Abstract
Bakgrunn
serin /treonin kinase Aurora-A (Aur-A) er et proto-oncoprotein overexpressed i et bredt spekter av kreft hos mennesker. Overekspresjon av Aur-A er antatt å være forårsaket av genamplifikasjon eller mRNA overekspresjon. Men siste bevis avdekket at avvik mellom forsterkning av
Aur-A Hotell og overekspresjon priser på Aur-A mRNA ble observert i brystkreft, magekreft, leverkreft, og eggstokkreft. Vi fant ut at aggressive hode og nakke kreft utstilt overekspresjon og stabilisering av Aur-A protein uten genamplifisering eller mRNA overekspresjon. Her testet vi hypotesen om at avvik av proteinet ødeleggelse system induserer opphopning og dermed overekspresjon av Aur-A i kreft.
hovedfunnene
Aur-A protein ble ubiquitinylated av APC
Cdh1 og følgelig nedbrytes når cellene avsluttet mitose, og ble observert fosforylering av Aur-A på Ser51 under mitose. Fosforylering av Aur-A på Ser51 hemmet sin APC
Cdh1-mediert ubiquitylation og påfølgende degradering. Interessant, ble konstituerende fosforylering på Ser51 observert i hode og nakke kreft celler med protein overekspresjon og stabilisering. Faktisk fosforylering på Ser51 ble observert i hode og nakke kreft vev med Aur-A protein overekspresjon. Videre vises en Aur-A Ser51 fosfor-mimetiske mutant stabilisering av protein under cellesyklusprogresjon og forbedret evne til celle transformasjon.
Konklusjon /Betydning
Sagt denne studien identifiserer en ny modus for Aur-A overekspresjon i kreft gjennom fosforylering avhengig hemming av sin proteolyse i tillegg til genamplifisering og mRNA overekspresjon. Vi foreslår at hemming av Aur-A fosforylering kan representere en ny måte å redusere Aur-A nivåer i kreftbehandling
Citation. Kitajima S, Kudo Y, Ogawa jeg, Tatsuka M, Kawai H, Pagano M , et al. (2007) Constitutive Fosforylering av Aurora-A på Ser51 induserer sin Stabilisering og derav følgende Overuttrykte i kreft. PLoS ONE 2 (9): e944. doi: 10,1371 /journal.pone.0000944
Academic Redaktør: Nils Cordes, Dresden teknologiske universitet, Tyskland
mottatt: 16 juni 2007; Godkjent: 05.09.2007; Publisert: 26.09.2007
Copyright: © 2007 Kitajima et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet med tilskudd-i-hjelp fra departementet for utdanning, vitenskap og kultur i Japan (YK og TT); tilskudd fra Uehara memorial fundament (YK) og tilskudd fra National Institutes of Health (R37-CA76584, R01-GM57587 og R21-CA125173) (MP)
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
En serie av periodiske kinase reaksjoner av cyclin-avhengige kinaser (CDK’er) fremme progresjonen av cellesyklusen [1]. Mitotiske hendelser med drastiske og hurtige morfologiske endringer er også strengt regulert av andre kinaser, inkludert Aurora-A, -B og -C [2]. Serin /treonin kinase Aurora-A (Aur-A) er avgjørende for mitotisk oppføring, sentrosomen duplisering, spindel formasjon, kromosom segregering og cytokinese [3]. Menneskelig
Aur-A /STK15
ligger på kromosom 20q13.2, som ofte forsterkes i ulike kreftformer, inkludert bryst, tykktarm, blære, eggstokkene, bukspyttkjertelen og hode og nakke kreft [4] – [9] , og nivåene av Aur-A mRNA og protein er også øket i de tumorer [10] – [14]. Dermed overekspresjon av Aur-A kinase aktivitet har vært tenkt å fremme kreftutvikling ved å forstyrre den mekanismen som sikrer vedlikehold av normal sentrosomen eller kromosom nummer, kanskje på grunn av nedsatt sentrosomen eller cent funksjon, cytokinese, eller spindel sjekkpunkt regulering [2], [15], [16].
det er velkjent at de fleste cellesyklus regulatorer er degradert av ubiquitin-proteasom system (UPS) [1], [17]. Aur-A er også nedbrytes via ubikvitin-ligase APC (den anaphase fremmende kompleks) og dens ko-aktivator Cdh1 er involvert [18], [19]. Forslag til krav til Aur-A ubiquitylation er en anerkjennelse av den C-terminale Destruction (D-box) ved Cdh1 [20] og en ekstra A-boks /DAD motiv i
Xenopus
Aur-A [21], [22]. Videre har det blitt foreslått at Ser53 (tilsvarende Ser51 i human Aur-A) for den A-boks er fosforylert i løpet av mitose, og at fosforylering på Ser53 (eller 51 i human) er essensiell for den mitotiske stabilisering av
Xenopus
[23] og menneskelig Aur-A [24]. Selv om den mitotiske modifikasjon som påvirker Aur-A stabilisering ble oppdaget, forblir de fysiologiske dynamikk og dens regulering ufullstendig forstått.
Tidligere studier har indikert at nivået av Aur-A-proteinet i tumorer ikke alltid korrelerer med forsterkning av
Aur-A
genet [25], [26]. Vi fant også at hode- og nakkekreft cellelinjer uten genamplifisering uttrykt Aur-A protein på et høyere nivå sammenlignet med de med genet forsterkning. I tillegg er en nyere studie ved hjelp av en transgen modell og avledet celler viste at transgene Aur-A-proteinet er beskyttet av UPS-mediert nedbrytning under mitose [27]. Disse kumulative funnene førte oss til hypoteser om at avvik av proteinet ødeleggelse system induserer opphopning og dermed overekspresjon av Aur-A i kreft. Her viser vi at økte nivåer av Aur-A observert i hode- og halskreft cellelinjer oppstår fra konstituerende fosforylering av Ser51 som hindrer APC
Cdh1-mediert ubiquitylation og sekvensiell nedbrytning av Aur-A.
resultater
Overuttrykte Aur-A i hode- og halskreft korrelerer med en reduksjon i sin fornedrelse
Overuttrykte Aur-A er vist i et bredt spekter av kreft hos mennesker. Ved immunhistokjemi, hode og nakke kreft celler uttrykte Aur-A på et høyere nivå, sammenlignet med normale orale epitelceller (Figur 1a). Viktigere, Aur-A overekspresjon korrelert med dårlig overlevelse av hode- og nakkekreftpasienter (tilleggsbord, Tabell S1). Som Aur-A er kartlagt til kromosom 20q13.2, som er en region som vanligvis forsterkes i epiteliale kreftformer, er overekspresjon av Aur-A antatt å være forårsaket av genamplifikasjon og /eller overekspresjon av mRNA. Men vi fant at høy uttrykk for Aur-A protein ble ikke bare forårsaket av genamplifikasjon og mRNA uttrykk i hode og nakke kreft cellelinjer (Figur 1b). Spesielt Aur-A protein uttrykk i HSC2 og HSC3 cellene var høyere enn i HSC4 celler som inneholder både genamplifisering og forhøyede mRNA nivåer. Behandling med proteasominhibitor, ZLLL, induserte Aur-A-proteinet akkumulering i HSC4 og Ca9-22 celler, men ikke i de cellelinjer som viser høy ekspresjon av Aur-A (HSC2, HSC3 og Ho-en-U-1) (figur 1C). Videre er halveringstiden for Aur-A-proteinet var lengre i HSC2 og HSC3 celler enn i HSC4 celler korrelerer med overuttrykt Aur-A-protein (figur 1D). Disse funnene førte oss til hypotesen om at, i tillegg til genamplifisering eller mRNA overekspresjon, kan Aur-A overekspresjon i hode og nakke kreft celler være forårsaket av redusert protein degradering
A:. Immunhistokjemisk uttrykk for Aur-A er vist i normal munnslimhinnen og hode- og halskreft. B: Sammenligning av genamplifisering, mRNA uttrykk og protein uttrykk i 6 hode- og nakkekreft cellelinjer. Genamplifisering og mRNA-ekspresjon ble tidligere undersøkt (9). Protein-ekspresjon ble undersøkt ved Western blot-analyse. Cul1 ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. C: Opphopning av Aur-A protein ved proteasominhibitor, ZLLL. Kreftceller ble behandlet med eller uten 25 mM ZLLL i 6 timer. Ekspresjon av Aur-A ble undersøkt ved Western blot-analyse. Cul1 ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. D: Halveringstid av Aur-A i kreftceller. Kreftceller ble behandlet med CHX for angitte tid. Ekspresjon av Aur-A ble undersøkt ved Western blot-analyse. Tids nuller ble normalisert til like mengder av Aur-A snarere enn lik mengde protein ekstrakter for å direkte sammenligne de to halveringstider. Cul1 uttrykk ble brukt som en lasting kontroll.
Fosforylering av Aur-A på Ser51 hemmer APC
Cdh1-mediert degradering
Aur-A protein expression topper i løpet av mitose i pattedyr celler (supplerende figur, fig. S1 A og B). ZLLL behandling indusert Aur-A-produksjon i cellene i G1 fase, men ikke i celler i mitose (supplerende figur, fig. S1C). Faktisk, proteinnivået av Aur-A avtar i slutten av mitose som en konsekvens av ubiquitylation mediert av APC og dens ko-aktivator Cdh1 [20]. Ved hjelp av kotransfeksjonseksperimenter, har vi funnet at Aur-A-protein ble nedbrutt via Cdh1, men ikke Cdc20 (figur 2A), som tidligere rapportert [18], [19], [23], [24], [28]. I motsetning til dette, Aur-B, en Aur-A paralog, ikke ble forringet av enten transfeksjon av Cdh1 eller Cdc20 (figur 2A). Deretter undersøkte vi detaljert mekanisme APC
Cdh1-mediert Aur-A degradering. Aur-A har fire mulige D-Box og en KEN boks motiver, noe som potensielt kan bli gjenkjent av APC
Cdh1 ubiquitin ligase kompleks. I
Xenopus
, den N-terminale A-boks og C-terminal D-boks av Aur-A er avgjørende for dens nedbrytning [23]. Skjematisk struktur domene av humant Aur-A villtype og to-delesjonsmutanter ( AVA) eller D-box mutant (
371RPML
374 – APMA) Aur-A ble ko-transfektert med eller uten Cdh1 . E: Ser51 ble erstattet med alanin (S51A) eller asparaginsyre (S51D). Hver vekt, S51A og S51D mutant Aur-A ble co-transfektert med eller uten Cdh1 eller Cdc20. F: Sensitivitet av ubiquitylation av Aur-WT og S51 mutanter ble analysert
in vitro
. APC immunopresipitert med anti-Cdc27-antistoff fra HeLa-cellelysatene ble underkastet
in vitro
ubiquitylation analyse som beskrevet i Materialer og metoder. Reaksjonen ble avsluttet ved 60 min. IVT-Aur-A (pil) ble anvendt som et substrat. «Aur-A
Ub» indikerer ubiquitylated Aur-A.
Det har blitt rapportert at Ser53, Thr295 og Ser349 av Aur-A er fosforylert i
Xenopus
mitotiske ekstrakter [21]. Interessant, fosforylert Ser53 i
Xenopus
Aur-A blokkerer degradering av UPS [23]. Vi ga en fosforylering defekt Aur-A mutant (Ser51 erstattet av Ala, S51A) og en fosfor-ligne mutant (Ser51 erstattet av Asp, S51D). Hver mutant ble transfektert i celler med eller uten Cdh1 eller Cdc20. Villtype og mutant S51A var nesten fullstendig nedbrutt, når kotransfektert med Cdh1, mens S51D mutant ble nedbrutt ved en mindre grad (figur 2E). Villtype, S51A og S51D mutantene ble ikke degradert via APC
Cdc20 (figur 2E). Ifølge det funnet
in vivo
, den S51D mutant ble mindre ubiquitylated
in vitro
av APC
Cdh1 (figur 2F). Samlet indikerer disse resultater på at fosforylering på Ser51 hemmer D-box-avhengig nedbrytning av Aur-A som forekommer i G1-celler via APC
Cdh1.
Aurora-B (Aur-B), en paralogue av Aur-A, er forskjellig i lokalisering og tidspunktet for aktivering i løpet av cellesyklusen fra aur-A, til tross for -60% sekvensidentitet mellom dem. Sammenligning av den skjematiske strukturen mellom Aur-A og -B er vist i figur 3A. I likhet med Aur-A, har Aur-B en antatt KEN boksen, fire D-box og en A-box motiver. Som vist i figur 2A, men Aur-B ble ikke nedbrutt ved ko-ekspresjon av enten Cdh1 eller Cdc20. Justeringen svarende til A-boks motiv av Aur-A og -B er vist i figur 3B. Ser51 i Aur-A tilsvarer Glu32 i Aur-B. Vi trodde at Aur-B ikke kan bli degradert via APC
Cdh1 grunn av Glu32 ligne fosforylering. For å støtte denne hypotesen ble aminosyrer i Aur-B A-box mutert (KEP – PSN, ASN, Ptil, KSP, KAP og PEN) og deretter transfektert i celler med eller uten Cdh1 (Figur 3C). Den skjematiske av områdene muterte og resultatene av de kotransfeksjonseksperimenter er vist i figur 3D. Interessant, ble PSN, ASN, PSA, KSP og KAP mutanter degradert, mens PEN mutant ikke ble degradert via APC
Cdh1. Dermed ser Aur-B for å være beskyttet mot APC
Cdh1-mediert degradering på grunn av Glu32 som etterligner effekten av fosforylering. Alle sammen, disse resultatene tyder på at fosforylering av Aur-A på Ser51 spiller en viktig rolle for regulering av dets stabilitet
A.: Sammenligning av skjematiske struktur mellom Aur-A og -B er vist. Aur-B har flere nedbrytnings motiver på samme måte som aur-A. B: tilsvarende aminosyre-sekvens av A-boks mellom Aur-A og -B er vist. C: Aur-B med muterte aminosyrer i A-boksen (
31KEP
33 – PSN, ASN, PSA, KSP, KAP og PEN) var co-transfektert med eller uten Cdh1. D:. Oppsummering av muterte nettsteder og deres resultater er vist
Deretter undersøkte vi om fosforylering på Ser51 var involvert i reguleringen av Aur-A uttrykk under cellesyklusprogresjon. Vi reiste en fosfor-spesifikt antistoff mot et syntetisk peptid som spenner over fosforylert Ser51 rest av Aur-A. Dette antistoff som spesifikt gjenkjennes villtype og mutant S51D, men ikke S51A mutant (figur 4A), noe som indikerer at S51D substitusjon effektivt å etterligne den negative ladningen av fosfatet i posisjon 51. Fosforylering på Ser51 i endogen Aur-A ble påvist i HeLa-celler behandlet med nocodazol (som øker prosentandelen av celler i mitose), men ikke i de uten nocodazol (figur 4B). Nitti minutter etter løslatelse fra mitose, Aur-A fosforylert på Ser51 forsvant med synkende protein nivået på Aur-A og fosforylert Aur-A på T288 (Figur 4C). Interessant, fosforylering på Ser51 ble ikke funnet i celler transfektert med en kinase inaktive mutant (K /R; K162R) (Figur 4D). På fig. 4E, økt Ser51 fosforylert Aur-A wt ble observert etter NOC /OA behandling, mens FLAG-Aur-A K /R mutant ble ikke observert med eller uten NOC /OA behandling. Vi brukte okadainsyre som et fosfatase-inhibitor. Vi brukte også nocodazol for synkronisering av celler i mitose når Ser51 fosforyleres. Disse resultatene indikerte at kinase aktiviteten av Aur-A er essensielt for fosforylering av Ser51. Oppdagelsen av at Ser51 fosforylert Aur-A ble økt med NOC /OA behandling er sterkt støttet av den nylige funn at fosforylering på Ser51 ble dephosphorytated av PP2A. Men den detaljerte mekanisme fosforylering på Ser51 trenger ytterligere eksperimenter
A:. Karakterisering av phosopho-spesifikt antistoff mot Ser51 av Aur-A. Ekspresjon av Ser51 fosforylert Aur-A-proteinet ble undersøkt ved immunutfelling (IP) med en phosopho-spesifikt antistoff mot Ser51 av Aur-A, etterfulgt av immunoblottoing (IB) analyse med et monoklonalt antistoff til Aur-A i wt og S51 mutanter av Aur- En transfekterte 293T celler. B: Fosforylering av Ser51 i HeLa-celler med eller uten Noc behandling. C: Fosforylering på Ser51 i HeLa celler. HeLa-celler ble løslatt fra Noc-indusert prometafase arrest og samlet inn på de angitte tider. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE, fulgt av Western blotting med fosfo-S51 Aur-A, Aur-A, fosfo-T288 Aur-A, fosfo-histon H3 (Ser10) og Cul1 antistoffer (øvre panel). Grafen viser uttrykk nivå av Aur-A, fosfor-S51 Aur-A, fosfor-T288 Aur-A og fosfor-histon H3 (Ser10) (nedre panel). D: Uttrykk for Ser51 fosforylert Aur-A protein blir undersøkt av western blot analyse i S51D og K /R (kinase inaktiv) mutanter transfekterte 293T celler. Fosforylering på Thr288 ble undersøkt for å vise at K /R påvirket som en dominant negativ. E: Uttrykk for Ser51 fosforylert Aur-A protein blir undersøkt av western blot analyse i WT og K /R mutante transfekterte 293T celler med nocodazol (NOC) og okadasyre (OA)
Aur-A. overekspresjon i hode og nakke kreft celler er forårsaket av konstituerende fosforylering på Ser51
i betraktning av de ovennevnte funnene, hypotese vi at Aur-A overekspresjon i hode og nakke kreft celler kan skyldes stabilisering av Aur-A protein gjennom et konstituerende fosforylering på Ser51. Derfor har vi undersøkt status for fosforylering på Ser51 i hode og nakke kreft cellelinjer. Fosforylering på Ser51 ble påvist i HSC2, HSC3 og Ho-en-U-1-celler (figur 5A). Interessant nok har disse cellene uttrykte Aur-A-proteinet ved høyere nivåer. Men HSC2 og HSC3 celler viste ingen genamplifisering eller mRNA overekspresjon. HSC4 celler, som viser både genamplifisering og høye nivåer av mRNA, men protein nivåer lavere enn det som finnes i HSC2 og HSC3, viste ingen fosforylering på Ser51. Derfor synes den statusen til Ser51 status for å påvirke til protein ekspresjonsnivåer. Interessant, fosforylering på Ser51 ble også påvist i HSC2, HSC3 og Ho-en-U-1-celler når cellene synkronisert ved G1 fase, noe som tyder på at Ser51 var konstitutivt fosforylert i kreftceller (figur 5B). Videre undersøkte vi status for fosforylering på Ser51 i hode- og halskreft tilfeller. Faktisk ble fosforylering på Ser51 påvist i 4 av 9 hode og nakke kreft tilfeller (figur 5C). Alle saker med fosforylering på Ser51 viste sterkt uttrykk for Aur-A protein
A:. Fosforylering på Ser 51 i hode og nakke kreft celler. Ekspresjon av Ser51 fosforylert Aur-A-proteinet ble undersøkt ved immunutfelling (IP) med en phosopho-spesifikt antistoff mot Ser51 av Aur-A, etterfulgt av immunoblottoing (IB) analyse med et monoklonalt antistoff til Aur-A i hode- og halskreft celler. Genamplifisering og mRNA-ekspresjon ble tidligere undersøkt [9]. B: Constitutive fosforylering på Ser 51 i hode og nakke kreft celler. Indikert kreftcellelinjer ble løslatt fra NOC-indusert prometafase arrest og samlet i fire timer. Celler hadde nesten helt gått ut av mitose. Ekspresjon av Ser51 fosforylert Aur-A-proteinet ble undersøkt ved immunutfelling (IP) med en phosopho-spesifikt antistoff mot Ser51 av Aur-A, etterfulgt av immunoblottoing (IB) analyse med et monoklonalt antistoff til Aur-A. Cul1 ble anvendt som en kontroll lasting og fosfo-histon H3 (Ser10) ble anvendt som en markør for mitose. C: Ekspresjon av Ser51 fosforylert Aur-A-proteinet ble undersøkt ved immunutfelling (IP) med en phosopho-spesifikt antistoff mot Ser51 av Aur-A, etterfulgt av immunoblottoing (IB) analyse med et monoklonalt antistoff til Aur-A i celler i normal oral mucosal vev og 9 hode og nakke kreft vev. ß-Actin expession ble brukt som en lasting kontroll.
Constitutive fosforylering på Ser51 forbedret celletransformasjon
For å vurdere ytterligere tumorigenesis indusert av overekspresjon av Aur-A protein på grunn av fosforylering på Ser51 utførte vi stabiliteten S51D mutant og celle transformasjon sammenlignet med villtype. Selv om ekspresjon av villtype-proteinet, og S51D mutant er praktisk talt identisk i mitotiske celler, ble S51D mutanten ikke nedbrytes når cellene avsluttet mitose (figur 6A). I tillegg er halveringstidene for den S51D mutanten var lengre enn de av villtype, S51A og K /R-mutanter (figur 6B). Således S51D mutant ble stabilt uttrykt i løpet av cellesyklusprogresjon. Deretter undersøkte vi effekten av celletransformasjon ved hjelp BALB /
c
3T3 A31-1-1 celler (figur 6C). Vi kotransfektert
Aur-A Hotell og G12V-
HRAS plakater (T24-
ras
), og observerte at
Aur-A
forsterket frekvens av G12V-
HRAS
indusert transformasjon. Interessant, var et mye større antall foci funnet ved hjelp av S51D mutant, tyder på at konstituerende fosforylering på Ser51 har forbedret onkogene potensialer
A:. Endring av vekt og S51D Aur-A uttrykk etter nocodazol utgivelse i HeLa celler. HeLa-celler ble transient transfektert med wt og S51D Aur-A. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene synkronisert ved NOC rest og mitotisk shake-off, slippes inn i friskt medium, høstet ved de angitte tider. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE, fulgt av Western blotting med FLAG, cyklin-A, p27, fosfo-histon H3 (Ser10) og Cul1 antistoffer. B: Half-life av vekt og mutanter (S51A, S51D og KR) av Aur-A transfekterte 293T celler (venstre panel). Celler ble behandlet med CHX for angitte tid. Høyre panel viser Aur-A /Cul1 forholdet målt ved densitometri. C: Effekt av S51D mutant Aur-A uttrykk på celle transformasjon i BALB /
c
3T3 A31-1-1 celler. FLAG-merket wt, S51A og S51D mutanter Aur-A ble transfektert med eller uten H-Ras (G12V). Uttrykk av vekt, S51A og S51D mutanter Aurora-A og H-Ras er bekreftet av Western blot analyse (venstre panel). Etter 2 uker med kultur, ble rettene fast med etanol og farget med Giemsa løsning (i midten panel). Kvantifisering av antall transformerte foci som bestemt ved anvendelse av standardkriterier (panel høyre). Feilfelt representerer sd
Diskusjoner
Aur-A kinase er knyttet til sentrosomen fra tidspunktet for sentrosomen dobbeltarbeid gjennom å mitotisk exit, og er også assosiert med regioner i mikrotubuli proksimale til centrosomes i mitose [2]. I somatiske celler, både proteinnivåer og kinaseaktiviteten av Aur-A topp i løpet av mitose, og deretter falle (supplerende figur, fig S1) [4], [29]. Det har blitt avdekket at Aur-A er ubiquitylated av APC
Cdh1 ved utkjørselen av mitose [18], [19], [23], [24], [28]. APC
Cdh1 ubiquitin ligase kompleks gjenkjenner proteiner som inneholder enten D-Box eller KEN-box motivene [30] – [32]. Faktisk har Aur-A fire D-Box og en KEN-box motiver. Her vi bekreftet at den C-terminale D-box og N-terminale A-boksen (
47RxLxPSN
52) var vesentlig for nedbrytning av human Aur-A, i likhet med tidligere rapporter [20] – [ ,,,0],22]. Videre
Xenopus
Ser53 i A-boksen er fosforylert under mitose og at fosforylert Ser53 (eller 51 i menneskelig) er avgjørende for mitotisk bestemt stabilisering [23], [24]. Vi fant også at Ser51 fosforylering hemmet APC
Cdh1-mediert degradering. Som vist i figur 3A, Aur-B har også fire D-Box, en KEN-box motiver og lignende A-box sekvenser til Aur-A. Selv om det har nylig blitt rapportert at protein nivået på Aur-B er også styrt av APC
Cdh1 [33], [34], i vår studie, gjorde Aur-B uttrykksnivået ikke endres etter kotransfeksjonen med Cdh1 (Figur 2A). Interessant, Aur-B E32A og E32S mutanter (Glu32 tilsvarer Ser51 av Aur-A) ble degradert av APC
Cdh1 (figur 3C og D), sterkt antyder at Aur-B ikke kan bli redusert på grunn av fosforylering ligne på Glu32 . Alt i alt tyder på at fosforylering på Ser51 spiller en viktig rolle for stabilisering av Aur-A-proteinet. Interessant, fosforylering på Ser51 ble ikke observert i kinase inaktive mutant, noe som tyder på at fosforylering Ser51 kan reguleres i det minste av Thr288 fosforylering (figur 4D og E). Ser51 fosforylering ble observert i mitose og forsvant før mink protein nivå på Aur-A (figur 4C). Derfor foreslår vi at Ser51 fosforylering kan kontrollere stabiliteten Aur-A protein nivå og de-fosforylering av Ser51 kan være en trigger for Aur-A degradering. Interessant, det nylig er blitt rapportert at proteinfosfatase PP2A og Aur-A er co-lokalisert på celle polene under mitose [35]. Vi fant at Ser51 fosforylering av Aur-A ble indusert etter 2 timer av PP2A-inhibitor behandling i HeLa-celler (S. Kitajima og Y. Kudo upubliserte data). Disse funnene sterkt at PP2A kan kontrollere Aur-A nedbrytning av de-fosforylering Ser51. Videre er det kjent at defekter av PP2A-fosfatase ble påvist ved noen kreftformer og flere PP2A-inhibitorer kan føre til malign forandring [36]. Disse funnene gjort oss hypoteser om at lidelse av PP2A kan indusere konstituerende fosforylering på Ser51 av Aur-A i kreftceller. Derfor har vi undersøkt status for PP2A og korrelert med Aur-A Ser51 fosforylering status i hode og nakke kreft cellelinjer. Imidlertid PP2A-ekspresjon ble ikke korrelert med Ser51 fosforylering status i kreftcellelinjer (supplerende figur, fig. S2). Videre undersøkte vi mutasjonsanalyse av
PPP2R1B
-genet, som koder for beta-isoformen av A-underenhet av PP2A.
PPP2R1B
ble identifisert som en antatt human tumor suppressor genet og mutasjon av
PPP2R1B
ble observert i lunge og tykktarm kreft [37]. Vi kunne ikke observere noen mutasjon av
PPP2R1B
genet i hode og nakke kreft cellelinjer (data ikke vist). Dessverre kunne vi ikke finne den mulige sammenhengen mellom PP2A og Aur-A Ser51 fosforylering status i kreft. For å demonstrere sammenhengen mellom PP2A og Aur-A Ser51 fosforylering status må videre forsøk.
I likhet med Aur-A regulering av fosforylering, er CDC6 beskyttet mot APC-deirected nedbrytning på grunn av det er fosforylering [38]. Fosforylerte områder av CDC6 av cyclin E-CDK2 ligger i direkte tilknytning til D-boksen, og dermed hindre anerkjennelse av CDC6 av APC
Cdh1. I tilfelle av Aur-A, Ser51 ligger langt fra D-boksen, men Ser51 er plassert i A-boksen, som også er essensielt for ubiquitylation. Imidlertid kan S51D Aur-A mutant samt vekt og S51D mutant binde seg til Cdh1 (tilleggs figur, fig. S3A). Overraskende, Aur-A binder seg til Cdh1 og APC komponent, Cdc27 ved M fase (supplerende figur, fig. S3b og C). Som
in vitro
ubiquitylation ble hemmet i S51D mutant (figur 2G), foreslår vi at Ser51 fosforylering kan forstyrre ubiquitylation prosessen ved APC
Cdh1. Selv om rollen av APC subenheter i underlaget anerkjennelse er mer mystisk, ikke bare samspillet mellom underlag og co-aktivatorer, men også de mellom underlag og APC synes å være D-box avhengig [39], [40]. Mutasjonsanalyser har vist at doc1 er viktig for evnen til APC til ubiquitylate substrater på en måte processive [41]. Derfor kan fosforylering på Ser51 forstyrre erkjennelsen av APC-underenheter som doc1, men det finnes en rekke andre muligheter. For å klargjøre mekanismen for beskyttelse av Aur-A degradering ved fosforylering på Ser51 videre studier vil være nødvendig. I tillegg er det interessant å undersøke hvorvidt eller ikke regulering av APC-formidlet proteolyse ved fosforylering, som finnes i Aur-A og CDC6, er en vanlig hendelse blant andre substrater.
Aur-A er blitt rapportert å være overuttrykt i et bredt spekter av humane kreftformer, og dets overekspresjon induserer Aneuploidy, sentrosomen forsterkning og tumorigen transformasjon i dyrkede humane og gnagerceller [3] – [5]. Som Aur-A er kartlagt til kromosom 20q13.2, en region som vanligvis amplifisert i humane cancere [4] – [6], overekspresjon av Aur-A er antatt å være forårsaket av genamplifikasjon eller transkripsjonen aktivering. I denne studien fant vi at høy uttrykk for Aur-A protein ble ikke bare forårsaket av genamplifikasjon og mRNA overekspresjon i hode og nakke kreft cellelinjer. Dette funn understøttes av foregående å finne at amplifikasjon av
Aur-A
ble detektert i bare 3% av tilfellene, men mer enn 60% av tilfellene overuttrykt Aur-A mRNA og protein i hepatocellulært karsinom [42]. Lignende avvik mellom forsterker og overekspresjon priser ble også rapportert i brystkreft [5], magekreft [26] og eggstokkreft [12]. Dette avviket kan forklares med våre funn at Ser51 konstituerende fosforylering ble observert i hode og nakke kreft celler med overekspresjon av Aur-A protein. Faktisk Ser51 fosforylering ble også observert i hode og nakke kreft vev med Aur-A protein overekspresjon. Som Ser51 fosforylering hemmet APC
Cdh1-mediert degradering, vi sterkt at konstituerende fosforylering på Ser51 kan indusere protein stabilisering og påfølgende akkumulering i kreftceller som viser overekspresjon av Aur-A protein (figur 7). Det har nylig blitt avdekket at mus embryonale fibroblaster ikke viser den transformerte fenotype når Aur-A ble overexpressed [43], og at transgene mus som overuttrykker Aur-A ikke utvikler ondartede svulster [44]. Videre er det tilsvarende protein ble ikke påvist i ekstrakter, til tross for forhøyede transkripsjoner for Aur-A i flere organer hos transgene mus, og til behandling av transgene-avledede embryonale fibroblaster med proteasomhemmere markert øket proteinnivået av transgene Aur-A [27]. Derfor kan undertrykkelse av protein nedbrytning være viktig for Aur-A overekspresjon og dens onkogen rolle. Cell transformasjon av Aur-A overekspresjon kan kreve undertrykkelse av protein degradering, ikke flere faktorer. Viktigere, en Aur-A S51D mutant viste en betydelig høy mottakelighet for transformasjon (figur 6C). I sammendraget, foreslår vi at beskyttelse av sin protein degradering av konstituerende fosforylering på Ser51 kan indusere Aur-A overekspresjon i kreft, og at ikke-nedbrytende Aur-A kan ha sterke onkogene roller. Derfor kan regulering av Aur-A fosforylering være en roman mål for kreftbehandling.
I løpet av mitose, er Aur-A fosforylert på Ser51 i normale celler. På mitotisk exit, er Aur-en de-fosforylert av PP2A og ubiquitylated av APC
Cdh1. På den annen side er Aur-A konstitutivt fosforylert på Ser51 i kreftceller. Derfor kan Aur-A ikke ubiquitylated og dermed akkumulert i kreftceller.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
Proteasome inhibitor ZLLL (Z-Leu Leu-Leu-CHO) ble oppnådd fra Peptide Institute økes. (Osaka, Japan). Cycloheximide (CHX), nocodazol (NOC) og okadainsyre (OA) ble oppnådd fra Sigma. Den Aur-A fosfo-Ser51-spesifikke antistoff ble dannet ved å immunisere kaniner med syntetiske peptid P * SNSSQRIPC, tilsvarende aminosyrene 50-59 av humant Aur-A-sekvens med en fosfo-serin i posisjon 51 (* S). Antistoffet ble renset fra serum ved hjelp av to runder med affinitetskromatografi på en fosfo-peptid-Ser51-kolonne etterfulgt av en ikke-phosphopeptide kolonne.
