Abstract
Bakgrunn
gene- dirigert enzym prodrug terapi (GDEPT) er en to-trinns behandlingsprotokoll for faste tumorer som omfatter overføring av et gen som koder for et promedikament-aktiverende enzym, etterfulgt av administrering av det inaktive prodrug som deretter aktiveres ved hjelp av enzymet til dets tumor toksisk form. Men til etablering av slike roman behandlingsregimer bekjempe kreft i bukspyttkjertelen krever definert og robuste dyr modellsystemer.
Metoder
Her har vi omfattende sammenlignet seks menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer (Paca-44, PANC-en, MIA PACA-2, Hs-766T, CAPAN-2, og BxPc-3) i subkutane og orthotopical musemodeller så vel som i deres mottakelighet for ulike GDEPTs.
Resultater
tumoropptak var 83% til 100% i det subkutane modellen og 60% til 100% i orthotopical musemodellen, med unntak av Hs-766T-celler, som ikke vokser orthotopically. Pathohistological analyser av orthotopical modellene viste en infiltrerende vekst på nesten alle svulster i bukspyttkjertelen; Men de forskjellige cellelinjer ga opphav til svulster med forskjellige morfologiske egenskaper. Alle de resulterende svulstene var positive for MUC-1 flekker indikerer deres opprinnelse fra kjertel eller ductal epitel, men avslørte spredt pan-cytokeratin farging. Overføring av cytokrom P450 og cytosin deaminase selvmordsgen, henholdsvis inn i de pankreatiske cancercellelinjer under anvendelse av retrovirale vektor teknologi viste høy grad infectibility av disse cellelinjene og tillot analyse av sensitiviteten av disse celler overfor de kjemoterapeutiske medikamenter ifosfamid og 5-fluorcytosin henholdsvis.
Konklusjon
Disse data kvalifisere cellelinjene som en del av verdifulle
in vitro Kjøpe og
in vivo
modeller for bruk i definerte preklinisk studier for bukspyttkjertelen tumor terapi
Citation:. Hlavaty J, Petznek H, Holzmüller H, Url A, Jandl G, Berger A, et al. (2012) Evaluering av et Gene-Directed Enzyme-produkt Therapy (GDEPT) i Human bukspyttkjertelen tumorceller og deres bruk som in vivo-modeller for kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE syv (7): e40611. doi: 10,1371 /journal.pone.0040611
Redaktør: Hiroyasu Nakano, Juntendo University School of Medicine, Japan
mottatt: 7 mars 2012; Godkjent: 11 juni 2012; Publisert: 16.07.2012
Copyright: © 2012 Hlavaty et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert delvis av den østerrikske Industrial Research Promotion Fund programmet samt ved Christian Doppler Laboratory for Gene Terapeutisk Vector Development. Finansiører hadde ingen rolle i i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Medforfattere BS og WHG erklære tilknytning til selskapet Austrianova Singapore PTE LTD. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Ingen andre relevante erklæringer knyttet til sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter osv eksisterer. Forfattere JH, HP, HH, AU, GJ, AB, MR har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Til tross for omfattende vitenskapelige innsats og akkumulere kunnskap om kreft i bukspyttkjertelen biologi, dødelighetsrater dette hovedsakelig dødelig sykdom har ikke blitt betydelig redusert i løpet av de siste 30 årene. Videre er det over hele verden forekomsten av denne sykdom øker [1], [2]. Når det er mulig, den gjeldende standarden på omsorg innebærer kirurgisk reseksjon med eller uten postoperativ kjemoterapi eller kjemoterapi /strålebehandling (for oversikt se [3]). Inntil nylig var den mest vanlige kjemoterapeutiske middel som anvendes for behandling av kreft i bukspyttkjertelen er 5-fluorouracil (5-FU), gitt enten alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler og /eller radioterapi [4], [5], [6]. Men en annen nukleotid-analog, gemcitabin (Gemzar), brakt på markedet i 1997, først og fremst for dens lindrende effekt, heller enn for forbedring av overlevelse, er raskt blitt kjemoterapeutisk behandling av valget for kreft i bukspyttkjertelen på grunn av sin terapeutiske potensial alene eller i kombinasjon [7] [8], [9].
Likevel nye behandlingsalternativer er presserende behov, og i løpet av de siste tiårene har en rekke forskere begynt å vurdere nye og ukonvensjonelle strategier for behandling av kreft i bukspyttkjertelen. Dette inkluderer nye immunologiske strategier som benytter monoklonale antistoffer og terapeutiske vaksiner, samt gen baserte tilnærminger som antisense nukleinsyrer, ekspresjon av dominerende negative onkogene mutanter, ekspresjon av tumorsuppressorgener eller gen-dirigert enzym prodrug terapi (GDEPT; for gjennomgang se [10], [11]). I GDEPT, også kjent som selvmord genterapi, er en spesifikk, heterologt gen som innføres i kreftceller [12]. Når det uttrykkes, er det aktuelle genproduktet i stand til lokalt å konvertere en systemisk administrert ikke-toksisk promedikament til dets aktive celle-giftig form, å utøve den terapeutiske effekt på tumorcellene, så vel som i omgivende celler på grunn av en såkalt bystander effekt mediert ved diffusjon av de toksiske metabolitter.
Herpes simplex virus tymidinkinase (HSVtk), cytosin deaminase (CD) og cytokrom P450 (CYP) er selvmordsgener som tidligere har vært vist å være effektive i forskjellige tumormodellsystemer ( anmeldt i [13]). Virale vektorer basert på retrovirus, slik som den murine leukemivirus (MLV), har fått betydelig popularitet for effektiv og stabil gen-ekspresjon av disse selvmords gener i tumorceller, således flere studier anvendte retrovirale vektorer for levering av terapeutiske gener inn i bukspyttkjerteltumorcellene (for oversikt se [14]).
Som et første skritt for å evaluere nye ideer og konsepter for behandling, forsøk med tilgjengelige menneskelige bukspyttkjertelen tumorcellelinjer er ofte utført. Til tross for viktigheten av
in vitro
eksperimenter, tolkningen av resultatene og konklusjonene må være kritisk vurdert, siden modellene som brukes ofte representere et kunstig system som kanskje ikke nøyaktig gjenspeile
in vivo
situasjon. Fraværet av musemodeller recapitulating kritiske elementer av sykdommen har hemmet prekliniske studier [15], inkludert de av GDEPT tilnærminger. Derfor er ytterligere ikke-klinisk evaluering av nye behandlingsmetoder krever tilstedeværelse av en egnet dyremodell for human kreft i bukspyttkjertelen. Tidligere har utviklingen av in vivo pankreatiske tumormodeller blitt beskrevet av Thomas og medarbeidere, som genereres en xenograft musemodell (ved implantering av primære humane tumormateriale) og dyremodeller ved bruk av primær pasientens celler samt cellelinjer [16], [ ,,,0],17], [18]. Nylig er det etablert flere kreft i bukspyttkjertelen modeller basert på genmodifiserte dyr (for oversikt se [19]).
I denne studien ønsket vi å analysere og sammenligne seks ulike menneskelige bukspyttkjertelen tumor cellelinjer i subkutan og ortotopiske musetumormodeller, samt å vurdere egnetheten av disse modellene for prekliniske studier av GDEPT. De subkutane tumorer ble dannet i SCID /beige-mus ved hjelp av hver av cellelinjene. I ortotopisk modell, fem av de seks cellelinjer ga opphav til svulster og de fleste av disse infiltrert bukspyttkjertelen med unntak av CAPAN-2-cellelinjen. Videre har vi vært i stand til å vise at retrovirus-mediert uttrykk for selvmords gener som koder for cytosin deaminase eller cytokrom P450 2B1 overfører følsomheten av de omsatte cellene til de respektive prodrug (5-fluorcytosin, ifosfamid) ved klinisk relevante konsentrasjoner. Dataene presentert her kan være av betydning for andre forskere med hensyn til valg av en egnet dyremodell for human kreft i bukspyttkjertelen.
Diskusjon
I denne studien ble sammenlignet vi et panel av
Resultater og menneskelige bukspyttkjertelen carcinoma cellelinjer PANC-en, Paca-44, CAPAN-2, BxPC-3, MIA PACA-2, og Hs-766T med tanke på egnethet for et
in vivo
musemodell for kreft i bukspyttkjertelen. BxPC-3, Panc-1, ble PACA-44 og CAPAN-2-cellelinjer avledet fra ductal adenokarsinomer i bukspyttkjertel, mens MIA PACA-2-celler stammer fra karsinomer i bukspyttkjertelen kroppen [20], [21], [22], [23], [24]. Den Hs 766T-cellelinjen ble avledet fra lymfeknutemetastase av bukspyttkjertel karsinom [25]. Alle cellelinjer ble
in vitro
vokst som heft monolagkulturer med epitel (PANC-en, MIA PACA-2, Hs-766T, BxPC-3) eller runde til mangekantede (CAPAN-2, Paca-44) morfologi. Siden de genetiske integrities av tumor markører p53, K-ras, p16 og Smad4 (også kjent som DPC) er forbundet med graden av tumorgenisitet [26], sammenlignet vi cellelinjene som anvendes i forhold til sin genotype for disse markører (tabell 1). Ingen klar konsistens i de genetiske endringer av de undersøkte gener av de respektive cellelinjer er åpenbart, og resultatene er ofte avhengig av den type analyse anvendt (for oversikt se [27], [28]). Nesten alle cellelinjer hadde mutasjoner i cellesyklusregulerende tumor-suppressorer p53 og p16. Mutasjoner innenfor pankreatisk karsinom forbundet tumor suppressor Smad4, som er involvert i transformerende vekstfaktor beta (TGFfi) signalering, ble funnet bare i nedsatt cellelinjene Hs-766T og BxPC-3 [27]. Fra alle cellelinjer i denne studien, bare BxPc-3 er beskrevet å ha en intakt K-ras onkogen [27].
Subkutan og ortotopiske tumordannelse
Ved subkutan injeksjon av de ulike bukspyttkjertelkreft cellelinjer, alle dyrene viste svulstdannelse (bortsett fra en mus i PANC-en gruppe). Paca-44-deriverte svulster viste raskest, men ikke-homogen vekst. Syv dager etter celleinjeksjon disse svulstene kunne måles med en caliper og det første dyret måtte ofres etter 18 dager som tumorstørrelse ble større enn 1900 mm
3, og dermed ha vist en vekst på mer enn 1600 mm
3 innen fire dager (fig. 1). Den nest mest uttalt tumor vekst ble observert fra PANC-1 tumorer, etterfulgt av CAPAN-2, BxPC-3 og Hs-766T celler, som viste en mer moderat tumorvekst. I likhet med Paca-44, MIA PACA-2 svulster var målbar innen syv dager etter injeksjon, men i motsetning til de opprettholdt sin størrelse i 28 dager før du fortsetter å vokse (Fig. 1).
5 × 10
6 celler av hver bukspyttkjertelen cellelinje ble subkutant injisert i venstre flanken av CB-17 /IcrHsd-
Prkcd
SCID Lyst
bg
mus ved dag 0. Synlige svulster ble målt to ganger i uken med en tykkelse og størrelse ble beregnet ved formelen «lengde × bredde × bredde /2».
for å bestemme orthotopical oppførselen til de genererte bukspyttkjertelen svulster, ble deler av de subkutant dannes svulster transplantert i nært nærhet til bukspyttkjertelen av CB-17 /IcrHsd-
Prkcd
SCID Lyst
bg
mus. PACA-44 PANC-1, BxPC-3 og CAPAN-2-celler ble intraperitonealt (i.p.) i alle dyr. MIA PACA-2 tumorvekst ble funnet i.p. i tre av de fem dyrene (tabell 2). Selv om Hs-766T tumorStykkene ble implantert gjentatte ganger ip, ble det ikke observert tumordannelse (tabell 2), selv om re-analyse av implantert stykker bekreftet tumor celle levedyktighet (data ikke vist).
Over to tredje av Paca-44, PANC-en, MIA PACA-2 og BxPC-3 svulster infiltrert bukspyttkjertelen. Men den resterende tumorer hadde en tilkobling til bukveggen i stedet for til bukspyttkjertelen (tabell 2). Fra CAPAN-2-tumorer, bare en infiltrert bukspyttkjertelen, mens de andre ble festet til milt eller til bukveggen uten å vise gjennomtrengning (tabell 2). I motsetning til andre celletype, ble Hs-766T avledet svulster ikke knyttet til noen organ i det hele tatt, og ble funnet ligger løst i magen.
Tumor patologi
Svulster av alle de orthotopically voksende cellelinjer samt subkutant voksende cellelinje Hs-766T ble analysert histologisk. Analyse av nesten alle de ortotopiske tumormodellene viste fokal invasjon av autochtonic bukspyttkjertelen ved en fast anaplastisk carcinom unntatt BxPC-3-tumormodell som viste disseminert rørformet differensiering og CAPAN-2-celler som vokste som en duktalt adenokarsinom. Panc-1, BxPC-3 og CAPAN-2 svulster viste liten mobilnettet og atom pleomorphism og ble gjort opp av store celler med rikelig blek cytoplasma og store kjerner (PANC-en, CAPAN-2) eller små, runde celler med tette kjerner ( BxPC-3). Paca-44 og MIA PACA-2 svulster, derimot, hadde fremtredende cellulære og atom pleomorphisms. MIA PACA-2 svulster i hovedsak besto av små, runde til spindelformede celler med tette kjerner foruten store celler avslører hyper eosinofil cytoplasma soner typiske for akinærceller, mens Paca-44 svulster avslørte store, cytoplasma rike celler med store kjerner. Foruten CAPAN-2 og BxPC-3-tumorceller som hadde bare en moderat hastighet av mitose, celler av alle andre tumorer viste en sterkt øket mitotisk aktivitet som indikerer den høye malignitet av disse svulstene. Videre er det i PANC-1, MIA PACA-2 og BxPC3 tumorer store områder som gjennomgår nekrose kunne observeres – et ytterligere karakteristisk trekk ved svært maligne tumorer. Til sammen nesten alle svulster viste en høy grad av dedifferentiation, med bare CAPAN-2 svulster samt i enkelte områder av BxPC-3 svulster rest egenskaper som er typiske for kjertel opprinnelsen av svulstene kan påvises.
Only lite lymfatisk og nøytrofil infiltrering av tumor-tilstøtende vev, for eksempel fettvev og bindevev og autochtonic bukspyttkjertel, ble detektert i PANC-1, PACA-44, BxPC-3, MIA PACA-2, og CAPAN-2 modeller ytterligere lymfatisk infiltrasjon i PACA-44 tumorvevet i seg selv (fig. 2A). I tillegg ble det observert diffuse moderat nøytrofil invasjon av hele MIA PACA-2 avledet svulster med fokusområder colliquation (Fig. 2A). Som orthotopical implantasjon av Hs-766T tumor biter ikke resulterte i tumorvekst, ble det analoge subkutan modellen histologisk analysert avslører en solid anaplastic kreft med prominente mobilnettet og kjernefysiske pleomorphisms, hovedsakelig bestående av små, runde til spindelformede celler med tette kjerner, en høy mitotisk aktivitet, og store deler av nekrotisk tumorvev (fig. 2A). Brede grener av fibrøst vev var detekterbare i periferien av tumorer, men også spres i tilknytning til tumorcellegrupper i BxPC-3, CAPAN-2 og PACA-44 tumorer; i Paca-44 svulster fibrose ble ledsaget av umodne leukocyttisk infiltrater.
(2A) Deler av bukspyttkjertelsvulster avledet av de angitte bukspyttkjertelen cellelinjer ble farget med haematoxylin og eosin. HS-766T prøven ble dissekert fra en subkutan svulst; Alle andre prøver ble tatt fra orthotopically dyrkede tumorer. (2B) Forskjellige deler av en BxPC-3-avledet tumor ble underkastet immunhistokjemi analyse med antistoffer mot mucin-1 (FRA-1), pan-cytokeratin (Pan-CK), og α-glattmuskel aktin (SMA). Den svarte linjen representerer en lengde på 53 mikrometer, med unntak av anti-MUC-en farging (27 mikrometer).
PAS farging ble utført for å identifisere kreft strukturer som stammer fra kanaler og /eller acini. I CAPAN-2 og BxPC-3-tumorer var 40% og 25% av tumorcellene positive for PAS, respektivt. Alle andre tumorer, med unntak av MIA PACA-2 og PANC-1, som forble helt negativt, avslørte bare en marginal rekke PAS-fargede celler – mest sannsynlig på grunn av deres mer dedifferensieres status (data ikke vist)
.
Immunhistokjemisk (IHC) farging av MUC-1-protein, som er uttrykt ved de fleste kjertel- og ductal epitelceller, førte til diskrete merking av nesten hele tumormassen i PACA-44 PANC-1, BxPC-3 (fig . 2B) og CAPAN-2 ortotopisk tumormodeller og av ca 75% av MIA PACA-2 tumor. Sammenlignet med de immunologiske signalene observert i løpet av de normale humane bukspyttkjertel, hvor brunlig Merkingen ble funnet i cytoplasmaet til acini og ductal epitelceller, ekspresjonsproduktene profiler av de tumorer er indikative for deres acinar og duktalt opprinnelse. Selv histomorphology bare sjelden ligner autochtonic bukspyttkjertelen vev, i henhold til de fargeprofiler som er nevnt ovenfor, disse svulstene er identifiserbare som adenokarsinom ductal opprinnelse, som står for 85% til 90% av alle pankreastumorer [29], [30]. Imidlertid, i henhold til WHO klassifisering, som gjenkjenner flere varianter i tillegg til de klassiske tubuloglandular duktalt adenokarsinom [30], nesten alt av de ortotopiske tumorer tilsvarer den anaplastisk karsinom varianten. Interessant, IHC påvisning av cytokeratins (CK) 1-8, 10, 14-16 und 19 ved hjelp av en pan-CK-antistoff resulterte i immunmerking av hele tumoren etablert med PACA-44, BxPC-3 og CAPAN-2-celler, men i bare 60% og 40% fargede celler i MIA PACA-2 og PANC-1 svulster, henholdsvis. Som Pan-CK hovedsakelig farget rørformede /ductal strukturer av de normale humane bukspyttkjertel, den reduserte immunomerking på MIA PACA-2 og PANC-1 sammenlignet med de andre svulster kan være tegn på en mer acinar opprinnelsen til disse tumorer, eller, hovedsakelig i tilfellet av MIA PACA-2, som også uttrykkes MUC-1 i bare 75% av tumorcellene, kan den uttrykksmønster være indikativt for en høyere grad av malignitet, som er støttet av det histologiske utseende av denne tumor med store områder av nekrose nøytrofil colliquation og en høy mitotisk rate. Resultatene oppnådd ved å analysere evnen til pan-CK og MUC-1-antistoffer til å binde til cellelinjene signalene var inhomogene og inkonsekvent, noe som kompliserer tolkningen av dataene.
i sammendraget, i henhold til deres histologiske utseende, PAS-farging mønster, og uttrykket profiler for MUC-1 og Pan-CK, MIA PACA-2 og PANC-1 cellelinjer ga opphav til de mest dedifferensierte svulster i denne studien; imidlertid, ble utvetydig likhet med friske human bukspyttkjertel gitt i noen av tumorene, som, med unntak av den lille rørformede område i CAPAN-2, og med de ikke-anaplastiske tumorer viste en fast, ikke-kjertel vekstmønster.
Ved hjelp av anti-SMA, mange dypt brunfarget cytoplasma rike stromale celler i tilknytning til kreftceller ble funnet i hele svulster i alle cellelinjer; normale bukspyttkjertelen forble negative (fig. 2). Tydelig fibrose fulgte PSC avtaler, mest åpenbart i BxPC-3, CAPAN-2 og Paca-44 svulster. GFAP farging viste positiv farging bare i MIA PACA-2 svulster, som representerer merket stelcelleprosesser rundt bukspyttkjertelen acini. Således, som aktiverte pscs er kjent for å være prinsippet effektorceller i fibrose, som er en konsistent patologisk trekk i human kreft i bukspyttkjertelen [31], [32], [33], og forstyrre desmoplastic tumor stroma forbedrer levering og effekten av anti -tumor medikamenter [33]. BxPC-3, CAPAN-2, og PACA-4-celler representerer de mest lovende tumormodeller for studier vedrørende inhibering av fibrogenese i human kreft i bukspyttkjertelen.
Våre data indikerer at, ved å anvende forskjellige bukspyttkjertelcellelinjer in en ortotopisk innstilling, kan et bredt spekter av heterologe pankreatiske tumortyper bli etablert som tjener som modell for forskjellige terapeutiske anvendelser i pancreas tumorterapi. Tidligere studier i SCID mus viste at s.c. implantert svulster bare sjelden viser metastase [16]. I vår studie, ble musene holdt i inntil 18 uker etter CAPAN-2 og BxPC-3 svulst utbruddet, 13 og 10 uker etter at MIA PACA-2 og PANC-en svulst utbruddet, henholdsvis, og 4 uker etter Paca-44 svulst utbruddet og brutto analyser av mus organer viser at ingen av de kreftceller ført til lokale eller distale metastaser enten etter sc eller orthotopic transplantasjon. I motsetning til dette, Tseng og medarbeidere har nylig funnet levermetastaser i B6 /129 mus etter 6 til 8 uker etter implantering av cellelinjer fra levermetastaser oppnådd fra K-ras (G12D /+), LSL-Trp53 (R172H /+) og PDX-1 -Cre mus [34]. Som hos mennesker, om ikke alle bukspyttkjertel karsinomer viser lokale og fjerntliggende metastaser over tid, har de fleste av mangel på metastatisk tendens til å bli tatt i betraktning ved etablering av et medikament effekt forsøk med disse tumorcellelinjer.
I tillegg til in vivo-modeller bærer humane celle xenografter, nylig har blitt etablert genmanipulerte mus modeller av kreft i bukspyttkjertelen (for oversikt se [19], [35]). Siden disse modellsystemer er basert på enkle genetiske endringer, er de verdifulle verktøy for å studere innflytelsen av slike genetiske endringer eller av enkelt signalveier for tumorutvikling [19]. Men de er mindre egnet til å vurdere nye terapeutiske konsepter for kreft i bukspyttkjertelen behandling. I stedet modellsystemer som orthotopically økende humane tumorer xenografter er langt bedre egnet som ligner de, på grunn av opprinnelsen av humane pankreatiske tumorer, den nåværende status og heterogeniteten av den humane sykdommen.
cytosin-deaminase-mediert Følsomhet av humane cellelinjer pankreas Mot 5-fluorcytosin
for å studere forholddrep potensialet i cytosin deaminase /5-FC-systemet i våre kreft i bukspyttkjertelen modeller, idet hver av de seks tumorcellelinjer ble infisert stabilt
in vitro
med retrovirus vektor PCCDWmCMVpuro, husing gjær cytosin deaminase (CD) genet under transkripsjonen kontroll av den allestedsnærværende murine cytomegalovirus (CMV) promoter [36]. Gjæren CD tillater omdannelse av ikke-toksiske promedikament 5-fluorcytosin (5-FC) til den svært giftige kjemoterapeutiske middel 5-fluoruracil (5-FU) og således, etter integrering i kreft i bukspyttkjertelen celler, bør dets ekspresjon tillate fortrinnsrett tumor celle uttømming på 5-FC administrasjon.
for å bekrefte CD transkripsjon etter retrovirus transduksjon, RT-PCR ble utført fra lysater av transduced celler samt fra ikke-transduced celler. Den ~480 bp CD-genfragmentet ble tydelig påvist i celler transdusert med vektoren PCCDWmCMVpuro (fig. 3), men var fraværende i ikke-infiserte celler. Disse data indikerer riktig vektor integrasjon og sammenlignbar ekspresjon av CD-transgenet i alle cellelinjer (Fig. 3).
Total cellulær RNA ble isolert fra angitte cellelinjer og mRNA ble reverstranskribert ved anvendelse av oligo (dT) primere. CD, så vel som Gaph-spesifikke gen-fragmenter ble amplifisert ved bruk av spesifikke primere og separert på en agarosegel som viser de forventede størrelser av ~480 bp for CD og ~350 bp for GAPDH. CDNA beløpet som brukes for PCR forsterkning ble justert for å gi sammenlignbare mengder av GAPDH genet fragment.
For å vurdere dette GDEPT strategi for behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler
in vitro
, vi bestemt LD
50 etter administrasjon av prodrug 5-FC menneskelige bukspyttkjertelen tumor cellelinjer tidligere transduced med PCCDWmCMVpuro. Sammenlignet med untransduced celler som ikke var mottakelige for 5-FC (mer enn 1000 ug /ml), ble LD
50 reduseres med 16-ganger i gjennomsnitt i alle cellelinjer (tabell 3). Denne fremragende økning av 5-FC følsomhet indikerer at ekspresjon av CD opprettet omdannelse av promedikament 5-FC til 5-FU toksisk i alle transduserte pancreas tumorcellelinjer. Interessant, CD-uttrykkende cellelinje BxPc-3 var opptil 30 ganger mer følsomme for 5-FC i forhold til transduserte Hs 766T-celler. For å analysere hvorvidt denne forskjellen i følsomhet er uavhengig av CD-ekspresjon, ble både ubehandlede og transdusert pankreatiske cellelinjer direkte inkubert med toksisk 5-FU. Som forventet, mottakelighet av alle cellelinjer til 5-FU var uavhengig av transduksjon med vektoren PCCDWmCMVpuro. Imidlertid, i henhold til 5-FC behandlingsresultater, BxPC-3-celler var omtrent 30 ganger mer følsomme for 5-FU enn Hs-766T-celler (tabell 3), noe som tyder på at de testede bukspyttkjertelcellelinjer har en differensiell følsomhet for den toksiske narkotika
per se
. I følge kliniske studier som anvender 5-FC, blir plasmakonsentrasjon hos pasienter nådde nivåer på 50-125 ug /ml 5-FC etter oral administrering av 150 mg 5-FC per kg kroppsvekt [37], [38], [39] . Imidlertid er plasmakonsentrasjoner over 100 ug /ml ofte betraktet som toksiske for pasienten [39]. I denne forbindelse, behandling med vektor PCCDWmCMVpuro tillates fire ut av seks cellelinjer som ble testet for å svare på 5-FC konsentrasjoner under 100 ug /ml, noe som tyder på at GDEPT kan føre til at en effektiv tumorbehandling ved pro-medikament doser under de nivåer av ikke-spesifikk toksisitet.
Cytokrom P450-mediert dreping av humane pankreatiske tumorcellelinjer
bruken av det kjemoterapeutiske middel ifosfamid for behandling av kreft i bukspyttkjertelen er blitt beskrevet i flere studier [40], [ ,,,0],41], [42], [43], [44]. Prodrogen ifosfamid omdannes til fosforamid sennep av cytokrom P450. Fosforamid sennep gjengir DNA til delende celler dysfunksjonell via alkylering, som er basis for dens selektivitet for delende celler så som inngår i hurtigvoksende tumorer. Dessverre, som cytokrom P450 hovedsakelig produseres i leveren, toksisitet av ifosfamid metabolitten er heller systemisk og ikke tumorspesifikt. For å forbedre tumor-spesifikke toksisitet i vår sammenlignings bukspyttkjertelen tumor modell, brukte vi retrovirusvektoren PCCWmCMV husing rotte cytokrom P450 2B1 (CYP2B1) genet for stabil transduksjon av pancreatic cellelinjer.
For å overvåke uttrykk for CYP2B1 etter transduksjon, har Western blot analyser utført med protein lysater av transduserte og ikke-transduserte celler. CYP2B1 ekspresjon ble bare påvist i celler som tidligere er transdusert med den retrovirale vektor (Fig. 4). Cellelinje BxPC-3 viste kun mindre uttrykket nivåer av CYP2B1. For å evaluere følsomheten av CYP2B1-uttrykkende bukspyttkjerteltumorcellelinjer BxPC-3, MIA PACA-2, Hs-766T, PACA-44 og PANC-1 mot ifosfamid, LD
50 ble bestemt i forhold til untransduced celler. Den uspesifikke toksisitet av prodruget ifosfamid i ikke-transdusert cellelinjer variert betydelig og er i området fra 0,18 mM (Hs 766T-celler) opp til 2 mM (PANC-1-celler) LD
50-verdier (tabell 4). Ekspresjon av transgenet CYP2B1 ført til en opptil 13-ganger økt mottakelighet for ifosfamid i fire av de fem cellelinjer som ble testet (tabell 4.). Bare Hs-766T celler, som var mest følsomme for ifosfamid
per se
, viste ingen økt følsomhet for ifosfamid på tross av CYP2B1 genuttrykk.
Totalt cellular lysates fra 8 × 10
5-celler ble separert på en 10% polyakrylamidgel i henhold denaturerende betingelser. Etter blotting, ble CYP2B1 protein oppdaget med en CYP-spesifikt antistoff.
Studier på muligheten for in vivo GDEPT for kreft i bukspyttkjertelen har allerede blitt utført tidligere [44], [45], [46], [47], [48]. Vi har vist at innkapslede celler genetisk modifisert til å uttrykke cytokrom P450 selvmordsgen implantert i mus i nærheten av tumorer avledet fra PACA-44-celler er i stand til å forårsake tumor-reduksjon, når det er hensiktsmessig prodrug som aktiveres av cytokrom P450 gis [45] , [46]. I tillegg har vi brukt disse innkapslede celler i en klinisk studie med pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og var i stand til å vise at median overlevelse av denne pasientgruppen ble fordoblet [44], [47].
Til sammen disse data tyder på at en slik GDEPT tilnærminger for behandling av kreft i bukspyttkjertelen er lovende. Men slike nye behandlingsformer må bli testet i mer enn en relevant dyremodellsystem som likner det karakteristisk for de respektive tumorer så langt som mulig. Dette indikerer klart et stort behov for videre karakterisering av dyremodeller for valg, som vi har vist i denne studien.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyrene ble håndtert i henhold til god dyr praksis. Animal arbeidet ble godkjent av Advisory Committee for Animal Experiments av den føderale departementet for utdanning, vitenskap og kultur i henhold til den østerrikske Federal Law of Animal Experiments (BGBl No. 501/1988, BGBl jeg No. 169/1999, og BGBl jeg Nei . 136/2001) og en lisens for dyreforsøk ble utstedt spesielt for denne studien (GZ 68,205 /177-BrGT /2003). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere dyrs lidelser. Operasjoner ble utført under narkose. Dyrene ble drept før svulsten nådde en håndgripelig størrelse på 1500 mm
3.
Plasmider
Den kodende sekvensen av cytosin deaminase genet (CD, GenBank tiltredelse no. U55193, pos. 183-659) fra
Saccharomyces cerevisiae
ble PCR-amplifisert fra gjær genomisk DNA (Sigma), og deretter føres inn i pCR-XL-TOPO kloningsvektor (Invitrogen) som resulterer i plasmid pYCD. Deretter ble cytosin deaminase cDNA frigitt fra plasmidet pYCD via en
EcoR
I restriksjonskutting og ligert med det 7,7 kb
EcoR
I-fragment av plasmid pPCEWmCMVpuro som koder for en MLV-basert retrovirusvektor [ ,,,0],36]. Det resulterende plasmid ble kåret pPCCDWmCMVpuro. Den kodende sekvensen til rotte cytokrom P450 2B1 (CYP2B1) genet ble PCR-amplifisert fra plasmid pc3 /2B1 [47] ved anvendelse av primere Alder-CYP (5′-GCGTACCGGTCCACCATGGAGCCCAGTATCTTGC-3 «) og CYP-Not (5′-AAGCGGCCGCTATCACCGAGCTGAGAAGCAG-3» ) husing
Age
jeg og
Ikke
jeg bestemt restriksjonsseter, henholdsvis, og klonet inn i den store
Age
I-
Ikke
jeg fragment av retroviral vektor plasmid pPCEmCMV [36]. Det resulterende plasmid ble kåret pPCCmCMV. For å danne plasmid pPCCWmCMV ble woodchuck hepatitt virus posttranskripsjonelt regulerende element (WPRE) løslatt fra plasmid pPCEWmCMV ved restriksjons fordøye med
ikke anbefale jeg og satt inn i
ikke anbefale I-lineariserte vektoren pPCCmCMV [36 ].
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
amfotrofisk retrovirale emballasje celler basert på humane embryonale nyrecellelinje HEK293 [49], menneskebukspyttkjerteltumorcellelinjer PANC-1 (ATCC CRL-1469), PaCa- 44 [22], MIA PACA-2 (ATCC CRL-1420), og Hs-766T (ATCC HTB-134) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM /Glutamax, Life Technologies) supplementert med 10% føtalt kalveserum (FCS , Life Technologies). Humane pankreatiske tumorcellelinjer BxPC-3 (ATCC CRL-1687) og CAPAN-2 (ATCC HTB-80) ble dyrket i RPMI-medium (Life Technologies) supplementert med 10% FCS og glutamin og McCoys medium (Life Technologies) supplementert med 10 % FCS, henholdsvis. NIH3T3 celler (ATCC CRL-1658) ble opprettholdt i DMEM /Glutamax supplert med 5% FCS.
Virus Produksjon og Generering av stabilt infiserte celler
kalsiumfosfat co-nedbør metoden ble brukt til å etablere stabilt virusproduserende celler [50]. I korthet, 7 x 10
5 fra HEK293 basert retrovirale pakkingscellene [49] ble transfektert i en 6-brønns plate med 3,0 mikrogram av plasmid pPCCDWmCMVpuro og pPCCWmCMV, respektivt.
