Abstract
Kreftceller ofte benytter utviklings stikkordene for fordelaktig vekst og metastasering. Her rapporterer vi at et axon veiledning molekyl, Sema3E, er sterkt uttrykt i menneskelig høyverdig ovarial endometrioid karsinom, men ikke lavgradig eller andre eggstokkene epiteltumorer, og legger til rette for tumorprogresjon. I motsetning til sin kjente angiogen aktivitet, Sema3E handlet gjennom Plexin-D1 reseptorer for å øke celle vandrende evne og samtidig epitelial til mesenchymale overgang (EMT). Sema3E-indusert EMT i eggstokkene endometrioid kreftceller var avhengig av kjernefysiske lokalisering av Snail1 gjennom aktivering av phosphatidylinositol-3-kinase og ERK /MAPK. RNAi-mediert knockdown av Sema3E, Plexin-D1 eller Snail1 i Sema3E-uttrykker tumorceller resulterte i nedsatt cellemotilitet, samtidig reversering av EMT og redusert kjernekraft lokalisering av Snail1. I motsetning til dette, tvinges retensjon av Snail1 innenfor kjernen av Sema3E-negative tumorceller indusert EMT og forbedret celle motilitet. Disse resultater viser at i tillegg til de angiogene effekter av Sema3E på tumor vaskulært endotel, kan en EMT-strategi kan utnyttes av Sema3E /Plexin-D1 signalering på tumorceller for å fremme cellulær invasjon /migrerings
relasjon:. Tseng CH Murray KD, Jou MF, Hsu SM, Cheng HJ, Huang PH (2011) Sema3E /Plexin-D1 mediert epithelial-til-Mesenchymale Overgang i Ovarian endometrioid Cancer. PLoS ONE 6 (4): e19396. doi: 10,1371 /journal.pone.0019396
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 31 desember 2010; Godkjent: 29 mars 2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Tseng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et fond fra National Taiwan University Hospital (NTUH98-P26-2 og NTUH99-P21) gitt til PH Huang. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ondartet progresjon av en svulst innebærer ofte kjøp av forbedret trekkfugl evne i kreftceller for lokal invasjon og fjernmetastaser, som begge er de viktigste determinanter for klinisk sykelighet og dødelighet. Lignende biologiske prosesser forekommer gjennom hele normal embryoutvikling, så vel som i visse fysiologiske tilstander så som sårheling [1], [2]. Innsikt fra utviklingsbiologi kan derfor hjelpe oss å forstå invasiv ondartet progresjon av en svulst.
Semaphorins (Sema) er en stor familie av utskilte og membranassosierte proteiner som gir miljømessige signaler for å formidle ulike utviklingsprosesser inkludert neuronal cellemigrering, axon veiledning, vaskulogenese, forgrening morfogenese, og hjerte organogenese [3] – [8]. Semaphorins binde plexin og /eller neuropilin reseptorer for å transduce intracellulære signaler. I dag er fem klasser av semaphorins, to neuropilins og fire familier av plexins identifisert i pattedyr [6]. Nyere bevis tyder også semaphorin /plexin signalering er involvert i tumordannelse [9] – [11]. Men deres roller er ganske forskjellige og avhenger av den spesifikke svulst sammenheng og sammensetningen av semaphorins, plexins, og deres intracellulære signal responsive elementer. Semaphorin /plexin signale kan enten fremme eller hemme tumorvekst ved direkte å regulere cellemigrasjon eller celle apoptose. Semaphorin /plexin signalering kan også indirekte kontrollere svulst invasiv vekst gjennom regulering av angiogenese eller svulst immunitet [10], [12] -. [16]
I en skjerm av klasse 3 semaphorins i tumorvev arrays (noen eksempler er vist i fig. S1C), identifiserte vi Sema3E som spesifikt uttrykt i høyverdig ovarial endometrioid karsinom, en undertype av epitelial eggstokkreft (fig. 1). Klinisk, de fleste diagnoser av høyverdig eggstokkreft har dårlig prognose med metastase og er motstandsdyktige overfor kjemoterapi og understreker behovet for å grundig forstå patogenesen av epitelial eggstokkreft og deres progresjon [17]. Ved hjelp av et humant ovarie endometrioid karsinom-cellelinje og avledet underlinjer med ulike invasiv /trekkende evner [18], undersøkte vi sammenhengen mellom Sema3E molekylær og cellulær signaliseringsmekanismer og tumor invasivitet. Vi rapporterer her at Sema3E fra kreftceller kan fungere på seg selv gjennom Plexin-D1 å indusere EMT og samtidig legge til rette for celle migrasjon og ondartet progresjon.
A, B. RNA
in situ
hybridisering med antisense
Sema3E
sonde og immunhistokjemi med polyklonale antistoff mot Sema3E showet differensial uttrykk av mRNA og protein henholdsvis i celler i hele vevssnitt fra høy og lav grad av menneskelige eggstokkene epiteliale kreftformer. Hematoxylin og eosin-farging (H 10 ganger) i high-invasiv /trekkfugl P4 celler sammenlignet med P0 celler. I motsetning Sema3F generelt sett en tumor suppressor ble nedregulert i P4-celler [10], [19]. Selv om variabel plexin og neuropilin uttrykk ble observert, ble Plexin-D1 og Npn en like uttrykt i lav-invasiv P0 og høy-invasive P4 celler (fig. 1E og S2B). RNA
in situ
hybridisering analyse på dyrkede enkelt eggstokkreft endometrioid kreftceller bekreftet disse resultatene (Fig. S2A). Dette tyder Sema3E uttrykk i eggstokkene endometrioid kreftceller kan være involvert i oppkjøpet av mobilnettet invasiv /vandrende evne.
Den P61-Sema3E isoform er sannsynlig til å handle i en autokrin måte gjennom Plexin-D1 for å forbedre den invasive /trekkfugl evne eggstokkreft endometrioid kreftceller
in vitro
på en konsentrasjonsavhengig måte
for å undersøke hvilken rolle Sema3E i formidling invasivitet og /eller vandrende evne under tumorprogresjon, vi utførte gevinst og tap av funksjon studier i OEC celler. Først må vi over uttrykt Sema3E foreldre Sema3E-negative, lav-invasive P0 celler. Disse stabile cellelinjer (betegnet P0-3E-
1, P0-3E-
3 og P0-3E-
10) oppviste varierende grader av Sema3E uttrykk som målt ved semi-kvantitativ RT-PCR, immunoblotting og RNA
in situ
hybridisering (fig. 2A). For det andre, Sema3E uttrykk i svært invasive P4 celler ble stabilt slått ned av RNAi-mediert uttømming. Vi fikk to kloner, betegnet P4 /si3E-
1 og P4 /si3E-
2 målrettet av ulike RNAi sekvenser som viste 75% ~90% reduksjon i Sema3E forhold til foreldre P4 celler (Fig. 2B, høyre paneler ). Kontroll OEC kloner ble transfektert enten med tom-vektor (-mock) eller egge RNAi sekvenser (-kontroll). Flowcytometri analyse og trypanblått eksklusjons eksperimenter viste at cellen levedyktighet og spredning ikke ble endret på P0-3E og P4 /si3E kloner (Fig. S2C og D).
A. Modifiserte P0 cellelinjer (P0-3E-
x) uttrykker variable nivåer av Sema3E målt ved semi-kvantitativ RT-PCR-analyse (venstre øverst) og Western blotting (venstre nederst). Expression verdier ble normalisert til
GAPDH Hotell og œ-Tubulin for mRNA og protein, henholdsvis. RNA
in situ
hybridisasjonsprober av Sema3E i P0-3E-
1 sammenlignet med P0 celler (høyre). B. Western blotting av Sema3E og Plexin-D1 i P4 /si3E kloner (RNAi-1, -2 for målretting to ulike sekvenser av Sema3E) og P0-3E-
1 /siD1 kloner (RNAi-1, -2 for rettet mot to ulike sekvenser av Plexin-D1). C, D, E, F. Lysfelt photomicrographs fra sårhelende migrasjon analyser av ulike P0-3E (C), P0-3E-
1 /siD1 (D), og P4 /si3E (E) cellelinjer på begynnelsen (0 h) og 16 timer etter overflaten scratch. Sårkantene ble markert med hvite linjer (0 h) eller svarte linjer (16 h). Scale bar, 0,5 mm. En oppsummering av gjennomsnittlig migrerende hastighet (um /h) for hver klon er plottet (F) sammen med standardavvik (n≥12). *,
P
0,05, sammen
t
-test. G, H. Representative bilder (G) og graf oppsummering (H) av transwell kammeret invasjonen assay (n≥6). Scale bar, 30 mikrometer. I. Furin hemmer, decanoyl-RVKR-chloromethylketone, endrer vandrende evne P0-3E-
1 celler i sårhelende og Transwell kammeret migrasjon analyser. DMSO ble anvendt som en kontroll. Hvit linje, 0 t på sårhelende prosess; svart linje, 16 timer etter overflaten scratch. **
P
0.005, *,
P
0,05, sammen
t
-test, n = 5. Scale bar, 0,5 mm. J. Transwell kammer invasjon analysen for P0 celler som stabilt uttrykker P61-Sema3E isoform (P0-3Ep61-
1 og P0-3Ep61-
2) sammenlignet med P0-3E-
1 celler og P0 celler. **
P
0.005, sammen
t
-test, n = 4. Scale bar, 0,3 mm
invasive /trekkende evner. OEC kloner ble evaluert av
in vitro
sårhelende, tre-dimensjonale (3D) -matrigel migrasjon, og Transwell kammer invasjon analyser. I det sårhelende assay, P4-mock og P0-3E-
1 cellene begynte å fylle såret så tidlig som 4 timer etter grunnen, mens P0-mock-celler viste langsom motilitet selv etter 16 timer. De P0-3E kloner migrert i et Sema3E doseavhengig måte slik at P0-3E-
1 og P0-3E-
9 celler, uttrykker relativt høye mengder Sema3E flyttet raskere og lenger enn P0- 3E-
3 og P0-3E-
10 celler, som uttrykte lavere mengder Sema3E (fig. 2C og F). Motsatt, uttømming av Sema3E i P4 celler bremset ned vandringshastighet og distanse (Fig. 2E og F). ble observert Tilsvarende endringer i matrigel migrasjon analysen og transwell kammer invasjonen analysen: P4 og P0-3E-
1 celler viste en betydelig større invasiv potensiale sammenlignet med P0-3E-
10, P4 /si3E eller foreldre P0 cellene der Sema3E nivåer er redusert eller fraværende (fig. 2G, H og S2E). Derfor, over-uttrykk for Sema3E i lav-invasiv OEC celler øker cellulære trekkende og invasive evner
in vitro
i en gjør-avhengig måte, og knockdown av Sema3E reduserer trekk /invasive egenskaper i høy-invasive OEC celler .
Sema3E binder direkte med Plexin-D1 til transduce intracellulære signal under embryonal eller tumor angiogenese [20]. Vi avgjort om Plexin-D1 i OEC celler er nødvendig for Sema3E mediert vandrende /invasiv evne som er relatert til angiogenese. To stabile knockdown kloner, P0-3E /siD1-
1 og P0-3E /siD1-
2 ble generert av RNAi målretting av separate Plexin-D1 sekvenser som reduserte Plexin-D1 nivåer med 85% -95% som bestemt ved western blotting (fig. 2B, venstre panel). Knockdown av Plexin-D1 påvirket verken uttrykk for Sema3E eller levedyktighet eller spredning av celler (fig. 2B, S2C og S2D). Men invasiv /vandrende fenotype gitt av over-uttrykk for Sema3E ble reversert ved tap av Plexin-D1 (Fig. 2D, F, G, H). Disse resultatene antyder at Sema3E overfører en trekkende evne til å OEC cellene gjennom Plexin-D1 på en autokrin måte.
full-lengde klasse 3 semaphorin proteiner som er gjenstand for konvertase-formidlet kløyving, for derved å generere flere isoformer med differensielle aktiviteter [ ,,,0],15], [21]. I brystkreftceller, er P87-Sema3E proteinet spaltet av furin til P61 og P26-isoformene, og det er P61-Sema3E som induserer angiogenese for invasiv vekst [15]. Når du utfører Sema3E immunoblotting i Sema3E-uttrykke OEC celler, la vi merke til at en P61-sized bånd i stedet for full-lengde P87-Sema3E ble oppdaget, selv om alle P0-3E kloner ble transfektert med en full-lengde Sema3E cDNA konstruere ( fig. 2A). Vi undersøkte om dette P61-proteinet samsvarer Furin-behandlet Sema3E. Immunoblotting viste at furin var til stede i alle OEC-celler (fig. S3A). Når Furin aktivitet ble hemmet av decanoyl-RVKR-chloromethylketone, uttrykk for P61-Sema3E ble betydelig redusert, mens full størrelse P87-Sema3E ble tydelig (Fig. S3b). Videre ble Sema3E-mediert trekkende /invasive aktiviteter kompromittert i nærvær av furin inhibitor (fig. 2I). For å undersøke muligheten for at P61-Sema3E alene er tilstrekkelig for å fremme den vandrende /invasiv evne OEC celler er tillagt etter Sema3E, etablerte vi P0-3Ep61 kloner som uttrykte bare P61-Sema3E isoform. Begge
in vitro plakater (fig. 2J, S3C og S3D) og
in vivo plakater (fig. 3C) studier viste at uttrykket av P61-Sema3E alene var nok til å fremme vandrende /invasiv evne i OEC celler. RNAi-mediert knockdown of Plexin-D1 i OEC celler som stabilt uttrykte P61-Sema3E redusert vandrende evne gitt av P61-Sema3E (data ikke vist). Av ukjente grunner, kan vi ikke generere OEC celler som stabilt uttrykker mutant P87-Sema3E motstandsdyktig mot Furin cleavage. Derfor har vi testet kondisjonert medium fra COS celler transient transfektert med enten P61-Sema3E eller P87-Sema3E på cellular motilitet av Sema3E-negativ /Plexin-D1-positive P0 celler. Faktisk eksogent P61-Sema3E-kondisjonert medium på doseavhengig måte fremmes cellemigrasjon, og denne virkning ble svekket da Sema3E ble uttømt fra mediet ved pre-inkubering med anti-Sema3E antistoff (fig. S3E og F). Når ubehandlet P87-Sema3E-kondisjonert medium ble anvendt, ble ingen forbedring i cellemigrasjon observert (data ikke vist). Sammen er disse dataene indikerer at P61-Sema3E, men ikke full-lengde P87-Sema3E, fremmer en Plexin-D1 avhengig trekkfugl evne i OEC celler.
A. Brutto og mikroskopiske endringer i lungene etter intravenøs (i.v.) injeksjon i NOD /SCID-mus av OEC cellelinjer som uttrykker forskjellige Sema3E /Plexin-D1 aktiviteter. Arrowhead viser mikroskopiske kreft reir i nærheten av vaskulær treet. Scale bar, 50 mikrometer. B. Immunohistokjemi av Sema3E, cytokeratin, og TTF1 i lungemetastatiske svulster i NOD /SCID-mus i.v. injisert med P0-3E-
1 celler. C. Oppsummering av
in vivo
metastatiske eksperimentelle resultater. Antall mus med mikrometastatisk tumor lesjon av lungen (venstre til den skråstrek) mot det totale antall mus undersøkt (fra høyre mot skråstreken) er vist. Gjennomsnittlig lungevekt forskjellig mellom gruppene (*,
P
0,05, Student
t
-test).
Sema3E /Plexin-D1 signale fremmer metastasering av eggstokkreft endometrioid kreft
in vivo
Vi neste evaluert
in vivo
metastatisk kapasitet på OEC celler med forskjellig Sema3E /Plexin-D1 aktivitet i NOD /SCID-mus. Intravenøs injeksjon av Sema3E-negative P0-celler ikke på noe tidspunkt resulterte i tumormetastase i en hvilken som helst organ undersøkt ved 8 uker etter celle intravenøs injeksjon. I motsetning til injeksjon av Sema3E-uttrykk OEC kloner forårsaket metastatisk tumorvekst i lungene som vist ved en økning i total lungevekt (Fig. 3C), brutto intrapulmonal blødning (fig. 3A, toppfeltene), og tilstedeværelsen av mikroskopisk tumor reir i nærheten vaskulære trær (fig. 3A, bunnplater). De lungetumorer stammer fra de injiserte celler OEC som demonstrert ved positiv immunoreaktiviteten for humane Sema3E og cytokeratin (markører for humane celler), men ikke TTF-1, en markør for pneumocytes (Fig. 3B). I tillegg ble en Sema3E doseavhengig og Plexin-D1-avhengig metastatisk effekt observert. En høyere andel av lungemikrometastaser utviklet i mus injisert med OEC celler uttrykker høye nivåer av Sema3E (P0-3E-
1, P0-3Ep61, P4 celler), mens celler med lav Sema3E /Plexin-D1 aktivitet (P0 -3E-
10, P4 /si3E, P0-3E-
1 /siD1) hadde en lavere prosentandel av tumorer (fig. 3C). Også P61-Sema3E alene var i stand til å gi lungemikrometastaser på foreldre P0 celler
in vivo plakater (fig. 3C). Alle sammen, disse resultatene viser at P61-Sema3E gjennom Plexin-D1 signale er ansvarlig for overdragelse en doseavhengig stimulering av lungemetastatisk vekst av OEC celler.
Sema3E /Plexin-D1 signale endrer dynamikken i enkelt OEC cellemorfologi, i samsvar med en endring i celle motilitet
Vi observerte endringer i OEC cellulær morfologi som korrelerte med aktiviteten til Sema3E /Plexin-D1 signalering. Celler med høy Sema3E ekspresjon og hurtig celle motilitet, for eksempel P0-3E-
1 og P4 cellene var vanligvis spindel-formet med en bi-polar eller multi-vinkel fibroblastoid utseende (fig. 4A og B), mens P0, P0 -3E-
10, P4 /si3E, og P0-3E-
1 /siD1 celler som hadde lav Sema3E /Plexin-D1 aktivitet og lav vandrende evne, opprettholdt en høyere prosentandel av runde former med en brostein lignende utseende (fig. 4A og B). Vi undersøkte denne korrelasjonen i detalj, ved å spore individuelle OEC celle trekkruter og utføre time-lapse fotografering under sårhelende analysen. I motsetning til visninger som er generert fra steady-state bilder, time-lapse fotografering avdekket en dynamisk mønster av cytomorphological sykling mellom runde, bipolar og multiangular figurer som ble observert for alle OEC celler ble undersøkt (fig. 4C). Vi fant ut at Sema3E /Plexin-D1 aktivitet betydelig påvirket tiden ble observert OEC celler i en rund form. Dermed P0 og P0-3E-
1 /siD1 opprettholdt en runde morfologi lenger enn P4 og P0-3E-1 celler som raskt overført gjennom rund form og kommet raskt inn i en polarisert spindel form (fig. 4C og E) . Videre enkelt celle sporing avslørte at OEC celler med Sema3E /Plexin-D1 signale tendens til å være i bevegelse i én retning for en lang avstand, men celler med lav-Sema3E /Plexin-D1 aktivitet ofte stoppet og endret sin vandrende banen (fig. 4D ). Som en konsekvens, P4 og P0-3E-
1 celler kan bevege seg raskt i en retning for en lang avstand, mens P0 og P0-3E-
1 /siD1 celler stoppet opp, stadig endret retninger, og var ikke i stand til å bevege seg langt i en retning (fig. 4D). Dette samsvarer godt med den generelle trekkende evner av ulike Seam3E-uttrykke OEC celler i sårhelende analysen. Mer intrigere, den cytomorphological overgangen fra runde til spindel form som er sterkt knyttet til oppkjøpet av cellemotilitet ligner på fenomenet såkalte epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [22], noe som tyder på at Sema3E /Plexin-D1 signalering i OEC celler kan være involvert i EMT prosessen.
A. Representative bilder av tre forskjellige celleformer av OEC celler som runde, bi-polar og multi-kantete. B. Kvantifisering av prosentandel av hver morfologi i en samlet befolkning (n≥400) av OEC kloner med variabel aktivitet Sema3E /Plexin-D1. C, D, E. tidsforsinkelses tracing (opp til 200 minutter med 20 min intervaller tracing) for de morfologiske dynamikken i enkelt OEC celler i et sårhelende prosess (C). Enkelt OEC trekkveier ble plottet (D). Piler indikerer starten av hver tracing, og fargede prikker angir posisjonen til spores celle på hvert tidspunkt. Hvert trinn i den vandrende sekvensen ble merket med tallene samme som i (C). Baren graf i (E) oppsummert gjennomsnittlig tidsintervallet som brukes av hver OEC celle på hver distinkt cellen form. *,
P
. 0,05, sammen
t
-test
Sema3E /Plexin-D1 signaler gjennom PI3K og MAPK å indusere atom Snail1 trans og epitel -til-mesenchymale overgang
i løpet av EMT, celler ofte mister sine epitel molekylære markører og skaffe markører for mesenchymalceller [23] – [26]. Vi har derfor undersøkt den molekylære profilen til forskjellige OEC kloner for å bestemme hvorvidt Sema3E-induserte morfologiske forandringer var assosiert med en EMT hendelse. E-cadherin, en epitelial markør, ble nedregulert i Sema3E-uttrykkende OEC-celler i en Sema3E-konsentrasjonsavhengig måte, mens mesenchymale markører vimentin og fibronektin ble oppregulert (Fig. 5A, B, og data ikke vist). I motsetning til RNAi-knockdown av Plexin-D1 i Sema3E-uttrykkende celler opphevet Sema3E-induserte molekylære endringer som er karakteristiske for EMT (Fig. 5A og C). ble observert Lignende Sema3E assosierte forandringer av EMT markører når celler ble undersøkt av konfokal immun-fluorescerende mikroskopi (fig. 5C og S4A). I tillegg farging for trådformede aktin i Sema3E-uttrykke celler identifisert filopodia og lamellipodia dannelse typisk for EMT-indusert cytoskeletal endringer, men dette ble ikke observert i celler med lav Sema3E /Plexin-D1 uttrykk (Fig. 5C, topp paneler).
A, B. Ekspresjon av cellulære markører for EMT korrelerer med nivåer av Sema3E /Plexin-D1-aktivitet i modifiserte OEC-celler som målt ved semi-kvantitativ RT-PCR (A) og Western blotting (B). Derimot, er medlemmer av Snail familien transkripsjonsfaktorer som regulerer utviklings EMT jevnt uttrykt i modifiserte OEC cellelinjer. Signal intensiteter ble normalisert til
GAPDH product: (A) eller œ-Tubulin (B), henholdsvis, og er angitt som forholdstall. C, D. Konfokalmikroskopi av OEC celler viser en dreining fra epitel (E-cadherin) til mesenchymale (vimentin) markør uttrykk og en tydelig kjernefysisk translokasjon av Snail1 i modifiserte OEC celler som utviser større Sema3E /Plexin-D1 aktivitet. Immunoreaktiviteten for filamentøs aktin, og atom DAPI farging ble anvendt som generelle markører for cellemorfologi. Scale bar, 20 mikrometer. E. Nuclear lokalisering av Snail1 er forbundet med høy grad av menneskelig OEC vev, men ikke lavgradige menneskelige OEC vev. Snail1 ble ikke påvist i eggstokkene endometriose. Scale bar, 10 mikrometer. F. E-cadherin promoter aktivitet, målt ved normalisert luciferaseekspresjon i modifisert OEC linjer, er nedregulert i celler med høy Sema3E /Plexin-D1 signalering. Dette er avhengig av Snail1 trans siden knockdown av Snail1 eller en mutert E-boks forhindrer transkripsjonen undertrykkelse. Feilsøylene viser standardavvik, n = 9. **,
P
0,01, *,
P
0,05, sammen
t
-test. G. Western blot illustrere RNAi-mediert knockdown av Snail1 i Sema-3E uttrykke P0-3E-
1 celler via lenti-virusinfeksjon. H. knockdown av Snail1 uttrykk i P0-3E-
1 celler avtar migrasjon i sårheling analysen. I. knockdown av Snail1 i P0-3E-
1 celler induserer et skifte fra spindel formet, vimentin positiv til en avrundet, E-cadherin positive cellulære morfologi. Scale bar, 10 mikrometer. J, K. Farmakologisk-indusert oppbevaring av kjernefysisk Snail1 ved leptomycin B (20 ng /ml) øker vandrende egenskaper og induserer en spindel formet cellulær morfologi i P0 celler. Scale bar, 10 mikrometer.
En viktig regulator av EMT under embryonal utvikling og tumorprogresjon er sneglen familie av sink finger transkripsjonsfaktorer, hvorav Snail (Snail1) og Slug (Snail2) er den mest intensivt studert [27] – [29]. Mange epiteliale kreftceller induserer EMT via oppregulering av Snail1 mediert transkripsjon [22]. Men gjorde Sema3E uttrykk i OEC cellene ikke endre mRNA eller protein nivåer av Snail1 (eller Snail2 og Twist) (Fig. 5A og B). Funksjonen til Snail1 alternativt kunne modulert av sin subcellulære lokalisering slik at kjernefysisk translokasjon av cytosoliske Snail1 er nødvendig for tilgjengelighet av målet arrangører [30], [31]. Vi undersøkte om Sema3E /Plexin-D1 signal modulert den subcellulære lokalisering av Snail1 i OEC celler. Immuno-fluorescens mikroskopi viste en blandet populasjon av celler som med OEC Snail1 enten overveiende lokalisert i kjernen, eller i cytoplasma. Men kjernefysiske lokalisering av Snail1 positivt korrelert med Sema3E /Plexin-D1 aktivitet. I celler med høy Sema3E /Plexin-D1-aktivitet slik som P0-3E-
1-celler, mest utviste fremherskende nukleær lokalisering av Snail1 (64% ± 8% [middelverdi ± standardavvik for tre eksperimenter]), mens de fleste celler med lav Sema3E /Plexin-D1-aktivitet vises en overveiende cytosoliske fordeling av Snail1 (for eksempel: P0, 78% ± 6% cytosoliske Snail1 lokalisering) (figur 5D.). I tillegg immunhistokjemi av Snail1 i menneskelige eggstokkene endometrioid karsinom avslørte at høyverdig svulster hadde en høyere andel av kreftceller med atom Snail1 og lavgradige svulster hadde overveiende cytosolic Snail1 lokalisering (Fig. 5E). I motsetning til dette ble ingen Snail1 ekspresjon observert i endometriose cyste-foring celler (fig. 5E). Disse observasjonene tyder på at Sema3E /Plexin-D1 signalisering i eggstokkene endometrioid kreftceller kan indusere EMT gjennom kjernefysisk translokasjon av Snail1.
For å avgjøre om Snail1 er en nedstrøms responsive element for Sema3E /Plexin-D1 signalisering i OEC celler i sammenheng med EMT og celle motilitet, testet vi om den transkripsjonelle nedregulering av epitel cellemarkør E-cadherin i respons til Sema3E /Plexin-D1 signalering er avhengig av Snail1. Som vist på fig. 5F, luciferase promoter aktivitetsanalyse viste at celler med høy Sema3E /Plexin-D1 aktivitet utviste undertrykte promoteraktivitet av E-cadherin (for eksempel sammenligne P0-3E-
1 celler med P03E /siD1 eller P0 celler). I motsetning mutasjon i E-boks (et mål anerkjent av Snail1) eller RNAi-knockdown av Snail1 resulterte i tap av undertrykkelse i E-cadherin promoter aktivitet gitt av Sema3E /Plexin-D1. I tillegg kan knockdown av Snail2 i P0-3E-
1 celler ikke disinhibit undertrykt promoteraktivitet av E-cadherin (fig. 5F). Vi fant også at RNAi-knockdown av Snail1 i Sema3E-uttrykkende celler forårsaket spindelformede celler tansformed inn rundere form og uttrykk for E-cadherin og vimentin samtidig tilbakevendt (fig. 5G og jeg), noe som indikerer at Snail1 er nødvendig for Sema3E indusert EMT. I tillegg er den forbedrede vandrende evnen gitt av Sema3E i P0-3E-
1-celler ble redusert når Snail1 ble RNAi-utarmet men uendret av RNAi-uttømming av Snail2 (fig. 5H). Tvert imot, tvunget retensjon av Snail1 i kjernen ved leptomycin B behandling i Sema3E-negative P0-celler økt celle trekkende evne og resulterte i transformasjon inn i spindelformede celler (fig. 5J og K). Dette tyder på at Snail1 trans inn i kjernen funksjoner nedstrøms Sema3E signale å formidle celle morfologi og motilitet. Time-lapse sporing av Snail1 subcellulære lokalisering i forhold til cellemorfologi og vandringshastigheten viste en sammenheng mellom Snail1 nukleære lokaliserings og spindelen celleform, så vel som med øket vandringshastighet (fig. S4B, C og D). Sammen er disse studiene indikerer at Sema3E /Plexin-D1 signalisering i eggstokkene endometrioid kreftceller kan regulere Snail1 translokasjon til kjernen for å indusere EMT og samtidig øke cellemotilitet.
Den intracellulære signalveien (e) som kan regulere Sema3E /Plexin-D1 mediert translokasjon av Snail1 og påfølgende EMT i OEC celler ble undersøkt ved å teste effekten av en rekke kjente kinase hemmere på cellemotilitet og Snail1 subcellulære lokalisering. Inhibering av p38 mitogenaktivert proteinkinase (SB203580), protein kinase C (GF109203X), og Jun N-terminal kinase (SP600125) i Sema3E-uttrykkende OEC-celler hadde ingen virkning på Sema3E-utvidet cellemigrasjon eller på Snail1 nukleær lokalisering. I motsetning til inhibering av fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) (LY294002 og Wortmannin) eller ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) /mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) (PD98059) aktivitet resulterte i cytosol oppbevaring av Snail1 og en samtidig reduksjon i vandrende egenskaper gitt av Sema3E (fig. 6A, B og C). Immuno-blotting viste også at Sema3E ekspresjon korrelerte med fosforylert ERK1 /ERK2 uttrykk, som reduseres ved behandling PD98059 (fig. 6D). Disse studiene tyder på at aktivert PI3K og ERK /MAPK er de viktigste intracellulære signalkomponenter transduse Sema3E /Plexin-D1 mediert Snail1 atomtrans.
A, Cell transwell invasjon analysen av P0-3E-
1 celler avslører en betydelig reduksjon i vandrende celle aktivitet følgende farmakologisk hemning av PI3 kinase (LY294002, eller Wortmannin) og ERK /MAPK (PD98059), men ikke p38-mitogen aktivert proteinkinase (SB203580), PKC (GF109203X), eller Jun-N-terminal kinase ( SP600125). Scale bar, 30 mikrometer. **
P
0,01, *,
P
0,05, sammen
t
-test.
