Abstract
Bakgrunn
TGF-β spiller en dobbeltrolle i utviklingen av kreft hos mennesker. I løpet av de tidlige stadier av kreftutvikling, TGF-beta fungerer som en tumor suppressor. I løpet av de sene stadier av tumorutvikling, men kan TGF-β fremme tumorvekst og metastase. En forskyvning i Smad2 /3 fosforylering fra karboksyterminalen til kopler områder er en viktig hendelse å bestemme biologisk funksjon av TGF-β i kolorektal og leverkreft. I denne studien undersøkte vi den potensielle rolle differensial Smad2 /3 fosforylering i adenokarsinom i ventrikkel.
Metodikk
Immunhistokjemisk farging med anti-P-Smad2 /3C og P-Smad2 /3L antistoffer ble utført på 130 parafininnstøpte gastrisk adenokarsinom prøver. Forholdet mellom P-Smad2 /3C og P-Smad2 /3L immunhistokjemiske score og clinicopathologic kjennetegn ved pasientene ble analysert. Real time PCR ble brukt til å måle mRNA uttrykk for Smad2 og Smad3 i kreft og omkringliggende ikke-svulstvev.
hovedfunnene
Ingen signifikant P-Smad2L og /eller P-Smad3L positiv farging var påvist i de fleste av prøvene (positiv farging i 18/130 prøver). Positive P-Smad2 /3L farging ble ikke assosiert med en reduksjon i karboksyterminale fosforylering farging. Tap av P-Smad2C bemerkelsesverdig korrelert med dybden av tumorinfiltrasjon og dårlig differensiering av kreftceller hos pasienter med magekreft. Ingen sammenheng kunne påvises mellom P-Smad3C og clinicopathologic kjennetegn ved adenokarsinom i ventrikkel. Men co-farging analyse avslørte at P-Smad3C samlokalisert med α-SMA og kollagen jeg i magekreftceller, noe som indikerer en mulig sammenheng mellom P-Smad3C og epitelial til mesenchymale overgang av kreft. Real time PCR viste redusert mRNA uttrykk for Smad2 i magekreft sammenlignet med omkringliggende ikke-svulstvev i 15/16 pasienter.
Konklusjoner
Tap av P-Smad2C tett korrelert med kreft invasjon og dårlig differensiering i magekreft. I motsetning til kolorektal og leverkreft, kanonisk karboksyterminale fosforylering, men ikke kopler fosforylering, av Smad2 er kritisk for magekreft
Citation. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Mu Y, Munker S, et al. (2012) reduserte nivåer av Active SMAD2 Correlate med dårlig prognose i magekreft. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10,1371 /journal.pone.0035684
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 6 oktober 2011; Godkjent: 20 mars 2012; Publisert: 23 april 2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av Helse Bureau of Zhejiang-provinsen i Kina, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S.D.); BMBF «Hepatosys» 0313082L, «Virtual lever» og «celle terapi» 01GN0987 (S.D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S.D.) og LA997 /5-1 (S.D.); og Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S.D.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden, ranking andre i hanner og fjerdeplass i kvinner i frekvens [1]. Patogenesen av magekreft er tilknyttet flere faktorer. Blant disse feilregulering av signalveier knyttet til utviklingsprosesser, inkludert transvekstfaktor-β (TGF-β), Wnt /β-catenin, pinnsvin og Notch signalering, spiller en sentral rolle i utvikling og progresjon av denne kreften [2].
TGF-β familie av molekyler, inkludert TGF-p-isoformene, aktiviner og benmorfogene proteiner (BMPs), har viktige funksjoner i en rekke fysiologiske og patofysiologiske prosesser, f.eks embryoutvikling, autoimmune sykdommer, fibrose og kreft [3], [4]. TGF-β transduces sine signaler ved å stimulere dannelsen av heteromere komplekser av TGF-β type I (TGF-βRI) og type II (TGF-βRII) serin /treonin-kinase-reseptorer. Aktivert TGF-βRI forplanter signale ved rekruttering og fosforylering av reseptor-regulert-Smads (R-Smads, inkludert Smad2 og Smad3). Fosforylering av C-terminal serinresidua i R-Smads er et viktig skritt for kanonisk TGF-β signalering. De to mest C-terminale serin-rester ved serin 465/467 i Smad2 og serin 423/425 i Smad3 er fosforylert, sammen med et tredje ikke-fosforylerte serinrest, danner en evolusjonært konservert SSXS motiv i alle R-Smads [5], [6]. Foruten C-terminal fosforylering av Smad2 /3 (P-Smad2C og P-Smad3C) av TGF-βRI, andre kinaser, f.eks c-Jun N-terminal kinase (JNK) og Ras-assosierte kinaser, årsaken fosforylering av R-Smads på linker steder rundt serin 249/254 i Smad2 og serin 208/213 i Smad3 (P-Smad2L og P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforylerte R-Smads danne et kompleks med felles Smad (Co-Smad; Smad4 hos pattedyr) og transport inn til kjernen for målet gentranskripsjon [3]. Foruten R-Smad og co-Smad, den tredje typen Smad protein er inhibitor-Smad (I-Smad, Smad6 og Smad7). I-Smads er transkripsjonelt indusert av TGF-β, noe som indikerer en negativ tilbakekoblingsmekanisme av denne signalveien [4].
TGF-β spiller en dobbeltrolle i utviklingen av kreft hos mennesker [9], [10] . I de tidlige stadier av kreft, TGF-B fungerer som en tumor suppressor ved å inhibere cellulær proliferasjon eller ved å fremme cellulær apoptose. Men i de sene stadier, støtter TGF-β tumorprogresjon som tumorcelle invasjon, formidling og immununndragelser [9]. I tillegg er TGF-β vel anerkjent som en mediator av epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) i kreft [11]. Selv om forstyrrelser av TGF-β /Smad signalering er sentrale i kreftutvikling i de fleste organer, sin svulst fremme utfallet er svært kontekstavhengig. For eksempel er TGF-β signale svingbar i vedlikehold av kreft stamcelle selvfornyelse og tumorigen aktivitet i gliomer og leukemi, mens effekten av TGF-β signalering ved brystkreft stamcelle er kontroversielle [12]. En studie viste at blokkering av TGF-β vei via en dominant negativ TGF-βRII øker størrelsen på bryststamcellelinjen og fremmer tumorgenese, noe som indikerer en undertrykkelse av bryst karsinogenese av dette cytokinet [13]. I motsetning Mani og kolleger fant at TGF-β sti oss kritisk i vedlikehold av brystkreft stamcellelignende egenskaper og tumorigent aktivitet via induserende EMT [14].
I magekreft, enkelt-nukleotid polymorfismer ( SNPs) av TGF-β er forbundet med følsomhet å iscenesette i og stadium II av magekreft [15], [16]. Serumnivåene av TGF-β ble rapportert å signifikant korrelert med venøs invasjon i pasienter med magekreft [17]. Imidlertid detaljerte mekanismer for TGF-β signalering i magekreft progresjon er fortsatt ukjent. I tillegg er det fortsatt uklart når og hvordan TGF-β forvandles fra en tumor suppressor inn i en svulst promoter under kreftutvikling.
Nylig, et skifte i fosforylering av Smad2 /3 fra C-terminal til linker nettsider ble demonstrert som en nøkkelhendelse å bestemme biologisk funksjon av TGF-β i kreft [18], [19], [20]. Tidligere studier basert på 12 års oppfølging viste at kronisk HBV /HCV pasienter med P-Smad2 /3L i levervevet hadde en høyere risiko for å fremme til leverkreft (HCC) enn de med P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. I samsvar med funnene i HCC, ble tilsvarende observasjoner gjort i tykk- og endetarmskreft [7], [22].
For å undersøke bidraget av differensial Smad fosforylering mot kreftutvikling i magekreft, undersøkte vi P-Smad2 /3C og P-Smad2 /3L nivåer i 130 pasienter med adenokarsinom i ventrikkel ved immunhistokjemi (IHC). Vi analyserte mulige sammenhenger mellom ulike områder av fosforylering av R-Smads og invasjon, lymfeknutemetastaser, differensiering og stadium av magekreft.
Resultater
Linker fosforylering av Smad2 /3 er ikke forbundet med magekreft
i motsetning til tidligere funn fra tykktarmskreft og HCC [7], [8], [21], [22], vi gjorde ikke oppdage betydelig P-Smad2L og /eller P-Smad3L positive flekker på mage vev fra pasienter med magekreft. Kun 18 av pasientene viste 130 p-Smad3L positiv farging hovedsakelig i ikke-cancerceller. Disse resultatene tyder på at linker fosforylering i serin områder av Smad2 /3 er ikke kritisk i magekreft.
Ulike funksjoner i P-Smad2C og P-Smad3C nivåer i magekreft
118 av 130 mage vev viste P-Smad2C positiv farging, og 91 av 130 mage vev var positive for P-Smad3C farging hhv. Til forskjell fra P-Smad2C positiv farging, som bare ble viser i kjernen av normale celler og kreftceller (Fig. 1A), P-Smad3C positiv farging ble påvist i kjernen (59/130, fig. 1B), ved membranen og /eller i cytoplasma (73/130, fig. 1C) av magekreftceller. I tillegg ble P-Smad3C sett av positiv farging i fibroblaster rundt kreftceller (81/130 og 91/130, Fig. 1 D).
Mønstre av P-Smad2C (A) og P-Smad3C (B D) IHC flekker i magekreft. (B) P-Smad3 nukleær farging; (C) P-Smad3 membran /plasma flekker; (D) P-Smad3 fibroblast farging.
Redusert P-Smad2C bemerkelsesverdig korrelerer med tumor dybde (T) og differensiering av kreft (G) hos pasienter med magekreft
Vi målte P-Smad2C IHC-farging ikke bare i tumoren, men også i omkringliggende ikke-tumorvev fra 130 pasienter med magekreft. P-Smad2C positiv farging i enten kreft eller normale celler omvendt korrelert med differensiering av magekreft (både
p
0,0001, tabell 1). I tillegg vil redusert P-Smad2C IHC poengsum i kreftceller korrelert med tumor dybde (
p
0,05, tabell 1). P-Smad2C nivåer i normalt vev viste også en potensiell omvendt korrelasjon med kreft invasjon hos disse pasientene (
p
= 0,07, tabell 1). P-Smad2C IHC resultatet ble signifikant redusert i kreftvev, sammenlignet med ikke-tumorvev i 77 av 130 pasienter med magekreft. Videre, innenfor tumorvev, kreftceller med dårlig atypia viste redusert P-Smad2C flekker, sammenlignet med godt differensierte seg (fig. 2). Kendall-tau korrelasjonsanalyse viste en mulig korrelasjon mellom reduksjon av P-Smad2C farging og overgang fra normal til kreftceller i magekreft (
p
= 0.05, tabell 2), hvilket antyder at aktivering av Smad2 signalering er en kritisk suppressor av tumordannelse og progresjon.
(A) Immune positivitet av P-Smad2C ble betydelig redusert i kreftvev (
b
) sammenlignet med omkringliggende normalt vev (
a
) i 77 av 130 pasienter med magekreft. Representative bildene ble tatt fra en pasient med signetring cell carcinoma. (B) I tumorvev, kreftceller med dårlig atypia (
e-h
) viste redusert P-Smad2C flekker i forhold til de med et godt differensiert fenotype (
a-d
).
P-Smad3C finnes ofte hos kreft assosiert fibroblaster
P-Smad3C IHC poengsum ikke viser en signifikant sammenheng med T /N /G /S av magekreft prøver (tabell 1). Imidlertid P-Smad3C positiv farging ofte forekom hos fibroblaster som omgir kreftceller hos pasienter med magekreft (fig. 1).
Kreftceller er av epitelial opprinnelse og uttrykker ikke mesenchymale markører, f.eks a-SMA og kollagen I. Hvis kreftceller uttrykker mesenchymale markører, er det tyde på epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) [11]. I foreliggende studie har vi funnet α-SMA-positiv farging i kreftceller hos 54 av 130 pasienter med magekreft (f.eks pasient-1 i fig. 3). For å klargjøre den potensielle koblingen mellom p-Smad3C og EMT, undersøkte vi korrelasjonen mellom p-Smad3C farging (kreft og omgivende ikke-kreft vev) og α-SMA-positiv farging i kreftceller. Kendall-tau rang korrelasjonskoeffisienter mellom p-Smad3C IHC score i kreft /omkringliggende ikke-kreft vev og α-SMA IHC score i kreft er 0,14 (
p
= 0,08) og -0,09 (
p
= 0,99), henholdsvis (tabell 3). For å bekrefte EMT hos disse pasientene, utførte vi co-farging for brev, en annen spesifikk markør for EMT, og kollagen I /α-SMA i mage vev. Konfokal mikroskopi avslørte ko-lokalisering av brev og collagen I (fig. 4A) /α-SMA (fig. 4B) i noen gastriske kreftceller. Disse α-SMA positive mage kreftceller i tillegg vises P-Smad3C positiv farging (fig. 4C). Foruten samlokalisering med α-SMA positive mage kreftceller, konfokalmikroskopi avslørte at P-Smad3C samlokalisert med kollagen jeg i mage kreftceller (fig. 4D). Videre, P-Smad3C positiv farging samlokalisert med α-SMA og kollagen I ikke bare i kreftceller, men også i fibroblaster (fig. 4C-4D). Disse resultater antyder at P-Smad3C kan bidra til EMT av magekreft hos noen pasienter.
Representative bilder fra to pasienter med gastrisk kreft viser α-SMA og P-Smad3C farging i kreft område (tumor) og omgivende ikke- -cancer vev (ikke-tumor).
Konfokalmikroskopi analysen viser samlokalisering av sneglen og kollagen i (A) /α-SMA (B) i et representativt pasient med magekreft. Det samme pasient i tillegg viser samlokalisering av P-Smad3C og kollagen I (C) /α-SMA (D) i magekreft.
Tap av total Smad2 og Smad3 uttrykk i pasienter med magekreft
i tillegg til å måle P-Smad2 i magekreft, brukte vi real-time PCR for å påvise mRNA uttrykk for Smad2 og Smad3 i magekreft og omkringliggende ikke-tumorvev fra 16 pasienter. 15 og 12 pasienter henholdsvis demonstrert redusert mRNA-ekspresjon av Smad2 og Smad3 i kreftvev, sammenlignet med omgivende normale vev (Fig. 5). Disse resultater indikerer at ikke bare aktivert Smad2 men også den mRNA-ekspresjon av total Smad2 er redusert i løpet av magekreftutvikling.
Sanntids-PCR ble utført for å bestemme mRNA ekspresjon av Smad2 (A) og Smad3 (B) i 16 mage kreft vev og omkringliggende ikke-tumorvev (nr 1-5: midten differensiert kreft, No. 6-13: dårlig differensiert kreft og nr 14-16: signet-ring celle kreft)
diskusjon
i tykktarms adenokarsinom og HCC, har et skifte i fosforylering fra karboksyterminal å kopler regioner blitt foreslått som en kritisk hendelse i forbindelse med bytte av TGF-β fra en kreft lyddemper til et onkogen faktor [ ,,,0],8], [18], [19], [20], [21], [22]. I denne studien undersøkte vi dette potensialet foreningen i magekreft. Vi fant ikke signifikante P-Smad2L og P-Smad3L nivåer i 130 pasienter med magekreft. 112 av 130 pasienter som ikke viser P-Smad2L eller P-Smad3L farging i magekreftceller, tyder på at den foreslåtte skift i fosforylering av R-Smad ikke kan bidra til TGF-β mediert karsinogenese i denne type kreft. I motsetning til P-Smad2 /3L, både P-Smad2C og P-Smad3C positiv farging ble påvist i de fleste pasienter med magekreft. Kendall-tau rank korrelasjonsanalyse viste at P-Smad2C IHC stillingen inverst korrelert med dybden av tumor (T) og differensiering av kreft (G).
rolle Smad2 under dannelsen og utviklingen av ulike krefttype fortsatt kontroversielt . I samsvar med gjeldende funn, tidligere studier på esophageal plateepitelkarsinom, brystkreft og tykktarmskreft viste at tap av Smad2 uttrykk er korrelert med tumorutvikling og dårlig prognose [23], [24], [25], [26]. Nylig Hoot og kolleger fant at Smad2, men ikke Smad3, ofte ble borte i 83 pasienter med hud plateepitelkarsinom. Videre mus med keratinocyte spesifikke Smad2 sletting vises akselerert dannelse og ondartet progresjon av kjemisk indusert muse hudkreft sammenlignet med villtype mus [27]. Men i en studie av 52 pasienter med gliom, ble en positiv P-Smad2 IHC poengsum rapportert å korrelere med spredning av hjernesvulst og dårlig prognose [28]. Før denne studien, Shinto og kolleger målte P-Smad2C flekker i 135 pasienter med magekreft. De fant at P-Smad2C nivåene var høyere i dårlig differensiert kreft sammenlignet med godt differensiert seg [29]. Det er ikke klart ennå hvorfor det er helt motstridende resultater i magekreft.
I kanonisk TGF-β signalering, aktiveres TGF-βRI induserer vanligvis karboksyterminale fosforylering av både Smad2 og Smad3. Aktivert Smad2 og Smad3 spille ulike roller i cellevekst, differensiering og andre biologiske funksjoner [30]. I leveren, er Smad2 viktig ved formidling av hepatocytt-vekst og differensiering, mens Smad3 spiller en viktig effekt på de morfologiske og funksjonelle modning av leverstel celler [31], [32]. I kreft, er det kontroversielt om forstyrrelse av Smad3 gen bidrar til tumorigenesis. Zhu rapportert at Smad3-manglende mus utvikler kolonkarsinom [33]. Men andre studier ved hjelp av Smad3-manglende mus antydet at tapet av Smad3 alene er ikke tilstrekkelig til å igang tumorgenese [34], [35], [36], [37]. I magekreft, Han fant små mengder av Smad3 i 3 av 8 pasienter og i ni menneskelige mage kreft cellelinjer [38]. Innføring av en Smad3 vektor inn i gastriske cellelinjer gjenopprettet TGF-β reaksjonsevne. Videre er injeksjon av Smad3-uttrykkende gastriske celler i nakne mus viste en forsinket tumordannelse sammenlignet med kontroller, noe som indikerer en korrelasjon av tap av Smad3 med karsinogenese [38]. I denne studien fant vi ikke en signifikant sammenheng mellom P-Smad3C farging i mage kreftceller og kreft invasjon, differensiering og scene. Til forskjell fra P-Smad2C, som kun uttrykkes i kjernen av celler, er P-Smad3C positiv farging påvises i kjernen, ved membranen og i cytoplasma av magekreftceller. Den biologiske relevansen av ulike mønstre av P-Smad3C flekker i kreftceller er i dag fortsatt ukjent.
EMT av kreftceller er en forutsetning for videre til avanserte metastatiske svulster [11]. Det har vært kjent at TGF-β er en stor aktør i EMT. Smad3, men ikke Smad2, er en viktig mediator i TGF-β avhengig EMT [39]. For eksempel, svikter TGF-β å indusere EMT i grunnskolen tubulære epitelceller avledet fra nyrene av Smad3-manglende mus [40]. Hemming av TGF-β signalering av Ki26894, en TGF-βRI inhibitor, redusert invasjon og EMT av scirrhous magekreft
in vitro product: [41]. Våre resultater viser at en del av magekreftceller uttrykker EMT markører, f.eks Snail, kollagen I og α-SMA. Ko-lokalisering av P-Smad3C med α-SMA /collagen I er funnet i en betydelig undergruppe av pasienter. I tillegg har α-SMA-positiv farging i kreftceller en mulig korrelasjon med P-Smad3C IHC score på kreftcellene, men ikke rundt ikkekreft-vev. Disse resultatene indikerer at P-Smad3C kan spille en rolle i EMT av magekreft.
I Summary, antyder studien at Smad2 er en viktig mediator for å forsvare mage celler fra å komme videre mot dårlig differensiert kreft. Ifølge våre resultater, er Smad3 ikke direkte knyttet til karakteristikker av magekreft, men våre data tydet på at det kan spille en rolle i kreft assosiert fibroblaster og EMT av mage kreftceller.
Metoder
pasienter
Kirurgiske prøver ble undersøkt fra pasienter med primær magekreft ved Institutt for generell kirurgi, First Affiliated Hospital, Medical School, Zhejiang University, Kina fra 2003 til 2009. gastric vevsprøve ble samlet når operasjoner dissekert Gastric kreft. De oppsamlede vev inkludert tumor og omkringliggende ikke-tumorområder (vev i alle fall mer enn 5 cm langt borte fra tumor). En del av vev ble løst med i 4% formaldehyd og dyppet i parafin for histologi og IHC måling. Forble friske vev ble satt inn i flytende nitrogen umiddelbart for mRNA-måling. Totalt 130 sammenkoblede mage vev, inkludert kreft og omkringliggende ikke-tumorvev ble registrert. Patologisk diagnose og klassifikasjoner ble estimert i henhold til svulsten-node-metastaser (TNM) klassifisering forfektes av International Union mot Kreft (syvende utgave) [42]. Grunnleggende kjennetegn ved de inkluderte pasientene er vist i tabell 4. studieprotokoll dannet de etiske retningslinjene i Helsinkideklarasjonen (1975). Studien ble godkjent av etisk komité av First Affiliated Hospital, Medical School, Zhejiang University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne i studien.
Antistoffer
Rabbit polyklonale antistoffer mot P-Smad2C (Ser 465/467), P-Smad3C (ser 423 /425), ble P-Smad2L (ser 250/255), og P-Smad3L (ser 208/213) som er beskrevet i tidligere studier [43], [44]. Mus anti-human α-SMA (M0851), polyklonale anti-SNAIL (ab-17732), og monoklonale anti-kollagen I (C2456) antistoffer ble innkjøpt fra henholdsvis DAKO, Abcam og Sigma.
Immunohistochemistry (IHC )
etter gjennomgang av H E-fargede objektglass fra 130 inkluderte pasienter med magekreft, representative parafinblokker for hver pasient ble valgt for seksjonen. Glassene ble deparaffinised i xylen og rehydrert i en fortynningsserie av gradert etanol for å destillert vann. Antigen gjenfinning ble utført ved mikrobølgebehandlingen i EDTA-buffer (1 mmol, pH 8,0). Glassene ble deretter behandlet med 3% H
2o
2 i 30 min ved romtemperatur. Etter vasking med PBS tre ganger, ble platene inkubert med kanin-polyklonalt antistoff mot P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (01:50 ), og α-SMA (1:200) henholdsvis ved 4 ° C over natten. Den neste dag, objektglassene ble vasket med PBS tre ganger. Etter vasking, ble de inkubert med seg peroksidase (Dako) -merket anti-kanin eller anti-mus-antistoff i 1 time ved romtemperatur. Peroksidase-aktivitet ble påvist med diaminobenzidin (DAB). Skinnene ble kontra med hematoksylin. Immunoreaktivitets ble visualisert under lysmikroskopi
For semikvantitativ analyse, ble de fargede vevssnitt vurdert til en 4-punkts skala som følger: positive celletall, karakterer 0-3 (0, ingen positive celler, 1, 25% positive celler, 2, 25% -50% positive celler, 3, 50% positive celler); intensiteten av positiv farging, karakterene 1-3 (1, svak positiv farging, vanligvis gul, 2, sterk positiv farging, vanligvis brun, 3, veldig sterk positiv farging, vanligvis dyp brun til svart). Den endelige immunfarging Poengsummen ble beregnet som antall × intensitet.
immunfluorescens farging
Glassene ble deparaffinised i xylen og rehydrert i gradert etanol til destillert vann. Deretter antigen gjenfinning ble utført ved mikrobølgebehandlingen i EDTA-buffer (1 mmol, pH 8,0). Glassene ble deretter behandlet med 3% H
2o
2 i 30 min ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, både primære antistoffer, kanin-anti-P-Smad3C /sneglen og mus anti-α-SMA /collagen I, ble påført ved 4 ° C over natten. Deretter, sekundære antistoffer, Alexa633-kanin anti-mus immunglobulin G og Alexa488-esel anti-kanin-immunoglobulin G (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland), ble påført i 30 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble montert ved hjelp av Dako-Cytomation Fluorescent Mounting Medium. Skinnene ble inspisert og bildene ble tatt på en konfokal mikroskop (Leica, Heidelberg). Seksjoner uten primære antistoffer ble brukt som negative kontroller.
Real time PCR
Den totale RNA ble renset fra mage vev med høy Pure RNA isolering kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll, og konsentrasjonen ble målt spektrofotometrisk. cDNA ble syntetisert fra 1 ug av RNA med Transcriptor First Strand cDNA syntese-sett (Roche Diagnostics). Kvantitativ real-time PCR ble utført med en ABIPrism 7700 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems) ved hjelp av en TaqMan universell PCR Master Mix Ingen AmpErase UNG (del nr. 4324018). Følgende genekspresjon analysene ble brukt: Smad2 (forover: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; omvendt: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (forover: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; omvendt: GAAGGCGAACTCACACAGC) og peptidylprolyl isomerase A (husholdningsgenet, del nr Mm02342429_g1..). Alle reagenser ble kjøpt fra Applied Biosystems. Prøvene ble kjørt i triplikat under de følgende betingelser: innledende denaturering i 2 minutter ved 50 ° C og i 10 minutter ved 95 ° C etterfulgt av 40 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C og 1 minutt ved 60 ° C. Nivåene av genekspresjon i hver prøve ble bestemt med komparative syklus terskelen metode.
Statistical Analysis
Å vurdere sammenhengen mellom utvalgte immunohistologiske markører og kreft parametere, ble utført Kendall-tau rank korrelasjonsanalyse bruker SAS versjon 9.2 (Cary, NC, USA). En
p
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
