Abstract
Cancer stamceller (cscs) representerer en unik sub-populasjon av tumorceller med evne til å initiere tumorvekst og opprettholde selvfornyelse. Selv om CSC biomarkører er blitt beskrevet for forskjellige tumorer, har bare noen få markører blitt identifisert for nasofaryngealt carcinom (NPC). I denne studien, viser vi at CD24
+ celler isolert fra humane NPC cellelinjer uttrykke stamcelle gener (
Sox2
,
Oct4
,
Nanog
,
Bmi-en
, og
Rex-en
), og viser aktivering av Wnt /β-catenin signalveien. CD24
+ celler har typiske CSC egenskaper som inkluderer forbedret cellevekst, økt koloni og sfære formasjon, vedlikehold av celledifferensiering potensial i langvarig kultur, og forbedret motstand mot cellegifter. Spesielt, CD24
+ celler produsere tumorer etter inokulering av så få som 500 celler i immunodeficient NOD /SCID-mus. CD24
+ celler ytterligere viser økt invasjon evne
in vitro
, som korrelerer med forbedret uttrykk for matriksmetalloproteinase 2 og 9. I sammendraget, våre resultater tyder på at CD24 representerer en roman CSC biomarkør i NPC.
Citation: Yang CH, Wang HL, Lin YS, Kumar KPS, Lin HC, Chang CJ, et al. (2014) Identifisering av CD24 som en Cancer Stem Cell Marker i Human Nasofaryngeal Carcinoma. PLoS ONE 9 (6): e99412. doi: 10,1371 /journal.pone.0099412
Redaktør: Masaharu Seno, Okayama University, Japan
mottatt: 04.07.2013; Godkjent: 14 mai 2014; Publisert: 23 juni 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd NSC101-2325-B-182-005 og NSC101-2320-B-030-011 fra National Science Council of Taiwan, og gi CMRPD1B0052 fra Chang Gung Memorial Hospital (Linkou, Taiwan). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
NPC hyppigheten varierer over hele verden, men er høyest i Sørøst-Asia, spesielt i den kinesiske provinsen Guangdong samt i Hong Kong og Taiwan [1]. Mellom NPC forekomsten er observert i land i Middelhavet sammen med Grønland og Alaska, mens en lav forekomst er funnet i de fleste vestlige land [2]. I Taiwan, var forekomsten av kvinner og menn i 2007 var 2,93 og 8,41 tilfeller per 100.000 personer, henholdsvis [3]. NPC viser som regel forholdsvis høy følsomhet for stråling, og radioterapi forblir således den viktigste behandling for tidlig stadium NPC [4], [5]. Selv om kombinasjonen av strålebehandling og kjemoterapi har bedret behandlingsresultatene for pasienter med avansert stadium NPC, kreft tilbakefall skjer fortsatt ofte [6].
Identifisering og karakterisering av tumor initiere celler, også kalt kreftstamceller (cscs ), har avdekket cellulære mekanismene som kunne står for refraktær mot behandlingen og sovende oppførselen til mange svulster [7]. Den stamcelle hypotesen om kreftutvikling antyder at bare en liten sub-populasjon av celler i en tumor (den cscs) har stilk-lignende egenskaper og evnen til å initiere nye tumorer [8]. Cscs kan ikke bare initiere primære svulster, men kan også være ansvarlig for tilbakefall etter behandling, et fenomen som kan være på grunn av den selvfornyelse kapasitet og iboende kjemo- og radio-motstand av disse cellene [9]. Cscs har blitt identifisert og isolert fra ulike svulster ved hjelp av spesifikke celleoverflatemarkører, inkludert CD44 for hode og nakke kreft [10], CD133 for prostatakreft [11], CD90 for levertumor [12], CD24 for eggstokkreft [13], CD133 for hjernesvulst [14], CD44
+ CD24
-. /lav for brystkreft [15], og CD133 for lungekreft [16]
Selv om spesifikke biomarkører har blitt brukt til å isolere cscs, hver type tumor viser spesifikke celleoverflatemarkører [17]. For å isolere potensielle under bestander av cscs fra svulster som CSC biomarkører ennå ikke er identifisert, har forskere gjort bruk av muligheten for cscs å ekskludere de fargestoffer, Hoechst 33342 eller PKH26 [18] – [20]. Ved hjelp av denne metoden, har en sub-populasjon av celler som viser CSC egenskaper blitt identifisert i NPC [21], [22]. Imidlertid isolering av NPC cscs ved hjelp av celleoverflatemaskin har ikke vært mulig hittil, med unntak av CD44, som ble identifisert i en tidligere rapport [23]. I denne studien beskriver vi isolering av en sub-populasjon av CD24
+ celler fra to NPC cellelinjer, og vise at de isolerte celler uttrykker stamcelle genmarkører. Den isolerte CD24
+ celler utviser typiske CSC egenskaper, og initiere tumorvekst i ikke-overvektige diabetikere /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus på et lavt celle nummer. Høyere invasjon evne og øket ekspresjon av metalloproteinase 2 og 9 (MMP2 og MMP9) ble også observert. Våre observasjoner tyder på at CD24
+ celler representerer et CSC biomarkør i menneskelig NPC. Disse funnene kan føre til utvikling av nye terapeutiske strategier for å målrette NPC cscs hos mennesker.
Resultater
Isolering av en sub-populasjon av CD24
+ celler fra NPC cellelinjer
For å karakterisere celler med bestemte celleoverflatemarkører, analyserte vi flere NPC cellelinjer ved hjelp av flowcytometri og monoklonale antistoffer som gjenkjenner celleoverflate biomarkører. Vi har fastslått at prosentandelen av celler som en av 12 overflatemarkører spesifikke for stamceller [24], [25] eller kreftceller [26] (Tabell 1). CD24 er funnet på 12,03% av dyrkede celler og TW02 på 5,45% av TW04 celler, mens det ble funnet på en lavere prosentandel av celler som for de andre NPC-cellelinjene som ble testet (tabell 1 og figur 1). Prosentdelen av celler som de andre 12 markørene var meget ujevn, med verdier mellom 0 og 99,99% (tabell 1). I samsvar med en tidligere studie hvor CD44 ble identifisert som en CSC biomarkør i NPC [23], våre resultater viser at det store flertallet av CD24
+ celler ble også CD44 + (figur 1). Vi har derfor fokusert vår oppmerksomhet på CD24
+ celler som potensielle CSC kandidater.
Flowcytometri analyse av CD24
+ og CD44
+ sub-populasjoner av TW02 og TW04 celler. 1 x 10
6 kreftceller ble samlet opp og farget med anti-human CD24-fluorescein-isotiocyanat (FITC) og /eller anti-human CD44-fykoerytrin (PE) antistoffer. Isotype-matchet humane antistoffer fungerte som kontroll.
Uttrykk for stamcelle gener og aktivering av Wnt /β-catenin banen i CD24
+ celler
Å undersøke om CD24
+ celler har iboende stamcelleegenskaper, analyserte vi uttrykket av fem embryonale stamcelle gener (
Sox2 product: [27],
Oct4 product: [28] – [30] ,
Nanog product: [31],
bMI-1 product: [32], og
Rex-1 product: [33]) i TW02 og TW04 cellelinjer som ble brukt som representant NPC celler. Som antydet på figur 2A, CD24
+ -celler gående uttrykte høye nivåer av de fem stamcelle gener enn foreldre eller CD24
-.-Celler
(A) mRNA-ekspresjonsnivåene av
Sox2
,
Oct4
,
Nanog
,
Bmi-1 Hotell og
Rex-en
i foreldre, CD24
+ og CD24
– celler fra NPC cellelinjer, TW02 (til venstre) og TW04 (til høyre), ble evaluert ved hjelp av kvantitativ RT-PCR-analyse. Resultatene vist representerte gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. *:
p
0,05, **:
p
0,01. (B) Western blot analyse av fosforylert-GSK, GSK, fosforylert-β-catenin, β-catenin og β-aktin i helcellelysater, og av β-catenin og lamin B1 i kjernefysiske fraksjoner av foreldre, CD24
+ og CD24
– celler isolert fra TW02 og TW04 cellelinjer. Kvantitativ resultat ble beregnet ved ImageJ programvare. *:
p
0,05, **:
p
0,01, ***:.
p
0,001
Tidligere rapporter har vist at aktivering av Wnt /β-catenin signalveien er avgjørende for opprettholdelse av cscs i leukemi [34], brystkreft [35], melanom [36], kolorektal adenom [37], og leverkreft [ ,,,0],38]. Denne mobil pathway regulerer også selvfornyelse, spredning og differensiering av kreft stilk-lignende celler i magekreft [39]. Videre i Wnt veien, spiller β-catenin en avgjørende rolle i å regulere invasjon og metastasering av en rekke svulster [40]. Vi undersøkte derfor status for Wnt /β-catenin bane i den isolerte CD24
+ -celler. Nivåer av fosforylert β-catenin ble betydelig redusert i cytosol av CD24
+ celler, sammenlignet med foreldre eller CD24
– celler (figur 2B). I tillegg nivåer av fosforylert glykogensyntasekinase 3β (p-GSK-3β), som virker som en negativ regulator av β-catenin, var høyere i CD24
+ -celler. Samtidig ble det observert økte nivåer av β-catenin i kjernefysiske fraksjoner av CD24
+ celler (figur 2B), noe som tyder på at Wnt /β-catenin signalveien er aktivert i disse cellene.
Forbedret spredning og klone /sfære formasjonen i CD24
+ celler
Vi målte spredning rate av CD24
+ celler dyrket i fullstendig DMEM. Sammenlignet med foreldrenes og CD24
– celler, CD24
+ celler viste forbedret spredning, som starter på 5
th dag med kultur for TW02 celler og 7
th dag for TW04 celler, med doblingstidene på omtrent 42 h, 42 h og 30 h for foreldre TW02, CD24- og CD24 + -celler, respektivt, og 40 h, 40 h og 28 h for foreldre TW04, CD24- og CD24 + -celler (figur 3A). Klone formasjon effektivitet (CFE) av CD24
+ celler ble også bestemt. Etter 10 dagers dyrking, da de fleste kloner var sannsynlig å inneholde mer enn 50 celler, de beregnede CFE verdiene av TW02 celler var 15,1%, 80,8% og 12,2% for foreldre, CD24
+ og CD24
– celler, henholdsvis. For TW04 celler, ble CFE verdier på 20,2%, 90,3% og 13,0% oppnådd for foreldre, CD24
+ og CD24
– celler, henholdsvis (figur 3B). Dannelsen av sfæroide celleaggregater (eller ganske enkelt kuler), som er et tegn på selvfornyelse evne, ble videre analysert ved å dyrke cellene i ikke-adherente betingelser bestående av serumfritt DMEM inneholdende bare epitelial vekstfaktor (EGF) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF). Etter 30 dager med kultur, CD24
+ celler viste det høyeste antall kuler, og nådde en diameter mellom 100 og 200 nm, mens foreldre celler og CD24
– celler dannet betydelig færre kuler med diameter under 100 mikrometer (Figur 3C ). Disse resultatene indikerer at CD24
+ celler viser økt spredning og evne til å danne kloner /kuler
(A) celleproliferasjon kurver av foreldre, CD24
+ og CD24
-. Celler fra TW02 (til venstre) og TW04 (til høyre) NPC cellelinjer dyrket i komplett DMEM for 9 dager. Resultatene som er vist representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. *:
p
0,05, **:
p
0,01, ***:
p
0,001. (B) Clone dannelsen effektiviteten av foreldre, CD24
+ og CD24
– celler, og kvantifisering analyse. *:
p
0,05. (C) Sphere dannelsen evne til foreldre, CD24
+ og CD24
– celler dyrket i DMEM supplert med 20 ng /ml bFGF og 20 ng /ml EGF i 30 dager. (D) Effekt av Wnt inhibitor på sfære dannelsen av CD24
+ celler i TW02 og TW04 celler. CD24
+ celler ble behandlet eller ikke med Wnt inhibitor ICG-001 (10 mm) i syv dager før sfære formasjon analyse. Skala barer:. 100 mikrometer
Vi undersøkte også effekten av Wnt inhibitor ICG-001 på kula dannelsen evne CD24
+ celler. Etter behandling med Wnt inhibitor i 7 dager (10 mm), ble sfære størrelse betydelig redusert med et gjennomsnitt på 20% og 45% i TW02 og TW04 celler, henholdsvis (figur 3D), noe som tyder på at Wnt veien kan bidra til CSC fenotype av CD24
+ celler.
langsiktig differensiering potensialet av CD24
+ -celler
En langsiktig kultur for cscs kan øke sin cellemasse, men også gjennomgå asymmetrisk divisjon for å generere en lav tumorigen cellepopulasjon med heterogene fenotyper [9]. For å overvåke celledifferensiering potensialet CD24
+ celler, analyserte vi 10 dager gamle kulturer av CD24
+ og CD24
– celler ved flowcytometri. Etter dyrking TW02 celler for 10 dager, 11,56% av CD24
+ celler forble CD24
+, mens 0,14% av cellene som var utgangspunktet CD24
– uttrykt CD24 etter kultur (Figur 4A). Ved å følge kulturen TW04 celler, 5,64% av CD24
+ celler forble CD24
+, mens 0,03% av celler som var CD24
– i utgangspunktet var CD24
+ etter kultur (figur 4B). Disse resultatene tyder på at CD24
+ celler viser celledifferensiering potensial etter langvarig kultur, selv om den differensieringsprosessen kan være bare delvis under disse betingelsene.
(A) ti dager gamle cellemasser opprinnelig dyrket fra CD24
+ og CD24
– cellekulturer i DMEM medium ble høstet, og farget med anti-human CD24-fluorescein (FITC) antistoff etterfulgt av flowcytometri analyse. Prosentene vises, representerer celler med CD24
+ overflatemarkører fra enten (A) TW02 eller (B) TW04 cellelinjer. Flowcytometri analyse av TW02 og TW04 celler umiddelbart etter sub-fraksjonering (høyre panel).
CD24
+ celler viser økt resistens mot cellegifter
Høyere motstand mot cellegifter representerer et kritisk trekk ved cscs [9]. Tidligere studier har rapportert at cscs kan utelukke den DNA-bindende fargestoff, Hoechst 33342, på grunn av økt ekspresjon av ABC-transportør, ABCG2 [41], [42]. For å avgjøre om CD24
+ celler utelukke Hoechst 33342 bedre enn foreldrenes eller CD24
– celler, utførte vi fargestoffet utelukkelse analysen etter behandling TW02 celler med ABC transportør hemmer, verapamil [43]. Som vist i figur 5A, er en større populasjon av Hoechst 33342-negative celler som ble observert for CD24
+ celler (12,9%) sammenlignet med CD24
– celler (7,99%). Spesielt, verapamil behandling reversert fargestoff utelukkelse fenotype observert i CD24
+ celler, mens denne behandlingen hadde ingen signifikant effekt på CD24
– celler (figur 5A). Lignende resultater ble oppnådd for den TW04 cellelinje (verapamil produserte ingen signifikant effekt i dette tilfellet siden nesten ingen TW04 CD24
– celler ble Hoechst 33342-negative). Disse observasjonene tyder på at CD24
+ celler har en forbedret evne til å utelukke fargestoff
(A) Ordnet CD24
+ og CD24
-. Celler fra TW02 og TW04 NPC cellelinjer ble behandlet eller ikke med 50 uM verapamil i 30 minutter før behandling for Hoechst 33342 fargestoff utelukkelse analyse som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) Parental, CD24
+ og CD24
– celler fra TW02 eller TW04 cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin og docetaxel i 24 timer, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av MTT-analysen. CD24
+ celler viste høyere levedyktighet enn foreldre og CD24
– celler etter behandling med enten cisplatin eller docetaxel. Resultatene vist representerte gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. *:
p
0,05, **:
p
0,01, ***:
p
0,001. IC
50 verdier av cisplatin eller docetaxel behandling mot foreldre, CD24
+ og CD24
-. Celler ble vist for (C) TW02 og (D) TW04 cellelinjer
for å undersøke om CD24
+ celler viser høyere motstand mot cellegifter, behandlet vi cellene med enten cisplatin eller docetaxel, og vurderes celleviabilitet hjelp av MTT analysen. Cisplatin og docetaxel gitt høyere cytotoksiske effekter mot foreldrenes eller CD24
– celler sammenlignet med CD24
+ celler (figur 5B,
p
0,01). For TW02 cellelinje, den halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) av cisplatin mot foreldre, CD24
+ og CD24
– celler var 1,84, 3,32 og 1,66 ug /ml, respektivt, mens IC
50 verdier av docetaxel mot foreldre, CD24
+ og CD24
– celler var 4,23, 7,45 og 3,53 mikrogram /ml, henholdsvis (figur 5C). For TW04 cellelinje, cisplatin produsert IC
50 verdier av 0,70, 2,45 og 0,46 mikrogram /ml mot foreldre, CD24
+ og CD24
– celler, henholdsvis mens IC
50 av docetaxel var 1,50, 3,93 og 1,41 mikrogram /ml mot foreldre, CD24
+ og CD24
-. celler, henholdsvis (figur 5D)
Vi har også observert at protein nivåer av ABC transportør ABCG2 var 1,42 og 2,12 ganger høyere i CD24
+ celler enn i foreldre og CD24
– celler, henholdsvis (figur 6a). Tilsvarende i TW04 celler, protein nivåer av ABCG2 i CD24
+ celler var 1,85 og 3,56 ganger høyere enn i foreldre og CD24
– celler, henholdsvis (figur 6a). I samsvar med disse resultatene, mRNA uttrykk nivået av
ABCG2
var høyere i CD24
+ celler enn i foreldrenes eller CD24
– celler (Figur 6b). Disse resultatene indikerer at CD24
+ celler viser forbedret chemoresistance, og at denne fenotype kan tilskrives i det minste delvis for å forbedre ekspresjonen av ABCG2 transportør.
(A) Celle ABCG2 proteinnivåer i foreldre, CD24
+ og CD24
– TW02 og TW04 celler ble bestemt ved Western blot analyse. Kvantitativ resultat ble beregnet ved ImageJ programvare. *:
p
0,05, **:
p
0,01. (B) Et mRNA-ekspresjon nivået av ABCG2 i foreldre, CD24
+ og CD24
– TW02 og TW04 celler ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Resultatene som er vist representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. *:
p
0,05, **:.
p
0,01
Et lite antall CD24
+ celler er tilstrekkelig til å produsere svulster i NOD /SCID mus
Vi testet tumorigent potensialet CD24
+ celler etter injeksjon i armhulen fossa av immunodeficient NOD /SCID-mus. Tolv uker etter injeksjon, ble tumorer detektert i mus inokulert med enten 500 eller 1000 CD24
+ -celler, men ikke i mus behandlet med 100 CD24
+ celler (figur 7A). I motsetning til dette ble ingen tumorer detektert i mus inokulert med ≤1,000 celler i den parentale eller CD24
– gruppe (figur 7A og 7B). Det ble heller ikke påvist tumorer i mus som fikk PBS som en negativ kontroll (figur 7A). Videre histologisk analyse av vevssnitt farget med hematoksylin og eosin (H E) bekreftet tilstedeværelsen av nasofaryngeale karsinomer og godt differensiert keratiniserende plateepitel carcinom på stedet der CD24
+ celler ble først injisert (figur 7C). Injeksjon av et lite antall CD24
+ celler er således tilstrekkelig til å indusere tumordannelse hos mus med immunsvikt.
(A) Dannelse av tumorer etter injeksjon av CD24
+ -celler. Grupper på seks NOD /SCID-mus ble injisert med 100, 500 eller 1000 fersk-sortert CD24
+ eller CD24
– celler fra TW02 (venstre) eller TW04 (høyre) cellelinje. Mus injisert med PBS ble anvendt som en negativ kontroll. Svulstdannelse ble vurdert 12 uker etter inokulering celle. (B) Mus injisert med TW02 (venstre) eller TW04 (høyre) celler ble avlivet for vurdering av tumordannelse tolv uker etter inokulering. Pilene indikerer tilstedeværelse av svulster i mus injisert med 500 eller 1000 CD24
+ -celler. (C) Tissue H E flekker resultatene av TW02 (til venstre) og TW04 (høyre) mus inokulert med 500 celler. Inokulering av så få som 500 CD24
+ celler produsert histologiske tegn på svulster på injeksjonsstedet.
Forbedret invasjon potensial og metalloproteinase produksjon i CD24
+ celler
I tidligere studier, mange CSC populasjonene viste økt invasjon evne sammenlignet med ikke-cscs [44], [45]. Ved hjelp av en in vitro invasjon analysen, observerte vi at CD24
+ celler var mer omfattende enn foreldre eller CD24
– celler (figur 8A). Gitt at metalloproteinaser spiller en viktig rolle i celle invasjon [46], undersøkte vi nivået av MMP2 og MMP9 proteiner i disse cellene. Som vist i figur 8B, CD24
+ celle populasjoner viste økt MMP2 og MMP9 protein nivå sammenlignet med foreldre eller CD24
– celler. I samsvar med disse resultatene, observerte vi at CD24
+ celler isolert fra de TW02 eller TW04 cellelinjer uttrykte høyere nivåer av MMP2 og MMP9 mRNA enn foreldrenes eller CD24
– celler (Figur 8C). CD24
+ celler uttrykte også lavere E-cadherin mRNA nivåer enn foreldrenes eller CD24
– celler (Figur 8C). CD24
+ -celler således viser forbedret invasjon og økt ekspresjon av MMP2 og MMP9 men redusert ekspresjon av E-cadherin.
(A) Celle invasjon analysen ble utført ved anvendelse av transwellkammeret analysen, som beskrevet i Materialer og metoder. Matrigel-membraner inneholdende invaderende celler ble observert ved optisk mikroskopi, og cellene ble tellet. Antallet av invaderende celler fra hver cellepopulasjon ble kvantifisert. Resultatene vist ble innhentet fra tre uavhengige forsøk. **:
p
0,01, ***:
p
0,001 (B) Nivåene av MMP2 og MMP9 protein produsert av foreldre, CD24
+, eller CD24
– celler fra TW02 og TW04 cellelinjer ble kvantifisert ved Western blotting-analyse. Kvantitativ resultat ble beregnet ved ImageJ programvare. *:
p
0,05. (C) Et mRNA ekspresjonsnivåer av MMP2 og MMP9 i foreldre, CD24
+ og CD24
– celler ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR fra TW02 og TW04 cellelinjer. Resultatene som vises representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige forsøk. *:
p
0,05, **:.
p
0,01
Diskusjoner
Resultatene fra denne studien tyder at CD24 representerer en ny CSC overflatemarkør i NPC. Karakteristikken av CD24
+ celleunderpopulasjoner isolert fra TW02 og TW04 NPC cellelinjer som er lik de som tidligere er rapportert for cscs avledet fra NPC [21] – [23]. Disse egenskapene inkluderer økt ekspresjon av gener som er involvert i utvikling og vedlikehold av stamceller, øket selvfornyelse og vedlikehold av celledifferensiering kapasitet etter langvarig kultur, økt sfære formasjon evne (også observert hos CD24
+ celler isolert fra NPC-cellelinjer Ht1 og TW076, se figur S1), økt Hoechst 33342 fargestoff eksklusjon og chemoresistance, økt evne til å initiere svulster i immunsupprimerte mus, og forbedret celle invasjon
celle~~POS=TRUNC, CD24, er sterkt uttrykt i mange menneske. -kreft [13], [48], [49]. CD24 uttrykt på kreftceller reagerer med P-selektin som finnes på endotelceller, noe som indikerer at CD24 kan binde til P-selektin og initiere valsing av kreftceller på endotelet, som kan bli etterfulgt av initiering av metastase [47]. I tillegg til NPC-celler, er assosiert med CD24 cscs av andre tumorer, slik som ovarie [13] og kreft i bukspyttkjertelen [48]. For eksempel, CD24
+ CD44
+ ESA
+ kreft i bukspyttkjertelen celler har CSC egenskaper [48]. Nylig ble et lignende funn er rapportert for ovarian cscs; det vil si en xenograft injeksjon av 5000 CD24
+ celler produsert svulster i nakne mus, mens injeksjon av et likt antall CD24
– celler klarte å gjøre det [49]. I tillegg CD24
+ kreftcellekolonier isolert fra ovarietumorer av en menneskelig pasient viste heterogenitet i proliferasjonsrate, cellesyklus distribusjon og uttrykk profil av gener og proteiner, og demonstrerte stamcelleegenskaper [49]. Videre CD24
+ stilk-lignende celler oppdages i eggstokkreft også utstilt forbedret chemoresistance [50]. Spesielt, i brystkreft, fravær av CD24 kombinert med tilstedeværelsen av CD44 og EpCAM (CD24
-CD44
+ EpCAM
+) ser ut til å være kritisk for identifisering av bryst cscs [15]. En tidligere studie har rapportert at CD44 representerer en CSC biomarkør i NPC [23]. I samsvar med dette funnet, den CD24
+ celler som vi isolert fra TW02 og TW04 NPC cellelinjer var for det meste CD44
+ (figur 1B). Dessuten, de aller fleste av CD24
+ celler i Ht1 og TW076 cellelinjer ble også CD44
+ (figur S2). Både CD24 og CD44 kan således være involvert i dannelsen av cscs i NPC, og funksjonen av disse proteinene i utvikling og vedlikehold av cscs garanterer videre etterforskning.
Vi observerte at CD24
+ celler isolert fra de TW02 og TW04 NPC cellelinjer uttrykke høyere mRNA nivåer av
Sox2
,
Oct-4
,
Nanog
,
Bmi-en
, og
Rex-en
, sammenlignet med foreldre eller CD24
– celler. Et lignende fenomen ble også observert i Ht1 og TW076 cellelinjer (figur S3). Disse egenskaper er lik de som er rapportert for embryonale stamceller [27] – [33] og eggstokkreft stilk-lignende celler [51]. Dette mønsteret av embryonale stamceller genekspresjon i CD24
+ NPC cscs indikerer tilstedeværelsen av en konservert mønster av stamcelle genekspresjon i embryonale stamceller og cscs. I embryonale stamceller, co-uttrykk for
Sox2
,
Oct-4
,
Nanog
, og
Rex-en
er viktig for vedlikehold av pluripotency og selvfornyelse, og hindrer celledifferensiering langs trophoblast celle avstamning [30], [33].
Sox2 Hotell og
Oct-4
koder transkripsjonsfaktorer som opprettholder selvfornyelse og pluripotency i udifferensiert embryonale stamcelle tilstand ved å modulere gener som opprettholder givende kromatinstruktur og DNA-reparasjon, og hindre apoptose [ ,,,0],52]. På den annen side, et uttrykk for
Nanog
, som også er en transkripsjonsfaktor kritisk involvert i selvfornyelse, er positivt regulert av
Sox2 Hotell og
Oct-4
[53]. Disse transkripsjonsfaktorer danne et funksjonelt transkripsjonsregulering nettverk som er kritisk for opprettholdelse av pluripotency i embryonale stamceller [53]. Videre Polycomb gruppen (PCG) genet
Bmi-en
stillhet
Hox
gener via modulering av kromatinstruktur under embryonal utvikling i frukt fluer, og kan muligens øke proliferativ aktivitet av både normal og leukemiske stamceller [32]. Som uttrykk for
Bmi-en
er negativt regulert av
PTEN
, som fungerer som en tumor suppressor gen [54], økt uttrykk av
Bmi-en
kan korrelere med undertrykkelse av
PTEN
uttrykk og induksjon av epitelial-mesenchymale overgang, samt økt bevegelighet og invasivitet av menneskelige nasofaryngeale epitelceller [54]. Våre resultater viser at CD24
+ sub-populasjon av NPC celler uttrykker også stamcelle gener og viser kjennetegn ved stamcelleselvfornyelse og forbedret kapasitet spredning.
Wnt /β-catenin signalveien, som har blitt rapportert å regulere stamcelle funksjon og nisje-stamcelle interaksjoner [56], forbedrer uttrykk for
Sox2 Hotell og
Oct-4 product: [55]. Dessuten ble redusert E-cadherin mRNA-ekspresjon observeres ved Gao et al. i CD24
+ eggstokkreft stamceller [49]. Disse observasjoner tyder på at tapet av E-cadherin ekspresjon kan tillate β-catenin å re-lokalisere til kjernen og aktivere transkripsjonen aktivitet [57]. I denne studien ble økt fosforylering av GSK-3β, redusert fosforylering av β-catenin, og ble observert nukleær translokasjon av β-catenin i CD24
+ celler sammenlignet med foreldre eller CD24
– celler (figur 2). Disse observasjonene tyder på at Wnt /β-catenin signalveien er aktivert i CD24
+ celler
Våre funn at CD24
+ NPC celler er mer invasive enn foreldre eller CD24
-. NPC celler er i samsvar med resultatene fra tidligere studier om cscs i bukspyttkjertelen [58], lunge [19], og prostata kreft [59]. Sammen med den økte invasjonen evne, cellulære markører som kjennetegner celle invasjon, for eksempel MMP2 og MMP9, ble også økt på høyere nivåer i CD24
+ celler. MMP2 og MMP9 er involvert i degraderingen av den ekstracellulære matriks, og en økning i ekspresjon av begge enzymene induserer celle invasjon evne til [60]. Zhou et al. antydet at genetisk polymorfisme i MMP2 arrangøren kan forklare den økte følsomheten av kinesiske enkeltpersoner for å utvikle NPC [61]. Microarray analyse avslører at MMP1 og MMP2 er de fleste betydelig oppregulert gener i NPC biopsier, sammenlignet med lymphohyperplasia, adenoid vev, og hode og nakke kreft [62]. Videre studier utført på NPC tumor biopsier eller cellelinjer med forbedret invasivitet eller epitel-mesenchymale overganger avslørte også forbedret uttrykk for
Sox2
,
Oct-4
, og
Nanog
[63] – [66], i likhet med de funnene som presenteres her på CD24
+ celler. Disse resultatene indikerer at CD24
+ NPC cscs kan fremme tumordannelse og også initiere invasjon og metastasering, og foreslår at ytterligere eksperimenter for å bekrefte tilstedeværelse av CD24
+ cscs i menneske NPC biopsier er garantert. I tillegg, om ekspresjonen av stamcelle og invasjons gener er under styring av en felles signalveien, slik som Wnt /β-catenin vei, gjenstår å undersøkes.
Oppsummert viser våre resultater at CD24
+ celler vise CSC egenskaper i NPC cellelinjer. Strategier rettet mot utrydding av CD24
+ NPC celler kan gi nye og mer effektive behandlingsstrategier mot NPC.
Materialer og metoder
Cell kultur
NPC cellelinjer (den keratiniserende plateepitel TW02 cellelinje, den udifferensiert TW04 cellelinje, differensierte squamous Ht1 celler, dårlig differensiert plateepitel CG1 celler, og keratiniserende plateepitel TW039 og TW076 cellelinjer) ble gitt av Dr. Yu-søn Chang (Chang Gung University) og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 25 ug /ml amfotericin B (Invitrogen). Etter sortering som beskrevet nedenfor, cellene ble dyrket i DMEM supplert med 20 ng /ml bFGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 20 ng /ml EGF (Sigma-Aldrich), 200 enheter /ml penicillin, 200 ug /ml streptomycin, og 50 ug /ml amfotericin B (Invitrogen). Alle celler ble holdt i et fuktig 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C.
Strømningscytometri-analyse og sortering av NPC celler
Cellene ble analysert ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) etter å ha nådd den logaritmiske fase spredning. Celler ble fordøyet med 0,25% trypsin-0,02% EDTA (Invitrogen), vasket to ganger med kalsium /magnesium-fri PBS og resuspendert ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml i iskald PBS supplert med 2% FBS. FITC-konjugert anti-human CD15, CD24, CD30, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD54, CD59, CD90, CD117 eller CD133 antistoff (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mountain View, CA) ble deretter tilsatt til en slutt konsentrasjon på 1 ug /ml, og inkubert i 30 minutter ved 4 ° C i mørke under omrøring. Cellene ble deretter vasket to ganger med iskald PBS supplert med 2% FBS, og ble analysert ved hjelp av FACS Aria strømningscytometer (Becton, Dickinson & Co. Company, Mountain View, CA). Isotype-matchet humane antistoffer (Becton, Dickinson & Co. Company) ble anvendt som kontroller. Celler farget med FITC-konjugert anti-human CD24 ble også sortert ved hjelp av samme flowcytometer.
Tumor sfære formasjon analysen
Seks godt kultur retter ble belagt med 1,2% myk agar [22] . Sperre og sorterte cellene ble så tellet og inokulert i triplikat ved en tetthet på 500 celler /brønn i DMEM supplert med 20 ng /ml bFGF og 20 ng /ml EGF. Celler ble observert for sfære formasjon hver dag.
