OPLS-DA modellering (fig S2). Vesentlige endringer i forbindelse med metastatisk sykdom, definert som metabolitt endringer i M1 vs. godartet og M1 vs. M0 (P 0,05 eller VIP 0,9) ble oppdaget for 13 metabolitter hvorav åtte ble identifisert (Tabell S6 og S7). Interessant, fire av dem ble også signifikant økt i benmetastaser prøvene sammenlignet med normal ben; aspargin, treonin, fumarsyre, og linolsyre (tabell S1).
Sært metabolittprofiler i blodplasma fra pasienter med høy risiko svulster med og uten etablerte benmetastaser
Undersøkelse av plasma metabolomet fra PCA pasienter med (M1, n = 15) og uten (M0, n = 13) diagnostisert benmetastaser og menn med benign sykdom var basert på 179 løst antatte metabolitter, og av disse 50 kan bli tildelt en identitet (Figur 1). Til tross for den klare overlapper hverandre i serum PSA-nivå (Tabell 3), en signifikant separasjon (P 0,003) ved anvendelse av OPLS-DA modellering ble oppnådd for forskjellen mellom M1 og benign plasma samt mellom M1 og M0 plasma, bestemt ved ANOVA av krysse validerte modeller. Tjuesju metabolitter, syv identifisert, ble funnet som signifikant endret (P 0,05 eller VIP 0,9) i blodplasma fra M1 pasienter sammenlignet med pasienter med godartet (tabell S8) og M0 sykdom (tabell S9). Interessant, av disse 27, fire metabolitter; glutaminsyre, taurin, og fenylalanin (forhøyet i blodet) og stearinsyre (redusert i blod) ble også funnet som metastase markører i benet (tabell S1). En oppsummering av alle identifiserte metabolitter i de forskjellige prøvetypene er angitt i tabell S10 og data finnes i en bære datafil (Data S1).
sarkosin-nivåer i vev og plasmaprøver
sarkosin nivåene ble målt hver for seg i prøvene ved hjelp av AccQ • Tag derivatisering fulgt av LC /MS-analyse. Analysen viste en økning på sarcosine i PCA benmetastaser i forhold til normal bein, mens ingen forskjell kunne observeres i forhold til skjelettmetastaser fra andre krefttyper (Figur S3). I tillegg ble ingen klar sykdomsprogresjon sees når man sammenligner de sarkosin nivåer mellom godartet prostata og primærprostatatumorvevet, selv om det lave antall (n = 5) av primær tumorekstrakter som er tilgjengelige for denne analyse gjorde påvirke påliteligheten av resultatene, og også gjort en sammenligning mellom primærtumor og bein metastase vev upålitelige. Sammenligninger av Sarcosine i blodet plasma viste ingen signifikante forskjeller knyttet til PCa eller tilstedeværelse av benmetastaser
Diskusjoner
her, for første gang, rapporterer en (data ikke vist). omfattende analyse av metabolske mønstre i PCA benmetastaser i forhold til primær PCA godartet prostatavevet, og normalt benvev. Vi har funnet metabolitter som skiller PCA benmetastaser fra normal beinprøver og dessuten fra benmetastaser av ulik opprinnelse. Vi har også funnet metabolitter som, i motsetning til PSA, viste endrede plasma og primær tumor nivåer hos individer med metastatisk PCa sammenlignet med pasienter med høy risiko tumorer, men uten påvisbare metastaser. En av våre mest bemerkelsesverdige funn er høye nivåer av kolesterol i PCA skjelettmetastaser, som sannsynligvis nås med
de novo
syntesen av kolesterol i tumor epitelceller samt tilstrømning av denne metabolitten fra omgivelsene via LDL R og SR-B1.
økt biotilgjengelighet av kolesterol i tumorceller kan ha høy biologisk relevans for benmetastaser vekst, som kolesterol tilskudd har vist seg å øke PCa tumorcelle-proliferasjon, migrering og invasjon
i vitro product: [20], mens kolesterol målretting induserer apoptose [21], sannsynligvis ved å redusere fett flåten kolesterolinnhold og derved forstyrre vekstfaktor signalering [21], [22]. Den prostatakjertel inneholder vanligvis høye nivåer av kolesterol i forhold til andre organer og forhøyet kolesterolnivå har tidligere vært forbundet med PCa [23]. Ytterligere heving av kolesterolnivået i benmetastaser kunne åpenbart reflektere høy etterspørsel etter membran biosyntese i prolifererende celler, men også det faktum at kolesterolmetabolisme er direkte regulert av androgener (oversikt i [24]). Androgener positivt regulere LDL-R-gen-transkripsjon og også fremme kolesterolsyntesen ved å øke transkripsjon av HMG-CoA-reduktase [25], og således den hastighetsbegrensende omdannelse av HMG-CoA til mevalonat [26]. Som androgen reseptorer uttrykkes og presumingly aktiv i et flertall av benmetastaser i CRPC [14], androgen handlinger trolig bidra til høyere kolesterolnivået i PCA metastaser sammenlignet med skjelettmetastaser av ulik opprinnelse. Kolesterol i sin tur muligens bidrar til androgen reseptor signalisering og dermed kastrering motstandsdyktig tumorvekst hos pasienter behandlet med androgen-deprivasjon terapi, ved sin konvertering til androgener av metabolske enzymer [27], [28]. Følgelig har en vestlig diett og høy serumnivåer av kolesterol er assosiert med økt PCa risiko i en rekke studier [29], [30], [31], selv om resultatene ikke har vært helt avgjørende (anmeldt i [17]) . Interessant, viser en lavere risiko for å utvikle høyverdige PCA menn med lav serum kolesterol nivåer [32], og i tråd med dette, langsiktig bruk av HMG-CoA-reduktasehemmere ( «statiner») for forebygging av en fersk undersøkelse kardiovaskulær sykdom har blitt vist å redusere risiko for progresjon til PCa aggressiv, dødelig sykdom [33], [34], [35], [36]. Kolesterolsenkende midler har også vist seg å hemme veksten av PCA celler
in vitro Hotell og i modellen eksperimentelle systemer
in vivo product: [37], [38]. Tatt sammen indikerer disse resultatene at muligheten for å bruke kolesterol-inhibitorer som behandling eller kjemopreventive midler for PCa metastase, men nye legemidler blir deretter nødvendig som statiner som brukes i dag hovedsakelig konsentrere seg til leveren og dårlig nå perifere organer [17].
Vi har funnet høye nivåer av mange aminosyrer i PCA skjelettmetastaser, og aminosyremetabolisme var den mest endret funksjonelle reaksjonsveien forbundet med PCA benmetastaser ifølge oppfinnsomhet pathway analyse. Våre resultater støtter dermed metabolomic basert studie av Sreekumar og medarbeidere [9], og også tidligere gen-uttrykk baserte studier som viser økt proteinsyntese i løpet PCa progresjon [39]. Interessant, er en nyere artikkel høye opplyst at også nivåer av aminoacyl tRNA syntetaser (aaRSs) økte i løpet PCa progresjon og dessuten er det transkripsjon av noen aaRSs stimulert av androgener [40]. Dette bemerkelsesverdige funn kan muligens være koblet til det faktum at vi fant økte nivåer av visse aminosyrer slik som treonin, glutamat, fenylalanin innenfor PCA benmetastaser i sammenligning med benmetastaser av forskjellig opprinnelse. I tillegg til de aminosyrene, andre kjente metabolitter i våre data (sitronsyre, fumarat, glycerol-3-fosfat, og fettsyrer) indikerer en høy energimetabolismen som kan reflektere det høye andel av prolifererende celle innenfor benmetastaser [14]. Videre kan de høye nivåene av myo-inositol-1-fosfat være et tegn på aktiv celle signalisering som involverer inositol-baserte molekyler som andre budbringere, som inositolfosfater og phosphatidylinositol fosfater. Disse molekyler er involvert i aktivering av proteinkinase C og Akt og således for å regulere prosesser betraktes som kjennetegner kreft, dvs. celle-proliferasjon, apoptose, differensiering, invasjon og angiogenese [41]. Samlet endringer i metabolomet påvist i denne studien som i forbindelse med PCA benmetastaser indikert forstyrrede molekylære og cellulære funksjoner av klar relevans for kreft progresjon. Den relative betydningen av disse funksjonene er imidlertid vanskelig å tildele, som de blant annet avhenge av metabolitten klasser påvisbare i GC /TOFMS analyse og identiteter som oppnås innenfor tilgjengelige biblioteker. Med GC /TOFMS metabolittprofilering metoden vi var ikke i stand til å oppdage sarcosine i prøvene. Men ved hjelp av en målrettet analyse tilnærming, har vi funnet høye nivåer av sarcosine i benmetastaser i samsvar med tidligere funn av økte nivåer av sarcosine med PCa progresjon [9]. Viktigere skjønt, vi fikk ikke se noen forskjell i Sarcosine nivåer mellom PCA benmetastaser og skjelettmetastaser av ulik opprinnelse, noe som indikerer at sarcosine er ikke PCa bestemt, men i stedet forbundet med avansert kreft og metastasering. En mer helhetlig bilde av spesifikke biologiske nettverk av betydning for PCa metastaser veksten vil bli oppnådd som analysemetoder utvikle og biblioteker for identifisering få mer komplett, men kan også oppnås ved å kombinere metabolomic data med genomisk eller proteomikk data. Så langt vi spesielt oppmerksom på at threonin, aspargin, fumarsyre, og linolsyre øker ikke bare i skjelettmetastaser, men også i primære prostatavev fra pasienter med bekreftet benmetastaser sammenlignet med M0 pasienter. Essensielle fettsyrer såsom linolsyre har vist seg å stimulere PCa tumorvekst i modellsystemer [42], [43], og omdannelsen av linolsyre til arakidonsyre og videre inn i prostaglandiner kunne muligens stimulere en inflammatorisk respons som er forbundet med patogenesen av PCa [44].
Hverken kolesterol eller sarkosin ble imidlertid prognostiske for benmetastaser i plasma. I stedet høye nivåer av glutamatic syre, fenylalanin, og taurin ble funnet ved PCA beinmetastaser vev og i plasma fra menn med diagnostisert PCA benmetastaser. Glutamat ble nylig vist i studien av Sreekumar og kolleger skal økes ved PCA vev [9] og interessant, kreftceller som forårsaker bein avbrudd i dyremodeller skiller ut glutamat inn i deres miljø [45]. Som glutamaterg intercellulær kommunikasjon er viktig for normal ben homeostase via glutamat reseptorer på bestemte benceller (oversikt i [46]), det er mulig at forstyrrelser i dette systemet kunne det ikke påvises under prosessen av benmetastase. Våre resultater er også i tråd med en fersk studie som fant høyere taurin nivåer ved PCA enn i godartet vev når vurdert ved hjelp av magi vinkel spinne ((1) H HR-MAS) NMR-spektroskopi [47]. Verdien av disse metabolittene som plasma-markører for aggressiv PCa må imidlertid bekreftes i videre studier.
I konklusjonen, vi har identifisert metabolitter forbundet med prostata kreft metastase og spesielt bemerket høye nivåer av kolesterol i PCA benmetastaser. Basert på våre funn og tidligere litteratur, gjør dette kolesterol en mulig terapeutisk mål for avansert PCa. Selv om dette er den største metabolomic studiet av PCA benmetastaser utføres det absolutt har sine begrensninger. Tidligere
1 H NMR-studier har avdekket åpenbare endringer i nivåene av citrate og kolin mellom benign prostata og svulstvev [5], [6], [7] men noe om, vi var ikke i stand til å finne slike forskjeller i citrate nivåer. vi med vår metode verken kunne oppdage choline. Disse resultatene markere begrensninger vår metode og påpeke behovet for komplementære tilnærminger i søket etter nyttige metabolomic biomarkører. Videre heller lavt antall pasienter inkludert og heterogenitet av metastatisk sykdom gjør evaluering i videre studier er nødvendig før betydningen av våre resultater kan være trygg.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
studier ble godkjent av den lokale etikk gjennomgang styret i Umeå universitet og deltakerne ga skriftlig eller muntlig samtykke.
Prøver
benmetastaser og tilstøtende normalt vises stykker benvev ble hentet fra en serie av ferskt frosset biopsier oppsamlet fra pasienter med kreftdiagnose eller mistanke om kreft, metastatisk operert for ryggmargskompresjon eller patologiske frakturer (tabell 1). Pasienter har blitt grundig beskrevet i [14].
Blodplasma var tilgjengelig fra en rekke menn som gjennomgikk transrektal ultralyd-veiledet nål biopsi av prostata, på grunn av økt serum PSA nivå, og primær PCa og benign prostata biopsier var assessable i noen tilfeller (Tabell 3). Pasientene inkludert i denne studien ble alle valgt å ha høy risiko svulster definert som; Tilstedeværelsen av benmetastaser eller et lokalavansert tumor eller en dårlig differensiert kreft (M1 og /eller T3-4 og /eller GS 8-10), mens menn med benign sykdom hadde minst to runder med negative biopsier. PCA saker og godartet tilfeller ble matchet i henhold til tid siden prøvetaking. Ytterligere informasjon om pasienter og prøveopparbeidelse er gitt i støtte tekst (tekst S1).
Metabolomic profilering ved hjelp av GC /TOFMS
Tidligere GC /TOFMS analyse de lavmolekylære metabolitter i plasmaprøver var ekstrahert og derivatisert som tidligere beskrevet [48]. Vevsprøver ble ekstrahert med H
2o /metanol /kloroform (1:03:01) blanding inneholdende 11 interne standarder A [48] (1 ml per 15 mg av vev) jevnt fordelt over den kromatografiske oppbevaring span. Ekstraksjon ble utført på i kulemølle med to wolfram perler og resten av prosedyren var den samme som for plasmaprøver. Derivatiserte prøve ekstrakter ble deretter injisert i splitless-modus ved en CTC Combi Pal autosampler (CTC Analytics AG, Zwingen, Sveits) i en Agilent 6890 gasskromatograf utstyrt med en 10 m x 0,18 mm indre diameter kapillarkolonne av smeltet silisiumdioksyd med kjemisk bundet 0,18 um DB 5-MS stasjonære fasen (J W Scientific, Folsom, CA, USA). Kolonneavløpet ble innført i ionekilden av en Pegasus III time-of-flight massespektrometer, GC /TOFMS (Leco Corp., St. Joseph, MI, USA). Et alkan serie (C10-C40) ble kjørt for hver enkelt GC /TOFMS løp. Flere detaljer om prøveopparbeidelse, derivatisering og GC /TOFMS analyser kan bli funnet i den utfyllende informasjon. Reproduserbarheten av metoden har blitt rapportert tidligere [16], [48].
prosessdata
Data pre-behandling inkludert baseline korreksjon, kromatogram justering, tidsvinduet setting, hierarkisk multivariat kurve oppløsning (H-MCR) [11] og normalisering ble utført i MATLAB [versjon 7.3] med egendefinerte skript. Flere detaljer om databehandling kan bli funnet i saksdokumenter (Tekst S1)
Dataanalyse og statistikk
Orthogonal Partial Least Squares -. Diskriminant analyse (OPLS-DA) [49] var brukes for å trekke ut og tolke den systematiske variasjonen i de oppløste GC /TOFMS vev og plasma-profiler knyttet til spesifikke svar. Målet var å trekke metabolske mønstre knyttet til PCa og mer spesifikt til metastatisk sykdom.
