Abstract
Uttrykk for Caveolin-en (Cav1), en nøkkelkomponent i celleoverflaten caveolae, er forhøyet i prostatakreft (PCA) og assosiert med PCa metastase og en dårlig prognose for PCA pasienter. Polymerase I og transkripsjon Slipp Factor (PTRF) /cavin-en er et cytoplasmisk protein nødvendig for Cav1 avhengig dannelsen av caveolae. Uttrykk for PTRF reduserer bevegeligheten av PC3 celler, en metastatisk prostatakreft cellelinje som endogent uttrykker rikelig Cav1 men ingen PTRF og ingen caveolae, noe som tyder på en rolle for ikke-caveolar Cav1 domener, eller Cav1 stillas, ved PCA celle migrasjon. Tyrosin fosforylerte Cav1 (pCav1) fungerer i samspill med Galectin-3 (Gal3) og galectin gitteret for å stabilisere fokus vedheft kinase (FAK) innen fokale sammenvoksninger (fettsyrer) og fremme kreftcelle motilitet. Men om PTRF regulering av Cav1 funksjon i PCa celle migrasjon er relatert til Gal3 ekspresjon og funksjon er ennå ikke bestemt. Her viser vi at PTRF uttrykk i PC3 cellene reduserer FAK stabilisering i fokale sammenvoksninger og reduserer cellemotilitet uten at det påvirker pCav1 nivåer. Eksogent Gal3 stabilisert FAK i fokale voksninger av PTRF-uttrykkende celler og gjenopprettet celle motilitet av PTRF-uttrykk PC3-celler til nivåer av PC3-celler på en doseavhengig måte, med en optimal konsentrasjon på 2 ug /ml. Eksogene Gal3 stabilisert FAK i fokale sammenvoksninger av Gal3 knockdown PC3 celler, men ikke i Cav1 knockdown PC3 celler. Cav1 knockdown også forhindret Gal3 redning av FA-assosiert FAK stabilisering i PTRF-uttrykke PC3 celler. Våre data understøtter en rolle for PTRF /cavin-1, gjennom caveolae formasjon, som et dempeledd av den ikke-caveolar funksjonaliteten Cav1 i Gal3-Cav1 signalering og regulering av kontaktklebe dynamikk og kreftcellemigrering.
Citation : Meng F, Joshi B, Nabi IR (2015) Galectin-3 Overstyrer PTRF /Cavin-1 Reduksjon av PC3 Prostate Cancer Cell migrasjon. PLoS ONE 10 (5): e0126056. doi: 10,1371 /journal.pone.0126056
Academic Redaktør: Christophe Lamaze, Institut Curie, FRANCE
mottatt: 28 november 2014; Godkjent: 28 mars 2015; Publisert: 05.05.2015
Copyright: © 2015 Meng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prostatakreft Canada, Canadian Institutes for Health Research (MOP-126029), Kina Scholarship Council-UBC doktorgradsstipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konkurrerende interesser: Co-forfatter Ivan Nabi er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Caveolin-en (Cav1), et medlem av caveolin protein familien, er en viktig del av caveolae , kolbeformet invaginations på celleoverflaten som er involvert i mange cellulære prosesser som vesikulært transport, intracellulær signalisering og mekanisk transduksjon [1]. Cav1 er involvert i regulering av lipid flåter og av flere kreftrelatert prosesser, inkludert celledød og overlevelse, celle migrasjon og invasjon, og tumorvekst og metastase [1-4]. Cav1 uttrykk er forhøyet i metastatisk prostatakreft (PCA) celler og Cav1 har blitt vurdert som en prognostisk markør for aggressiv PCa [5-7]. Cav1 har også blitt funnet assosiert med PCa metastaser i mus og humane PCA-cellelinjer [5, 8]. PC3 er et metastatisk prostatakreft-cellelinje som uttrykker rikelige nivåer av tyrosin-fosforylert Cav1 (pCav1), men mangler celleoverflate caveolae på grunn av fravær av polymerase 1 og transkripsjon frigjøringsfaktor (PTRF) /cavin-1, nødvendig sammen med Cav1 for caveolae formasjon [7, 9-11]. Overekspresjon av PTRF i PC3-celler avtar cellemotilitet via redusert produksjon matriksmetalloprotease 9 (MMP9) [12]. Videre studier har vist at PTRF /cavin-1 uttrykk endrer PC3 celle secretome ved å påvirke kolesterol dynamikk og aktin cytoskjelettet, og demper fremme PCa progresjon av ikke-caveolar Cav1 microdomain [13, 14].
Cell migrasjon, et kritisk element av metastatisk sykdom, er en dynamisk og flertrinnsprosess regulert gjennom tid og rom tilbakemeldinger mellom actomyosin sammentrekning, aktin polymerisasjon, og kontinuerlig demontering og dannelse av sammenvoksninger [15-17]. Focal voksninger (FAS) er makromolekylære samlinger som knytter ekstracellulære matrise og cytoskjelettet og overfører mekanisk kraft og regulatoriske signaler [18, 19]. Focal vedheft kinase (FAK) er den viktigste kinase involvert i FA-signalering og regulerer fokale vedheft dynamikken gjennom sin kinase domene (FRNK) og tyrosin 397 (Y397) autofosforylerings. Redusert FAK Y397 fosforylering er assosiert med økt FAK utveksling mellom fettsyrer og cytosol, tregere FA demontering og redusert celle migrasjon [20, 21]. pCav1 øker membran lipid orden i fettsyrer og fremmer FAK stabilisering innenfor fettsyrer i flere kreftcellelinjer inkludert PC3 PCa cellelinje, en cellelinje som uttrykker noe endogent PTRF og dermed ingen caveolae, tyder på en rolle for ikke-caveolar Cav1 stillaser [4 , 11, 22]. Cav1 er et viktig substrat av Src-kinase og er fosforylert på tyrosin 14 (Y14) [23-26]. I human bryst, colon og prostata cancercellelinjer, Src-avhengig fosforylering av Cav1 fremmer FAK stabilisering i fokale voksninger, fokal adhesjon omsetning, RhoA signalering og cellemigrering og invasjon [11]. Galectin-3 (Gal3), en galaktose-spesifikt lectin familien som fortrinnsvis binder celleoverflaten GlcNAc-transferase V (Mgat5) -modifisert N-glykaner, stimulerer FAK og PI3K-aktivering, øker integrin-aktivering, og rekrutteringen til fibrillære adhesjoner, og øker F- aktin omsetning [27-30]. Vi har vist at pCav1 og Gal3 handle sammen for å stabilisere FAK innen fotballforbund og fremme FA dynamikk og cellemigrasjon og at koordinere uttrykk for Cav1 og Gal3 skille differensiert skjoldbruskkjertelkreft fra godartet [4, 31].
Men det har ennå ikke bestemt om og hvordan uttrykk for PTRF og dermed caveolae, påvirker felles Cav1-Gal3 regulering av FA dynamikk og cellemigrasjon. Vi brukte derfor PC3 PCA celler som mangler PTRF og caveolae men uttrykker Cav1 og pCav1, å spesifikt bestemme hvilken rolle PTRF i Cav1-Gal3 regulering av FA dynamikk og kreft celle migrasjon.
Resultater
uttrykk for PTRF /Cavin-en synker PC3 cellemigrasjon og forstyrrer FAK stabilisering i fokale sammenvoksninger
PC3 prostata kreft celler som stabilt uttrykker PTRF-GFP (PC3-GFP-PTRF) viser redusert cellemotilitet sammenlignet med PC3 celler stabilt uttrykker GFP (PC3-GFP) eller ikke-transfekterte PC3-celler (figur 1A), som tidligere rapportert [12]. Den reduserte migrering av PC3-PTRF-GFP celler var ikke assosiert med et endret antall fokusvoksn merket for FAK (fig 1B). For å bestemme FAK stabilitet i FAS ble PC3 celler transfektert med FAK-GFP alene, FAK-GFP pluss mCherry eller FAK-GFP pluss PTRF-mCherry og utsatt for fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP) analyse. Som vist på figur 1C, ekspresjonen av PTRF-mCherry økte den mobile fraksjon av FAK-GFP i fettsyrer i forhold til PC3-celler transfektert med FAK-GFP alene eller FAK-GFP med mCherry. En økt mobil fraksjon, økt fluorescens utvinning av FAK-GFP i forhold til den pre-blekemiddel fluorescensintensitet, skyldes høyere utveksling av FAK-GFP mellom midt adhesjon og cytosol dermed mindre stabilisering av FAK-GFP innenfor FA. PTRF uttrykk redusert derfor FAK stabilisering i fettsyrer, en indikasjon på økt utveksling med cytoplasmatiske FAK og redusert FA demontering [20, 21].
(A) Transwell migrasjon analysen viser at PC3-GFP-PTRF celler migrerer saktere enn vill -type PC3 og PC3-GFP celler. (B) Representative confocal bilder av PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF celler og kvantifisering av fettsyrer per celle i hver av cellelinjer viser at antall fettsyrer per celle ikke er betydelig påvirket av PTRF uttrykk i cellen. (C) Fluorescens Recovery Etter fotobleking (FRAP) analyse viser at FAK-GFP intensitet utvinning nivået økes med PTRF-mCherry kotransfeksjonen sammenlignet med FAK-GFP alene eller FAK-GFP og mCherry kotransfeksjonen. Den FAK-GFP intensitet gjenvinning kurve grafisk fremstilling av en representativt eksperiment og en bar graf av FAK-GFP mobil fraksjon (beregnet på grunnlag av fluorescens utvinning platået) oppsummert fra alle forsøkene er vist. (N≥3; ***: p 0,001; **: p 0,01; *: p 0,05.)
PTRF uttrykk påvirker ikke PCAV1 nivåer, men ytterligere Gal3 behandlings restrores stabiliserings FAK i FA og cellemotilitet av PTRF-uttrykke PC3 celler
Tyrosin-fosforylert Cav1 (pCav1) regulerer migrering av flere kreftcellelinjer inkludert PC3 [4, 11]. Stabil PTRF uttrykk i PC3 celler, men endret ikke Cav1 uttrykk nivåer eller fosforylering (fig 2). Som Gal3 har vist seg å virke sammen med pCav1 for å regulere FAK stabilitet i fettsyrer [4, 31], testet vi om eksogent Gal3 kunne gjenopprette FAK stabilisering i fettsyrene i PC3-PTRF-GFP-celler. Tilsetning av His-tagget Gal3 (Gal3-His) i konsentrasjoner fra 1-4 mg /ml påvirket ikke FAK stabilisering innenfor fettsyrer i PC3 celler. Men i PTRF-uttrykkende PC3-celler, tilsetning av 1,5 eller 2 ug /mlGal3-His betydelig grad gjenopprettet stabilisering av FAK i fettsyrer, med 2 ug /ml av Gal3-His stabiliserende FAK i fettsyrer mest signifikant (p 0,001); Tilsetningen av høyere (3 eller 4 ug /ml) eller lavere (1 pg /ml) konsentrasjoner av Gal3-His mislyktes i å gjenopprette FA forbundet FAK stabilisering (figur 3A). Dose-avhengighet av Gal-His stabilisering av FAK i fettsyrer er i samsvar med konseptet av galectin gitter, hvor et kritisk forhold på Gal3 til glykan substrater som muliggjør optimal glykoprotein kryssbinding som fører til reseptor-dynamikk og signalering [32, 33] . En Transwell cellemigrering analyse viste at den optimale 2 ug /ml Gal3-His forbedret migrering av alle tre cellelinjer (PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF) til den største utstrekning og i samme plan (fig 3B) . 1, 1,5 og 3 ug /ml Gal3-His hadde ingen effekt på cellemigrering av kontroll PC3 og PC3-GFP-celler, men forhøyet PC3-GFP-PTRF cellemigrering til nivået av ubehandlede PC3 og PC3-GFP-celler (Fig 3B). 4 ug /ml Gal3 derimot ikke signifikant cellemigrering av en hvilken som helst av de cellelinjer (figur 3B). Tilsetning av eksogent Gal3 proteinet gjenoppretter derfor mangelfull FAK stabilisering i fettsyrer og redusert migrering av PTRF-uttrykkende PC3-celler på en doseavhengig måte.
Western blot viser ekspresjonsnivåene av GFP, GFP-PTRF, og Cav1 pCav1 i PC3 villtype-celler (PC3), PC3-celler stabilt transfektert med GFP (PC3-GFP) og PC3-celler stabilt transfektert med GFP-PTRF (PC3-GFP-PTRF). Western blot båndintensiteten Cav1 og pCav1 er kvantifisert og normalisert til den for β-aktin og viser ingen signifikant forskjell fra Cav1 uttrykk eller fosforylering mellom PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF celler. (N≥3, ***: p. 0,001)
(A) FRAP analyse av FAK-GFP viser FA-assosiert FAK stabilitet i PC3 celler transfektert med FAK-GFP alene eller FAK -GFP pluss PTRF-mCherry og underkastet Gal3-His behandling ved de angitte konsentrasjoner (1, 1,5, 2, 3 eller 4 ug /ml). Redusert FAK stabilisering i fettsyrer av PTRF-uttrykkende PC3-celler gjenopprettes ved Gal3-His på en doseavhengig måte. Et søylediagram av FAK-GFP mobile brøkdel oppsummert fra alle eksperimenter og en representant FAK-GFP utvinning kurve grafen fra ett eksperiment (viser NT og 2 mikrogram /ml Gal3-Hans behandling bare) er vist. (B) Kvantifisering av PC3, PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF celle migrasjon ved hjelp av transwell analysen med ingen behandling eller behandling med Gal3-His (1, 1,5, 2, 3 eller 4 ug /ml) viser at to ug /ml Gal3-His behandling øker cellemigrering av alle cellelinjer til en tilsvarende grad. Andre konsentrasjoner av Gal3 økning migrering av PC3-GFP-PTRF celler til en mindre grad, men påvirker ikke migrering av PC3 eller PC3-GFP-celler. (NT: ubehandlet, n≥3; *: p 0,05; **: p 0,01; ***: p 0,001; ns: ikke signifikant.)
Gal3 redning av FA-assosiert FAK stabilisering er CAV1 avhengig
for å avgjøre om endogen Gal3 stabiliserer FAK i fettsyrer av PC3 celler, utarmet vi Gal3 med siRNA skaffe en konsekvent 90% reduksjon i Gal3 nivåer etter 48 timer (figur 4A). Etter 24 timer transfektert vi cellene med FAK-GFP alene eller FAK-GFP sammen med PTRF-mCherry, og behandlet dem eller ikke med 2 mg /ml Gal3-His før FRAP analyse av FAK-GFP stabilitet i fettsyrene. Som vist i figur 4B, knockdown av Gal3 (Gal3 KD) redusert FAK stabilisering i fettsyrer, til en tilsvarende grad som observeres for PTRF-uttrykk PC3-celler, mens siCTL hadde ingen effekt på FAK-stabilisering i forhold til ikke-transfekterte celler. Viktigere, behandling med Gal3-His reddet FAK stabilisering i FAS både PTRF-uttrykke og Gal3 knockdown celler (figur 4B).
(A) Western blot viser effektiviteten av Gal3 siRNA knockdown. (B) FRAP-analyse viser FA-assosiert FAK-GFP stabilitet i PC3-celler transfektert med ingen siRNA, krafse kontroll siRNA (siCTL) eller siRNA mot humant Gal3 (siGal3), og underkastet 2 ug /ml Gal3-His behandling. De FAK-GFP intensitet utvinning kurve grafer av én representant eksperiment og et søylediagram av FAK-GFP mobile brøkdel oppsummert fra alle forsøk er vist. (N = 3; ***: p. 0,001)
Vi slått ned Cav1 i PC3 celler ved siRNA (siCav1) (figur 5A) før transfeksjon med enten FAK-GFP alene eller FAK -GFP pluss PTRF-mCherry og behandling med eksogen Gal3-His (2 ug /ml). siCav1 økt mobil brøkdel av FAK-GFP i fettsyrene i PC3, men ikke i PTRF-uttrykker PC3 celler, noe som viser at Cav1 selektivt regulerer FA dynamikk i PC3 cellene mangler PTRF (Fig 5B). Gal3-Hans var ikke i stand til å fremme FAK stabilisering i fettsyrer av PC3 eller PC3-PTRF celler der Cav1 ble slått ned (figur 5B). Cav1 er derfor nødvendig for Gal3 avhengig FAK stabilisering i fettsyrer av PC3 celler. Felles regulering av FA dynamikk av Cav1 og Gal3 er derfor påvirket av uttrykk for PTRF og Cav1 rekruttering til caveolae. Dette tyder på at rekruttering av Cav1 å caveolae kan endre forholdet mellom ikke-caveolar Cav1 og Gal3 som er kritisk til deres koordinert regulering av FA dynamikk og kreft celle migrasjon.
(A) Western blot viser effektiviteten av Cav1 siRNA knockdown. (B) FRAP analyse av FAK-GFP viser FA-assosiert FAK stabilitet av PC3-celler transfektert med ingen siRNA, krafse kontroll siRNA (siCTL) eller siRNA mot humant Cav1 (siCav1), og underkastet 2 ug /ml Gal3-His behandlings . De FAK-GFP intensitet utvinning kurve grafer av én representant eksperiment og et søylediagram av FAK-GFP mobile brøkdel oppsummert fra alle forsøk er vist. (N = 3; ***: p 0,001)
Diskusjoner
cavin familien omfatter PTRF /cavin-en, SDPR /cavin-2, PRKCDBP /cavin-. 3 og MURC /cavin-4, som deler en konservert N-terminalt domene består av heptad rapporter av hydrofobe aminosyrer, eventuelt som danner coiled spoler, og en etterfølgende region av flere basiske aminosyrer [34]. Ekspresjon av de cavins er assosiert med ekspresjon og stabilisering av Cav1 og dannelse og funksjon av caveolae [34]. Av de cavins, PTRF /cavin-en er essensiell for caveolae dannelse og tap av PTRF resulterer i tap av caveolae og nedregulering av Cav1 proteinnivåer [9, 35]. Cav1 har blitt tilskrevet ikke-caveolar funksjoner [36-38] og støkiometri mellom caveolins og cavins må nødvendigvis påvirke uttrykk for ikke bare caveolae men også ikke-caveolar Cav1 domener eller Cav1 stillaser. PC3 celler er en utmerket cellular modell for å studere ikke-caveolar funksjonene Cav1 som de mangler PTRF og caveolae men viser forhøyede nivåer av Cav1 [7]. Faktisk uttrykk for PTRF i PC3 cellene nøytraliserer de ikke-caveolar Cav1 mikroområder og endrer cellen motilitet, sekresjon stier og angiogenese og lymphangiogenesis evner i PC3 celler [12-14, 39, 40]. Konsekvent, viser vi her at PTRF uttrykk i PC3 celler grenser Cav1-Gal3 regulering av FAK stabilisering i fettsyrer og cellemotilitet.
Gal3 og pCav1 funksjon sammen for å fremme FA dynamikk og cellemotilitet. pCav1 fremmer cellepolarisering og migrasjon og regulerer membranlipid rekkefølge på fettsyrer [4, 22, 26]. Gal3 binding til celleoverflate Mgat5-modifisert N-glykaner danner en galectin gitter som stimulerer FAK og PI3K-aktivering, og fremmer integrin-aktivering og F-aktin omsetningen [27-30]. Gal3 induserer integrin α5β1 aktivering og FAK (p397FAK) fosforylering, forbundet med FAK stabilisering i fettsyrer, økt FA signalering og demontering, og dermed cellevandring [20, 21, 28]. Videre er det i celler som mangler den galectin gitteret på grunn av fravær av Mgat5, er pCav1 ikke tilstrekkelig til å fremme FA-assosiert FAK stabilisering; uttrykk for Mgat5 og galectin gitter øker celle spredning og induserer fotballforbund, men krever pCav1 å stabil FAK innen fotballforbund [4]. Konsekvent, er koordinert uttrykk for Cav1 og Gal3 observert i differensiert skjoldbrusk kreft cellelinjer utvunnet og siRNA knockdown-analyser i samme cellelinjer viser at både Cav1 og Gal3 er pålagt å fremme FAK stabilisering i fettsyrer og cellemigrasjon i forhold til godartet skjoldbrusk lesion- avledet celler [31]. Nyere data som viser at Gal3 er nødvendig for epidermal vekstfaktor (EGF) signalering som induserer Cav1 fosforylering og fremmer sirkulær dorsal krusning (CDR) dannelse, cellemigrering og fibronektin fibrillogenese; disse studiene førte til forslag fra en Gal3-integrin-pCav1 signaliserer modul som formidler EGF aliserte til Rho A [41]. Dette tyder på at utenfor-in intesignale formidler felles Gal3-pCav1 regulering av FA dynamikk, der ekstracellulære Gal3 samhandler med og aktiverer griner som deretter rekrutterer pCav1 fører til nedstrøms RhoA alarm og cellemigrasjon.
Våre data viser at PTRF uttrykk i PC3 cellene endrer ikke Cav1 eller pCav1 nivåer, noe som tyder på at PTRF regulerer pCav1 funksjon i FA dynamikk gjennom Cav1 rekruttering til caveolae, redusere tilgjengeligheten av funksjonell pCav1 i ikke-caveolar stillas domener. Dannelse av caveolae kan regulere uttrykk og funksjon av ikke-caveolar Cav1 stillasene ved å rekruttere pCav1 til caveolae. Cav1 Y14 fosforylering er unnværlig for caveolae formasjon men pCav1 har blitt lokalisert til caveolae [42, 43]. Faktisk har det vist seg at preferanse ekspresjon av Cav1 i ikke-caveolar Cav1 domener på grunn av et fravær av PTRF er forbundet med avansert PCa og at ekspresjon av PTRF /caveolae nøytraliserer ikke-caveolar Cav1 domener for å bremse ned PCa progresjon [14] . Det faktum at overskytende Gal3 kan gjenopprette pCav1 avhengig FA signale indikerer at felles interaksjon mellom Gal3 og pCav1 er kritisk for deres evne til å regulere FA signalering og dynamikk. Et utvalg av konsentrasjoner fra 1-4 mikrogram /ml, 2 mikrogram /ml var optimalt å redde PTRF-uttrykke celler, fremhever konsentrasjonen avhengigheten av Gal3 gitter funksjon. Tilsvarende Gal3 stimulering av integrin-avhengige fibronektin fibrillogenese er konsentrasjonsavhengig [28]. Inte er modifisert av Mgat5 og Gal3 aktiverer α5β1 grin og rekrutterer det å fibrillar voksn [28, 44]. pCav1 er vist å interagere med integriner og modulere lipid orden i fettsyrer [22, 45-47]. Våre data antyder at den relative konsentrasjonen av Gal3 til ikke-caveolar pCav1 er en viktig regulator av Gal3-pCav1 signalering og som PTRF er en ny regulator av denne signale modulen. PTRF har vist seg å endre exosomal sekresjon av PC3-celler [13], og om PTRF forstyrrer Gal3-pCav1 modul ved å begrense Gal3 sekresjon, eller ved å avsette pCav1 til caveolae og bort fra ikke-caveolar Cav1 stillasene, eller ved direkte interaksjon med ikke- -caveolar Cav1 stillas, gjenstår å fastslå (fig 6).
ekstracellulær Gal3 og ikke-caveolar pCav1 hvert stabiliserer FAK innen fotballforbund avhengige av hverandre. Uttrykk for PTRF forstyrrer denne funksjonen gjennom tre mulige måter: 1) ved å rekruttere pCav1 bort fra ikke-caveolar Cav1 stillaser og inn caveolae; 2) ved direkte interaksjon med ikke-caveolar pCav1; 3) ved å påvirke Gal3 sekresjon og således ekstracellulære Gal3 konsentrasjon. Gjennom hvilken vei PTRF påvirker Gal3-pCav1 funksjon på FA dynamikk gjenstår å bli undersøkt.
Både Cav1 og Gal3 spiller viktige roller ved PCA progresjon. Gal3 har blitt anerkjent som en viktig regulator av PCa metastaser [48-50] og flere forsøk har blitt utført for å målrette Gal3 i PCA med enten Gal3 bindende kreft-assosiert Thomsen-Friedenreich glycoantigen (TF-Ag) -mimic laktose- L-leucin eller en høy affinitet Gal3-bingding glycopeptide renset fra torsk [51, 52]. Cav1 har blitt vurdert som en prognostisk markør for aggressiv PCa siden 1990-tallet [5, 6].
Nyere data tyder på at PTRF nøytraliserer Cav1 handling impliserer en avgjørende rolle for ikke-caveolar domener ved PCA [14]. Vår demonstrasjon som Gal3 kan reversere redusert FAK stabilisering i fettsyrer og cellemotilitet indusert av PTRF identifiserer Gal3 og pCav1 som kritiske regulatorer av funksjonen av ikke-caveolar domener ved PCA celle migrasjon. Koordinere aktiviteten Cav1 og Gal3 kan derfor spille en viktig rolle ved PCA metastase og representerer et potensielt terapeutisk mål for PCa.
Materialer og Metoder
Antistoffer, plasmider, siRNA en rekombinant humant Gal3-His
bovint serumalbumin (BSA), og mus anti-p-aktin-antistoffer ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich. Kanin anti-FAK ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc., kanin anti-pY14Cav1 fra Cell Signaling, Inc., og mus anti-PTRF og kanin anti-Cav antistoffer fra BD Transduction Laboratories. HRP-konjugert mus og kanin sekundære antistoffer ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch Laboratories. Phalloidin og sekundære antistoffer konjugert til Alexa 488, 568 eller 647 ble kjøpt fra Life Technologies, Thermo Fisher Scientific. PTRF-mCherry og mCherry plasmider var generøse gaver fra Dr. Michelle Hill (The University of Queensland Diamantina Institute, The University of Queensland, Translasjonell Research Institute, Brisbane, QLD, Australia). FAK-GFP plasmid ble som tidligere beskrevet [11]. Validerte på målet pluss SMARTpool små interfererende RNA (siRNA) for menneskelig Cav1, kontroll siRNA (siCONTROL ikke-måls siRNA no. 1) og tilpassede siRNA tomannsboliger for Gal3 [53] ble kjøpt fra Dharmacon.
rekombinant human Gal3 tagget med 6xHis på C-terminal ble generert ved hjelp av plasmid, pHIS-Parallel2, beskrevet tidligere [54]. Dette plasmidet og protokoller var en slags gave fra Ludger Johannes (Institut Curie, Paris, Frankrike). For å generere Gal3-His, anvendte vi BL21-DE3 bakterier (New England Biolabs). I korthet dyrking over natten ble re-inokulert (1: 5) i friskt LB supplert med ampicillin og dyrket ved 37 grader Celsius på 225 rpm rister inntil optisk tetthet ved 600 nådd en og deretter fremkalt ved bruk av 0,4 mM IPTG i 3 timer ved 30 grader Celsius på en 225 rpm shaker. Rekombinant Gal3-His ble renset på Talon affinitet matrise (Clontech) ved hjelp av medfølgende protokollen, overført til 1 x PBS før Rask innfrysing i flytende N2.
Cell kultur og transfeksjon
Den menneskelige PC3 cellelinje var fra American Type Culture Collection (ATCC) og holdt i fullstendig RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). De PC3 cellelinjer stabilt uttrykker GFP eller PTRF-GFP (PC3-GFP og PC3-GFP-PTRF) var generøse gaver fra Dr. Michelle Hill (The University of Queensland Diamantina Institute, Brisbane, Australia) [13]. Alle cellelinjer ble passert minst to ganger etter utvinning fra frossen fisk før initiering av eksperimenter og holdt i kultur for maksimalt 8 til 10 passasjer for å minimalisere fenotypisk glidning.
Plasmid transfeksjon ble utført 24 timer etter plating av cellene eller siRNA transfeksjon, ved hjelp Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) etter produsentens protokoll. Forsøk ble utført 24 timer etter transfeksjon plasmid. For å knockdown Cav1, ble cellene dyrket i komplett medium i 24 timer før transfeksjon med spesifikk mus Cav1 siRNA eller tak siRNA smartpools (mus siCav1: L-0058415-00, siCONTROLS: D-001210-01; Dharmacon) ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) etter produsentens protokoll. For Gal3 knockdown, brukte vi tidligere beskrevet tilpassede siRNA oligonukleotid sekvenser og protokollen [53]. Kort fortalt celler ble transfektert med den spesifikke pool av fire tilpassede syntetisert muse Gal3 siRNA oligonukleotider tomannsboliger eller kontrollere smart basseng siRNA (siCONTROLS) bruker Lipofectamine 2000. Cellene ble dyrket i 48 timer før eksperimentering.
Western blotting
Cellepelleter fra 80% konfluente kulturer ble vasket med kald PBS og resuspendert i lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA inneholder ferskt tilsatt 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 mM natrium-vanadat, 2,5 mM natriumfluorid, og en uM leupeptin) i 30 minutter ved 4 ° C, pelletert ved 13.000 rpm ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C. Like mengder proteiner ble separert på 12% SDS-PAGE, elektroblottet på nitrocellulose (GE Healthcare Life Science), undersøkt med angitte antistoffer og HRP-konjugerte sekundære antistoffer, og avslørt av ECL (Merck Millipore).
immunfluorescens merking
Celler ble fiksert med 3% paraformaldehyd (PFA) i 15 minutter ved romtemperatur, vasket med PBS, permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS /CM, blokkert med PBS /CM inneholdende 0,2% bovint serum-albumin (BSA), og deretter inkubert med primære og sekundære fluorescerende antistoffer i PBS /CM som inneholdt 0,2% BSA. Etter merking ble Dekk montert i CelVol (Celanese, Ltd.), og bilder anskaffes med 100 × planapochromat mål (NA 1,35) av en FV1000 Olympus konfokalmikroskop.
FRAP målinger
FRAP ble utført på en konfokal mikroskop (FV1000, Olympus) er utstyrt med en 60x planapochromat objektiv (NA 1,35, olje) og SIM-skanner. Celler ble sådd ut ved lav tetthet på FN (10 ug /ml) i 24 timer i en 8-brønns μ-sleidekammeret (ibidi), transfektert med FAK-GFP eller FAK-GFP pluss mCherry eller FAK-GFP plus PTRF-mCherry, og eksperimenter utført 24 timer senere ved 37 ° C. siRNA ble transfektert 48 timer før FRAP eksperimenter. Celler ble behandlet med Gal3-His ved å endre mediet serumfritt medium inneholdende indikerte konsentrasjon av Gal3-His i 10 minutter før bytte tilbake til bikarbonat-fritt RPMI-medium. For hver FRAP analyse, ble en prebleach ramme kjøpte etterfulgt av en enkelt blekemiddel hendelse med samtidige og uavhengige stimulering av 405 linjen i SIM skanneren. Fluorescensgjenvinning ble fulgt ved 4-s tidsintervaller inntil intensiteten nådd et platå. Fluorescens under utvinning ble normalisert til prebleach intensitet. Intensitetsforhold i bleket området ble sammenlignet før bleking og etter utvinning å beregne mobil fraksjoner som bruker Prism 4 (GraphPad). Grafer er representative for minst tre uavhengige eksperimenter der mellom 10 og 25 knutepunkter sammenvoksninger ble bleket.
Migrasjon analysen
For migrasjon analysen ble cellene trypsinert og talt opp, og 200.000 celler /brønn ble overført til ubelagte 8-um celledyrkningsinnsatser (BD Falcon) i medium inneholdende 2% serum og sammenstillingen plasseres i 24-brønners plater inneholdende fullstendig medium. Etter 16 timer ble det ikke-migrerte celler fjernet fra toppen av filteret med en bomullsdott, og migrerte celler på bunnen av filteret ble fiksert med 3% PFA, farget med 5% krystallfiolett og merkede celler telles. -Celler ble normalisert til den PC3 gruppen. Alternativt 200.000 celler /brønn ble overført til innsatser i serumfritt medium med eller uten 2 ug /ml Gal3-His, og sammenstillingen plasseres i 24-brønners plater inneholdende komplett medium i 14 timer før fiksering og farging. Celletall ble normalisert til PC3 ikke-behandlede gruppen.
