Abstract
Cisplatin har vært den mest aksepterte legemiddelet for behandling av eggstokkreft i nesten 40 år. Selv om de fleste pasienter med eggstokkreft reagerer på frontlinjen platina kjemoterapi, vil mange pasienter utvikler cisplatin-motstand sykdom, som er ekstremt rask og dødelig. Selv om ulike mekanismer for cisplatin motstand har vært postulert, har nøkkelmolekyler involvert i slik motstand ikke blitt identifisert. Mirnas er endogent uttrykt små ikke-kodende RNA, som er evolusjonært konservert og funksjon som post-transcriptional regulatorer av genuttrykk. Feilregulering av miRNAs har vært assosiert med kreft initiering, progresjon og resistens. De onkogene miRNA-21, en av de mest studerte mirnas, er oppregulert i nesten alle kreft hos mennesker. Imidlertid har reguleringen av MIR-21 i cisplatin resistente eggstokkreft celler ikke blitt vurdert. I denne studien målte vi MIR-21 uttrykk ved real-time PCR og funnet oppregulering av MIR-21 i cisplatin motstandsdyktig mot cisplatin sensitive eggstokkreft celler. Kromatin immunoutfellingsstudier demonstrerte foreningen av c-Jun transkripsjonsfaktor til pri-mir-21 DNA promoter regioner. Blokkering av JNK-en, den store aktivator av c-Jun fosforylering, redusert uttrykk for pre-mir-21 og økt uttrykk for sin velkjente target genet, PDCD4. Overekspresjon av MIR-21 i cisplatin sensitive celler redusert PDCD4 nivåer og økt celledeling. Til slutt, målretting MIR-21 redusert cellevekst, spredning og invasjonen av cisplatin resistent eggstokkreft celler. Disse resultater antyder at JNK-1 /c-Jun /MIR-21 reaksjonsveien bidrar til cisplatin motstanden av eggstokkreft celler og viste at MIR-21 er et sannsynlig mål å overvinne motstanden cisplatin
Citation:. Echevarría -Vargas IM, Valiyeva F, Vivas-Mejía PE (2014) oppregulering av MIR-21 i Cisplatin Resistant Eggstokkreft via JNK-en /c-Jun Pathway. PLoS ONE 9 (5): e97094. doi: 10,1371 /journal.pone.0097094
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 02.01.2014; Godkjent: 14 april 2014; Publisert: May 27, 2014
Copyright: © 2014 Echevarría-Vargas et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet delvis av NIH /NCI (1K22CA166226-01A1) til PEVM, institusjonelle såkornfond fra University of Puerto Rico Comprehensive Cancer Center (PEVM), National Institute of Health, og minoritets Biomedical Research Support (MBRs) RISE Grant Number R25- GM061838 (IEV). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OvCa) står for nær 3% av alle krefttilfeller i den vestlige verden [1]. Typisk behandling for kvinner med OvCa er cytoreduksjon etterfulgt av kjemoterapi [2]. Til tross for høy første svarprosenten til cisplatin-baserte forbindelser som førstelinje kjemoterapi, mest på eggstokkene karsinomer tilbakefall [2], [3]. Antatte mekanismer for cisplatin motstand inkluderer redusert intracellulær akkumulering av cisplatin, økte intracellulære nivåer av visse svovelholdige makromolekyler, og økt DNA-reparasjon [4]. Bevis tyder på at inaktivering av indre celledødsveier, aktivering av celleoverlevelsesreaksjonsveier, og feilregulering av onkogener, tumorsuppressorgener, og microRNAs, bidra til cisplatin motstanden av eggstokkreft celler [3], [5], [6]. Men den eksakte mekanismen som eggstokkreft celler blir resistente mot cisplatin behandling er i dag ukjent.
microRNAs (mirnas) er naturlig forekommende små (21-22 basepar) ikke-kodende RNA, som anerkjenner hovedsakelig tre «-UTR region av budbringer RNA (mRNA) og hemmer proteinsyntese [7]. Nye rapporter viser at feilregulering av miRNAs, og deres mål gener, fremme kreft initiering, progresjon og resistens [6], [8], [9]. Av disse grunner har mirnas blitt foreslått som et diagnostisk, prognostisk og mål for kreftterapi [10]. En av de beste studiene mirnas er MIR-21 som er overuttrykt i de fleste kreftformer og viser onkogene aktivitet [11]. I HER2 (+) bryst kreft overekspresjon av MIR-21 dratt resistens mot trastuzumab behandling [12]. . Nam et al, fant MIR-21, MIR-203, og MIR-205 som overexpressed i serøs ovarialcancer versus normal eggstokkvev; MIR-21 å være til stede i 85% av eksemplene [13]. Xie et al. observert at i A2780 humane eggstokkreft celler, MIR-21 modulerer den hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α), og motstanden av paclitaxel [14]. MiR-21 utøver sin biologiske rolle ved å målrette viktige gener som kontrollerer cellevekst og spredning. Imidlertid, i faste tumorer, inkludert eggstokk-kreft, tumor suppressor-gen programmert celledød 4 (PDCD4) synes å være en av de viktigste funksjonelle MIR-21 målene [15], [16], [17]. Den sentrale rolle PDCD4 i eggstokkreft er videre støttet av observasjoner som lavere nivåer av denne tumor suppressor korrelerer direkte med dårlig prognose for eggstokkreft pasienter [15]. Mer nylig har Chan et al. viste at MIR-21 er overuttrykt i cisplatin sensitiv sammenlignet med cisplatin resistente celler, og at MIR-21 hemming indusert apoptose og øker PDCD4 nivåer [18].
oppstrøms molekylære hendelser som står for Mir-21 overekspresjon i eggstokkreft celler trenger videre studier. Rapporter tyder på at pri-mir-21 DNA promoter regioner inneholde anerkjennelse elementer for c-Jun og STAT3 transkripsjonsfaktorer [19]. I tykktarm kreft celler, curcumin redusert MIR-21 via AP-1 (transkripsjonsfaktor kompleks sammensatt av c-Jun og c-Fos, hovedsakelig) regulering, og i menneske promyelocytic cellelinje, HL-60, forbol 12-myristat 13- acetat (PMA) indusert MIR-21 uttrykk ved AP-en aktiverings [17], [20]. MiR-21 oppregulering av AP-1 ble også observert i visse kjemoresistent side populasjoner av kreftstamceller [21].
Fordi anerkjent rolle MIR-21 i kreft initiering, progresjon og narkotika motstand, vi undersøkt regulering av MIR-21 i cisplatin resistent eggstokkreft celler. Vi brukte sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR) og fant at cisplatin-resistente eggstokkreft celler uttrykker høyere MIR-21 nivåer sammenlignet med cisplatin følsomme celler. Vi analyserte mulig mekanisme av MIR-21 oppregulering. Behandling av celler med SP600125, en inhibitor av c-Jun-fosforylering, redusert pre-mir-21-ekspresjon i cisplatin-resistente eggstokkreft celler. Chromatin immunoprecipitation (chip) studier viste høyere c-Jun fosforylering (p-c-Jun) protein nivåer bundet til pri-mir-21 DNA promoter-regionen i cisplatin motstandsdyktig mot cisplatin sensitive eggstokkreft celler. Overekspresjon av MIR-21 i cisplatin sensitive celler, økt celledeling, og reduserte PDCD4 protein nivåer. Motsatt, MIR-21 oligonukleotid inhibitor (antagomir), betydelig hemmet cellevekst, spredning og invasjonen evne A2780CP20 celler. Disse dataene viser at oppregulering av JNK-en /c-Jun sti fører til avvikende økende av MIR-21, og foreslår å MIR-21 som et potensielt mål å overvinne cisplatin motstand av eggstokkreft celler.
materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Cisplatin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) og rekonstruert i 0,9% NaCl. SP600125 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble rekonstituert i 100% DMSO opptil endelig konsentrasjon på 10 mM. Da lagt til cellene, den endelige konsentrasjonen av DMSO på kulturmediet var mindre enn 0,1%.
Cells og kulturforhold
Den menneskelige eggstokkene epiteliale kreftceller SKOV3ip1, HEYA8 og A2780CP20 celler er blitt beskrevet andre steder [22], [23], [24], [25], [26]. A2780 og A2780CIS celler ble kjøpt fra europeiske Innsamling av cellekulturer (ECACC). Cellene ble formert
in vitro
i RPMI-1640 medium (Thermo Scientific, Logan, UT, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Thermo Scientific) og 0,1% antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Thermo Scientific) og holdt ved 37 ° C i 5% CO
2/95% luft. Alle kreftcellelinjer ble screenet ved hjelp av mykoplasma fjerning middel som beskrevet av produsenten (ABD Sertotec, NC, USA).
In vitro
analysene ble utført ved 70-85% celletetthet. A2780CP20 celler (5 × 10
5 celler /oppvask) ble behandlet med 10 mikromol /l SP600125 i åtte timer. Cisplatin konsentrasjoner hemmer 50% av cellevekst (IC
50) ble beregnet etter 72-timers stoffet ruge (cisplatin doser: 100, 10, 1, 0,1 og 0,01 mikrometer, sluttkonsentrasjoner). Cellevekst ble målt med Alamar blått fargestoff som tidligere beskrevet [27].
Microarray analyse av genuttrykk
Total RNA ble isolert fra A2780 og A2780CP20 eggstokkreft cellelinjer med GenElute pattedyr Total RNA Purification Kit (Sigma-Aldrich). RNA-konsentrasjonen ble lest i en Nanodrop. RNA kvalitet ble bekreftet i en Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Ett hundre nanogram av total RNA ble benyttet for å cDNA-syntese. Komplementær cDNA ble syntetisert, merket, fragmentert og hybridisert til Affymetrix Genechip Gene 1,0 ST Menneskelig Array. Etter 16 timer inkubasjon ved 45 ° C, ble arrays vasket, farget og skannet (Affymetrix Modell 3000 skanner), og data ble analysert ved hjelp av Partek Genomics Passer (Partek, St. Louis, MO). Forsøk ble utført i duplikat. To-veis ANOVA ble brukt til å bestemme forskjeller i genekspresjon (p 0,05 ganger endring 2). 1359 prober (4%) sett viste ± 2 ganger endring mellom A2780CP20 og A2780 celler. Ekstra filtrering (± 3 ganger endring, og p 0,003) viste 321 sonder (0,96%) endret mellom A2780CP20 og A2780 celler
RNA isolasjon og cDNA syntese
Total RNA (inkludert miRNAs. ) ble isolert ved hjelp av
mir
Vana miRNA isolasjon kit fra Ambion (Livet Technology, Grand Island, New York). RNA ble omdannet til cDNA med Enhanced Avian RT første tråd syntese kit fra Sigma-Aldrich. I korte trekk, total-RNA (1 pg), 500 uM dNTP og 3,5 uM oligo (dT)
23 ble blandet og vann ble tilsatt inntil 10 ul samlet volum. Prøvene ble blandet, sentrifugert og oppvarmet ved 70 ° C i 10 min. Denne blandingen ble blandet med 1 pl forbedrede avian RT, 2 pl 10X buffer, 1 pl RNase-inhibitor, og vann opp til 20 ul sluttvolum. Prøvene ble inkubert ved 25 ° C i 15 min etter ved 45 ° C i 50 minutter. cDNA syntese å oppdage modne miRNAs ble utført med All-in-One miRNA QRT-PCR deteksjon kit (GeneCopoeia, Rockville, MD). I korte trekk, cDNA-synteseblanding inneholdt 1 pg av total RNA, 1 ul poly (A) Polymerase, 1 ul RTase blanding, 5 pl 5X PAP /RT buffer og vann opp til 25 ul sluttvolum. Den hedre transkripsjon Reaksjonen ble inkubert ved 37 ° C i 60 min, og 85 ° C i 5 minutter i en Veriti termosykler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA).
Polymerase Chain Reaction (PCR) og SYBR- i-basert real-time PCR
PCR ble utført i en Verity 96 brønner termosykler (Applied Biosystems). I korte trekk, 12,5 ul Jumpstart REDTaq READYMIX 1X (Sigma), 0,5 ul fremover, og 0,5 pl revers primere (0,4 pM sluttkonsentrasjon av hver), 2 pl av cDNA-produktet, og vann opp til 50 ul sluttvolum. Syklusbetingelsene var en syklus ved 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder (denaturering), 60 ° C i 30 sek (annealing), og 72 ° C i 30 sek (forlengelse). En endelig forlengelse trinn ble utført ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter ble separert ved elektroforese i 1% agarosegel. Bilder ble oppnådd (etter gel farging med etidiumbromid) i en FluorChem 8900 (Alpha Innotech). SYBR-I-real time PCR for å vurdere de modne MIR-21 nivåer ble utført med All-in-One miRNA QRT-PCR deteksjon kit (GeneCopoeia) i en StepOne pluss real-time PCR termisk syklus system (Applied Biosystems). PCR reaksjoner blanding inneholdt 10 ul 2X All-in-One qPCR Mix, 2 ul All-in-One miRNA qPCR primer, 2 mL universell adapter PCR-primer, 2 mL første cDNA, og 4 pl vann. Spesifikke primere for MIR-21 og U6 (intern standard) ble anvendt (GeneCopoeia). Sykkel betingelser: en syklus på 15 minutter ved 95 ° C, og 40 sykluser med 15 sek ved 94 ° C, 30 sek ved 60 ° C og 30 sek ved 72 ° C [28]. Smeltekurve analyse ble alltid utført ved slutten av PCR-reaksjonen. Relativ MIR-21 ekspresjon ble beregnet med den ΔΔCt-metoden [29], [30], [31].
Western blot-analyse
Celler ble oppsamlet og vasket to ganger med fosfatbuffer saltoppløsning ( PBS), høstet og lagret ved -80 ° C inntil behandling. For cytosolisk og kjerneutvinning, ble cellene resuspendert i cytoplasmiske buffer (0,5% Nonidet P-40, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, pH 7,9, og 1X protease-inhibitor) i 15 minutter på is og sentrifugert ved 14000 rpm ved 4 ° C [32]. Supernatantene (som inneholdt den cytoplasmiske fraksjon) ble oppsamlet. De gjenværende pelletene ble vasket to ganger med det cytoplasmatiske buffer følgende ved tilsetning av kjernebuffer (400 mM NaCl, 20 mM Hepes, pH 7,9 og 1X protease-inhibitor). Prøvene ble inkubert i 15 minutter på is, sentrifugert i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten (inneholdende kjernefysiske proteinfraksjoner) ble oppsamlet. For total proteiner ekstraksjon, ble celler lysert med lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 1% Triton-X, 0,4 mM NaF, 0,4 mM NAVO
4, 25 mM Tris-HCl, pH 7,6 og 1X protease-inhibitor) i 45 min på is, sentrifugert i 10 minutter ved 4 ° C og supernatantene ble samlet. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Reagenser (Bio-Rad, Hercules, CA). Protein Lysatene (50 ug) ble separert ved SDS-PAGE, blottet på membraner, og probet med den passende fortynning av hvert primært antistoff. Membranene ble vasket og inkubert med det passende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff, skyllet igjen, og de bundne antistoffer ble påvist ved anvendelse av forsterket kjemiluminescens (GE Healthcare, Piscataway, NJ) etter ved autoradiografi i en FluorChem 8900 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA). Primære antistoffer: anti-fosfor-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), anti-SAPK /JNK, anti-fosfor-c-Jun (Ser73), anti-c-Jun, anti-fosfor-ERK (Thr202 /Tyr204 ), anti-ERK kinase, anti-STAT3, anti-histon H3 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PDCD4 (Rockland, Gilberts, PA) og anti-β-aktin (Sigma-Aldrich). Sekundære antistoffer som ble brukt var anti mus og anti kanin IgG pepperrot (HRP) -bundne, anti kanin (Cell Signaling).
Chromatin immunoprecipitation (chip)
A2780CP20 og A2780 celler ble samlet og tverrbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Celler ble lysert i natriumdodecylsulfat (SDS) lyseringsbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,1 og protease og fosfatase-inhibitorer). Prøvene ble lydbehandlet (4 ° C) ved anvendelse av en Branson 250 sonikator med 10 fortsettelse pulser av 10 sekunder (sek) hver. De ultralydLysaTene ble pre-klarert med protein A eller G magnet perler over natten ved 4 ° C. Lysates ble immunoutfelt med 5 eller 10 mikrogram av antistoff /magnet perler mot pc-Jun, Pol-II (Santa Cruz), c-Jun (BD Transduksjon laboratorium, Franklin Lakes, New Jersey, USA) eller IgG (Abcam, Cambridge, MA , USA) over natten ved 4 ° C. Prøvene ble vasket fem ganger i 5 minutter hver ved 4 ° C med vaskebuffer (RIPA) (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 0,7% deoksykolsyre, 1 mM EDTA, og 1X protease og 1X fosfatase-hemmere). Prøvene ble vasket én gang med 1 x TE-buffer og eluert med SDS elueringsbuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,1, og 1X 1X protease og fosfatase-inhibitorer). Etter eluering ble prøver ble revers tverrbundet ved 65 ° C i 4 timer, behandlet med RNase A (0,2 ug /ml) ved 37 ° C i 2 timer, blandet med CaCl
2 (300 mM CaCl
2 i 10 mM Tris pH 8,0) og Proteinase K (0,2 mg /ml) ved 37 ° C over natten. Den immunopresipitert DNA ble isolert ved anvendelse av QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). DNA ble kvantifisert ved SYBR-en-basert real-time PCR ved hjelp av en StepOne Plus Thermocycler (Applied Biosystems). I korte trekk, PCR-reaksjonsblandingen inneholdt 10 ul SYBR-grønn, 0,5 ul forover primer 0,5 pl revers primer (0,25 nM sluttkonsentrasjon), 2 pl av prøve DNA og 7 mL av nuklease fritt vann. Sykkel betingelser: en syklus på 10 minutter ved 95 ° C, og 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 60 ° C og 30 sek ved 72 ° C
Forbigående og stabile transfeksjoner
Ektopisk MIR-21 uttrykk ble utført i A2780 celler. I korthet, A2780 (2 x 10
4 celler /ml) celler ble sådd ut i seks-brønners plater. For hver brønn, 1 pg pCMV-MIR21 eller en mikrogram tom vektor (pCMV-EV) (begge fra OriGene Technologies, Inc. i Rockville, Maryland) og en pi MegaTran 1,0 transfeksjon reagens (Origen) ble fortynnet i 98 ul Opti-MEM I (Life Technologies). pCMV vektor inneholder en grønn fluorescens protein (GFP) kassett. Blandingen ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur og tilsatt til cellene. Tjuefire timer senere ble mediet erstattet med friskt RPMI-1640 (10% FBS, 0,1% antibiotisk /antimykotisk oppløsning og 500 pg /ml G418-disulfat saltoppløsning). Etter 2-3 uker, selvstendige kolonier ble plukket og dyrket separat som uavhengige kloner. Transfeksjonseffektiviteten ble overvåket ved immunfluorescens som følger: A2780 kloner ble utsådd på objektglass over natten. Deretter ble cellene fiksert med 4% para-formaldehyd, blokkert med 0,3% H
2o
2 i metanol i 10 min og 10% FBS i 20 minutter. Celler ble inkubert med anti-GFP-antistoff (fortynning 1:250) eller DAPI (fortynning 1:5000 fra Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, Texas, USA) over natten. Neste dag, lysbilder ble vasket, og det sekundære antistoffet anti-kanin (fortynning 1:5000) ble tilsatt. Dekkglass ble plassert på objektglass og fast med vandig-montering medium (Abcam). Celler ble visualisert og fotografert i et Olympus 1X71 invertert mikroskop (Center Valley, PA). For å hindre MIR-21, vi forbigående transfektere A2780CP20 celler med en MIR-21 oligonukleotid (Livet Technology, Grand Island, NY, USA) og en negativ oligonukleotid inhibitor som en kontroll (Livet Technology). Mirna hemmere ble alltid blandet med HiPerfect transfeksjon reagens (Qiagen, Valencia, CA, USA), og Opti-MEM I vekstmedium (Life Technologies).
Små forstyrrelser RNA (siRNA) transfeksjon
til taushet human c-jun (NM_002228) to sirnas rettet mot sekvensene: 5′-CCTTCTATGACGATGCCCT-3 «, og 5′-GATGGAAACGACCTTCTAT-3» ble brukt (Sigma-Aldrich). En ikke-tie siRNA (NC-siRNA) ble anvendt som den negative kontroll (Sigma-Aldrich). I korte trekk, A2780CP20 (2,25 × 10
5 celler) ble sådd i petriskåler. Tjuefire timer senere ble 200 nM av siRNA (sluttkonsentrasjon) blandet med HiPerfect transfeksjon reagens (Qiagen) ved 01:02 forhold (siRNA: transfeksjon reagens) i Opti-MEM I-vekstmedium. Blandingen ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur og tilsatt til cellene. Celler ble samlet etter 24 timer og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk.
Cell vekst og spredning
A2780CP20 (2 × 10
4 celle /ml) ble sådd i seks godt plater. Tjuefire timer senere en transfeksjon reaksjonsblanding inneholdende MIR-21-inhibitor (Liv Technology) (50 nM sluttkonsentrasjon) og HiPerfect transfeksjon reagens (Qiagen) i et 01:04 forhold, ble tilsatt til cellene. Seks timer senere ble det dyrkede mediet fjernet og erstattet med RPMI-1640 medium (10% FBS). For å vurdere celleviabilitet, syttito timer etter transfeksjon, ble levende celler oppsamlet og tellet i nærvær av 0,5% trypanblått ved hjelp av en Countess automatisert celleteller (Invitrogen, Grand Island, NY). Celleproliferasjon ble vurdert med en koloni formasjon analysen. I korthet åtte timer etter transfeksjon, ble 1000 celler sådd ut i 10 cm-petriskåler. Ti dager senere, ble kolonier farget med 0,5% krystallfiolett i metanol, og telles ved hjelp av mikroskop Nikon Eclipse TS100.
In vitro-assay invasjon
-celler (2,5 x 10
4 celler /ml) ble sådd ut i en petriskål. Tjuefire timer senere en transfeksjon reaksjonsblanding inneholdende MIR-21-inhibitor (Liv Technology) (50 nM sluttkonsentrasjon) og HiPerfect transfeksjon reagens (Qiagen) i et 01:02 forhold, ble tilsatt til cellene. Den neste dag, ble 600 ul av fortynnet matrigel (serumfritt RPMI-medium) puttet inn i øvre kammer i 6-brønners plater Transwell (Corning Incorporated, Lowell, MA). Kammeret ble inkubert ved 37 ° C i minst 4 til 5 timer for gelering. MiR-21-inhibitor-transfekterte celler ble samlet og resuspendert i serumfritt RPMI-1640-medium ved en tetthet på 1,5 x 10
5 celler /ml. Matrigel ble forsiktig vasket med oppvarmet serumfritt RPMI-1640-medium, og 1,0 ml av cellesuspensjonen ble puttet på matrigel. Det nedre kammer i transwell ble fylt med 1,0 ml RPMI-1640 medium (10% FBS), og platen ble inkubert ved 37 ° C i 48- timer. De transwells ble fjernet fra seks-brønns plater og farget med protokollen HEMA 3 Stain sett (Fisher Scientific Company, Kalamazoo, MI). De ikke-invaderte celler ble skrapet av på toppen av transwell med en bomullspinne. Antallet invaderte celler ble tellet i fire mikroskopfelt (10x) pr tilstand. Prosentandelen av invasjon ble beregnet i forhold til antall invaderte celler i kontroll miRNA inhibitor brønnen, som ble tatt som 100%.
Statistisk analyse
t-test ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism versjon 5.04 for Windows, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer og p-verdi 0,05 for en tosidig test ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk av MIR-21 og MIR-21-relaterte molekyler. eggstokkreft celler
i en foreløpig microarray analyse utført i vårt laboratorium, identifiserte vi 320 gener forskjellig uttrykt (endring 3 og p-verdi 3 × 10
-4) i A2780CP20 (cisplatin resistent)
vs.
A2780 (cisplatin sensitive) celler (tabell S1). Den microarray data ble avsatt i Gene Expression Omnibus (GEO): tiltredelse: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE51683. Mens MIR-21 og c-Jun ble oppregulert, ble PDCD4 nedregulert i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler (tabell S1). RT-PCR eksperimenter bekreftet den microarray data (figur 1A). MiR-21 genet er plassert i intron 10 av den TMEM-49-genet [17]. De messenger RNA (mRNA) nivåer av TMEM-49 og β-aktin var ikke annerledes i A2780CP20 og A2780 celler (figur 1A), som underbygge tidligere funn at pre-mir-21 og TMEM-49 er uavhengig regulert [33]. Figur 1B viser at Mir-21 nivåer korrelerer med følsomheten av eggstokkreft celler til cisplatin behandling (IC
50, figur 1B). Western blot-analyse (figur 1C) viste at de totale c-Jun og p-c-Jun proteinnivåer var høyere i A2780CP20 forhold til A2780-celler. Men PDCD4 protein nivåer viste motsatte resultater (figur 1C). I andre cellelinjer, Signal Svinger og Activator av transkripsjon 3 (STAT3) regulerer MIR-21 uttrykk [17]. Men Stat3 protein nivåer var lik i A2780CP20 og A2780 celler (figur S1), som utelukker muligheten for at STAT3 konto for de høyere MIR-21 nivåer i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler. Disse resultatene tyder på at c-Jun er ansvarlig for MIR-21 uttrykk nivåer i cisplatin resistente eggstokkreft celler.
(A) Validering av mikromatriser ved RT-PCR. (B) MiR-21 nivåer i et panel av eggstokkreft celler. MiR-21 nivåer ble uttrykt i forhold til A2780 cellene MIR-21 nivåer. IC50s ble beregnet etter 72-timers behandling av celler med ulike konsentrasjoner av cisplatin som beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. (C) Evaluering av c-Jun og p-c-Jun protein uttrykk i A2780 og A2780CP20 celler. (D) Protein uttrykk analyse av MAPK totalt og kjernefysiske fraksjoner av A2780 og A2780CP20 celler. Ekspresjonsnivået i figurene A, C og D er uten cisplatin behandling. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontroll. Kolonner representerer hjelp av triplicates ± SEM
Det er vel kjent at den store aktivator av c-Jun er JNK-1 [34]. Dermed har vi vurdert de protein nivåer av JNK i A2780 og A27870CP20 celler. Den totale JNK-1 og JNK-nukleære p-1protein nivåene var høyere i A2780CP20 forhold til A2780-celler. Protein nivåer av p-JNK-2/3 og total JNK-2/3, de to andre JNK-1 isoformer, var like i begge cellelinjer (figur 1D), noe som tyder på at JNK-en /c-Jun kaskade regulere MIR-21 i A2780CP20 celler. Bevis tyder på at det ekstracellulære signal regulerte kinasen, ERK kan aktivere c-Jun [35], [36]. Selv om den totale ERK protein nivåer var like i begge cellelinjer, de p-ERK protein nivåene var lavere i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler utelukket muligheten for at aktivert ERK-konto for de høyere MIR-21 nivåer i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler.
Effekt av JNK-en /c-Jun hemming i MIR-21 og PDCD4 uttrykk
for å kunne fastslå om JNK-1 regulerer c-Jun og MIR-21 uttrykk i cisplatin resistente celler, vi behandlet A2780CP20 celler med SP600125, en velkjent kjemisk hemmer av c-Jun fosforylering av JNK-1 [34]. Inkubering av celler med A2780CP20 SP600125 reduserte p-c-Jun nivåer, som forventet (figur 2A). Det ble ikke observert signifikante endringer i protein nivåer av c-Jun, totalt og p-JNK-en eller total og p-JNK-2/3 etter behandling av A2780CP20 celler med SP600125 inhibitor (Figur 2A). Real-time PCR viste en signifikant reduksjon (60% og * p 0,05) i pre-mir-21 nivåer etter behandling av A2780CP20 celler med SP600125 (figur 2B). Den samme inhibitor forårsaket en økning i PDCD4 proteinnivåene som observert i Western blot av figur 2C. Videre hemming av MIR-21 med en MIR-21 spesifikke oligonukleotid-hemmer (antagomiR) økte PDCD4 protein nivåer (figur 2D), som bekreftet tidligere resultater som MIR-21 regulerer PDCD4 i eggstokkreft celler [37], [18]. Videre transient transfeksjon av A2780CP20 celler med en siRNA mot c-Jun signifikant (** p 0,01) hemmet pre-MIR-21 uttrykk (figur 2E). Western blot analyse viste at behandling av cisplatin sensitive A2780 celler med SP600125 ikke påvirke nivåene av p-JNK-1, JNK-1, p-JNK-2/3, JNK2 /3, c-Jun, pre-speil 21 eller PDCD4 (figur S2). Disse resultater antyder at JNK-1 /c-Jun vei fører til MIR-21 overekspresjon på cisplatin-resistente eggstokkreft celler.
A2780CP20-celler ble behandlet med 10 uM SP600125. (A) Western blot vist inhibering av p-c-Jun etter behandling med SP600125 i A2780CP20 celler sammenlignet med kontroll (DMSO). (B) SYBR-I-baserte real-time PCR ble utført for å beregne den relative pre-mir-21 ekspresjon i A2780CP20 celler etter behandling med SP600125 inhibitor. (C) Western blot og densitometrisk analyse av PDCD4 protein ekspresjonsnivåer etter behandling av celler med A2780CP20 SP600125. (D) PDCD4 protein uttrykk nivåer etter transfeksjon av A2780CP20 med MIR-21 oligonukleotid-hemmer. (E) A2780 CP20 celler ble transient transfektert med to c-Jun-målrettede sirnas som beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. Western blot analyser viser at både c-Jun-sirnas reduserte C-Jun nivåer. SYBR-I-basert real-time PCR ble utført (se «Materialer og metoder» -delen) for å beregne de relative pre-mir-21 uttrykk nivåer i A2780CP20 celler etter siRNA-mediert c-Jun stanse. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontroll. Kolonner representerer hjelp av triplicates ± SEM
Analyse av c-Jun binding til Mir-21 DNA-promoter regioner
For å definitivt vise at c-Jun er ansvarlig for den høyere MIR -21 nivåer i A2780CP20 sammenlignet med A2780 celler, vurdert vi pri-mir-21 promoter DNA-områder forbundet med pc-Jun av Chip analyse. Mengden av DNA-immunopresipitert med p-c-Jun-antistoff i begge cellelinjene ble amplifisert med et par primere omfattet de c-Jun gjenkjenningselementer i pri-mir-21 promoter-regionen (figur S3 og Tabell S2). Andre par av primere forsterke en DNA-region langt fra de c-Jun-gjenkjenningsseter ble anvendt som en kontroll (tabell S2). Mer enn fem ganger med DNA-nivåer ble trekke ut i A2780CP20 enn i A2780 celler etter immunoutfelling med p-c-Jun-antistoff (figur 3A). Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i DNA mengder etter immunoprecipitation med c-Jun, foru- II eller IgG antistoffer (figur 3A) som viste at pc-Jun binder spesifikt til pri-mir-21 promoter regioner, og at flere pc-Jun protein nivåer er høyere i A2780CP20 enn i A2780 celler. Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i DNA-nivåene når PCR ble utført med de ikke-promoter DNA-primere etter immunoprecipitation med pc-Jun antistoff (Figur 3B).
ChIP analysen ble utført som beskrevet i «Materials og metoder «-delen. (A) SYBR-I-baserte real-time PCR-amplifisering av det området som inneholder det c-Jun gjenkjenningssekvensen i den pri-MIR-21 DNA. De fosfor-c-Jun nivåer bundet til pri-MIR-21 promoter var høyere i A2780CP20 celler sammenlignet med A2780 celler. (B) SYBR-I-baserte real-time PCR amplifikasjon av en DNA-region langt fra den ferdig mir-21-promoteren ble utført som en kontroll. * P 0,05 sammenlignet med kontroll. Kolonner representerer hjelp av triplicates ± SEM
Effekt av MIR-21 overekspresjon i følsomheten av eggstokkreft celler til cisplatin behandling
For å teste om Mir-21 bidrar til cisplatin motstand av eggstokkreft celler, vi ectopically uttrykt pre-mir-21 i A2780 celler (figur S4 og S5). Figur 4A viser at sammenlignet med ikke-transfekterte A2780-celler eller med den tomme vektoren (klon 1, fig S4), stabil transfeksjon av pre-mir-21 (klon 1, fig S4) økte MIR-21 modne nivåer. De PDCD4 proteinnivåer ble også signifikant redusert (69%, *** p 0,001) i pre-mir-21 A2780 klon (A2780-MIR-21) sammenlignet med den tomme vektoren klon (A2780-EV) (figur 4B) . Ektopisk ekspresjon av pre-mir-21 i A2780-celler resulterte i en betydelig økning i celleformering (15,4%, *** p 0,001) sammenlignet med A2780-EV-celler (Figur 4C). I tillegg, cisplatin-behandling (1 uM) av A2780-MIR-21-celler resulterte i betydelig (ca. 15%, ** p 0,01) reduksjon av cellevekst inhibering i forhold til cisplatin behandling av A2780-EV-celler (figur 4D)
(A) A2780 celler ble stabilt transfektert med pCMV-miR21 eller tomme pCMV-EV vektorer. Mir-21 uttrykk ble kvantifisert ved QRT-PCR. ** P 0,01.
