Abstract
En standard behandling for avansert stadium kreften er kirurgisk fjerning av ondartede svulster følgende ved adjuvant kjemoterapi og kjemoradioterapi . I tillegg kan neoadjuvant kjemoterapi brukes om nødvendig. I løpet av tidsforløpet av behandlinger, er pasienter vanligvis etterfulgt av computertomografi (CT) overvåking, og ved tumordiagnose markør. Men i dag, tidlig tegn på tilbakefall og /eller metastasering av svulster med en klinisk relevant biomarkør er fortsatt en stor terapeutisk utfordring. Spesielt har det ikke vært validert biomarkør for å forutsi behandlingsresultatene i terapeutiske innstillinger. Nylig har vi sett på glycoforms av serum α
1-syre glykoprotein (AGP) ved å bruke en krysset affinoimmunoelectrophoresis med to lektiner og en anti-AGP antistoff. De primære glykan strukturer av AGP ble også analysert ved hjelp av et massespektrometer og en ny programvare i et stort antall pasienter med forskjellige cancere. Følgelig er den relative overflod av α1,3fucosylated glykaner i AGP (FUCAGP) funnet å være signifikant høy hos kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller. Videre ble påfallende forhøyede nivåer av FUCAGP funnet hos pasienter med dårlig prognose, men ikke i pasienter med god prognose. I denne studien ble nivåene av FUCAGP i serumprøver fra ulike kreftpasienter analysert og 17 pasienter inkludert 13 som hadde gjennomgått kjemoterapi ble fulgt i flere år etter operasjonen. FUCAGP nivå bestemmes flittig ved hjelp av et massespektrometer ble funnet å endre seg med sykdomsprognose, så vel som med responser til behandling, særlig til forskjellige kjemoterapier. Derfor FUCAGP nivåer målt under oppfølging av pasientene etter operasjonen viste seg å være klinisk relevant biomarkør for behandlingstiltak
Citation. Yazawa S, Takahashi R, Yokobori T, Sano R, Mogi A, Saniabadi AR, et al. (2016) Fucosylated Glykaner i α1-glykoprotein for Overvåking behandlingsresultatene og prognose av kreftpasienter. PLoS ONE 11 (6): e0156277. doi: 10,1371 /journal.pone.0156277
Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 1 mars 2016; Godkjent: 11 mai 2016; Publisert: 13 juni 2016
Copyright: © 2016 Yazawa et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
forekomsten av tumor-tilknyttede glykan endring av strukturer i glykoproteiner og glykolipider uttrykt på tumorcelleoverflaten, noe som fører til sekresjon av slike molekyler med avvikende glykaner i plasma som tumor-assosierte antigener er viden kjent [ ,,,0],1,2]. I mellomtiden har en rekke tumorassosierte, sukkerbasert antigener allerede blitt isolert og godkjent for fortrinnsvis forutsi tilstedeværelsen av svulster hos pasienter, og noen har funnet klinisk anvendelse som tumormarkører, inkludert carcinoembryonic antigen (CEA) [3,4] , karbohydrat antigen 19-9 (CA 19-9) [5,6], α-fetoprotein (AFP) [7,8], kreft antigen 125 (CA125) [9,10], sialyl Lewis Xi (SLX-i) [11,12] og sialyl-Tn (STN) [13,14] antigener. Disse biomarkører reflektere fremgang i siste forsøk på å oppdage ondartede svulster og følge deres prognose under behandling intervensjon. Men siden de diagnostiske krefter disse markørene er ofte begrenset av lav sensitivitet og høy falske positiver, diagnosen er utført i kombinasjon med alternative biomarkører for å akselerere positive priser og nøyaktighet i praksis innstillinger. For eksempel, i bukspyttkjertelkreft, blir en analyse av serum CEA, CA 19-9, CA 242, og er kjent for å ha forbedret spesifisitet og sensitivitet for diagnose og prognose av kreft i bukspyttkjertelen pasienter [15]. Kombinert bruk av flere tumormarkører har også blitt søkt i andre kreftpasienter [16-19]. Imidlertid synes den kliniske verdi av tumorassosierte antigener i serumprøver for å være begrenset som tumormarkører hos pasienter med gastrisk og lunge cancer, spesielt når et tidligere klinisk stadium er vurdert. Videre, siden nivået på slike antigener utskilt fra svulster celler i plasma er ikke tilstrekkelig for å nå en positiv range [20.21], vi har vært på jakt etter en passende og pålitelig ny biomarkør.
Blant de glycosylgrupper sammenhengene funnet i glykan-baserte tumorassosierte antigener, α1,3fucosyl rester festet til GlcNAc-rester er en av de mest vanlige konstruksjoner uttrykt i tumorceller med meget rikelig og avvikende eksistens i plasma og /eller serum som Lex (Galβ1,4 [Fucα1,3 ] GlcNAc), sialyl lex (NeuAcα2,3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc), sialyl lex-i (NeuAcα2,3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAcβ1,3Galβ1,4GlcNAc), poly lex ((Galβ1,4 [ ,,,0],Fucα1,3] GlcNAc)
n) og Ley (Fucα1,2Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc) antigener [1, 22-24] (fig 1).
Ett molekyl av AGP besitter fem sukkerkjedene inkludert diantennary, triantennary og tetraforgrenede glykaner, henholdsvis. Alle muligheter er vist i parentes og «*». Den felles kjerne Strukturen består av [Man]
3 [GlcNAc]
2 * Gjentatt
N
-acetyllactosamine struktur [(Galβ1,4GlcNAc)
n] vedlagt. Se detaljene i tekst.
α
1-syre glykoprotein (AGP) er en stor plasma glykoprotein med en molekylvekt på 41-43 kD og med svært forgrenet
N
-bundne glykaner, som er syntetisert i, og utskilt fra leveren til plasma [25]. Potensialet fysiologiske betydning av AGP har vært undersøkt som en akutt fase-protein, og ikke bare kvantitative forandringer av molekylet, men også kvalitative endringer til sine glykan strukturer har blitt studert i forbindelse med inflammasjon, graviditet, østrogenbehandling, kreft, leversykdommer og autoimmune sykdommer som revmatoid artritt [25-32]. Strukturelle analyser av AGP-glykaner har avslørt at de består av fem komplekse typen
N
-bundne sukkerkjedene inkludert diantennary, triantennary og tetraforgrenede glykaner, og sialysering oppstår på de fleste av terminal Gal rester av fire kjeder. Den (sialyl) LEX determinanter som er tilstede på den lactosamine (Galβ1,4GlcNAc) strukturer i både tri- og tetraforgrenede glykaner og langstrakte tetraforgrenede de med repeterende lactosamine strukturer som vist i figur 1 [25,33]. Nylig undersøkte vi AGP glycoforms i et stort antall serumprøver fra kreftpasienter samt friske kontrollpersoner ved hjelp av en krysset affinoimmunoeleoctrophoresis (CAIE) med Con A lektin,
Aleuria aurantia
lektin (AAL) og anti-AGP antistoff [34]. Følgelig ble pasienter med utbredt kreftsykdom som hadde AGP glycoforms inneholder svært forgrenede og fucosylated glykaner i lange perioder etter kirurgiske inngrep funnet å ha en dårlig prognose. I motsetning til dette, var pasienter som hadde AGP-glykoformer uten slike endringer forventes å ha en god prognose uavhengig av deres kliniske faser. I tillegg serum AGP nivåer i preoperative pasienter var betydelig høy sammenlignet med nivået i friske kontroller. Imidlertid ble ingen åpenbar forskjell sett mellom pasienter med hensyn til serum AGP nivåer og deres clinicopathological funksjoner, inkludert deres prognose etter operasjonen. I tillegg, i vår nylig studie [35], har vi utviklet et nytt system for fullstendig analyse av serum AGP-glykaner ved hjelp av et massespektrometer og en hjemmelaget programvare (AGPAS) som tillater meget hurtig bestemmelse av primære strukturer av AGP-glykaner. Det ble da påvist at endringer i AGP-glykaner etter drift kan faktisk brukes som en ny biomarkør for overvåking og forutsi pasientenes prognose. Nemlig, ble relative overflod av fucosylated tri- og tetraforgrenede glykaner i AGP-molekylet (FUCAGP) funnet å være signifikant høyere hos kreftpasienter sammenlignet med friske kontroller. Videre ble sterkt forhøyede nivåer av FUCAGP funnet spesielt hos pasienter med dårlig prognose, men ikke i pasienter med god prognose. Siden AGP nivåene ble funnet å reagere på endringer i kliniske hendelser, har vi også fokusert på serum AGP nivåer samt FUCAGP i de samme serumprøver fra 30 pasienter med ulike kreftformer. Av disse 17 pasienter inkludert 13 pasienter som gjennomgikk kjemoterapi ble fulgt i en lang periode etter operasjonen basert på deres clinicopathological status.
Formålet med denne studien var å vurdere FUCAGP som en ny glykan-baserte biomarkør for å forutsi kliniske resultater sammen med pasientenes respons på medisiner inkludert ulike chemotherapies.
Materialer og metoder
Materialer
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble tatt fra pasienter med ulike typer maligniteter (n = 30 ) som ble innlagt på Gunma universitetssykehus (Maebashi, Japan) sammen med retningslinje om informert samtykke og godkjenning fra etikkomiteen i Gunma Universitetet Graduate School of Medicine. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen i Gunma Universitetet Graduate School of Medicine, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle givere. Alle kliniske faser ble bestemt av TNM klassifisering av ondartede svulster [36]. De består av pasienter med mage (n = 9), tykktarm (n = 8), lunge (n = 5), spiserør (n = 4), lever (n = 2), rectum (n = 1) og bukspyttkjertel (n = 1) kreft (figur 2). Blant dem, ble 17 pasienter inkludert 13 de som gjennomgikk ulike chemotherapies fulgt opp under lange pre- og postoperative perioder og ble undersøkt i detalj som beskrevet nedenfor (tabell 1). Blodprøver ble også hentet fra frivillige som friske kontroller (n = 21). Serumprøver ble fremstilt i løpet av flere timer etter at blodprøvetaking og ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. HiTrap DEAE FF, HiTrap SP FF og HiTrap Desalting ble kjøpt fra GE Healthcare (Amersham Place, UK). PNGase F var fra Roche Applied Science (Indianapolis, USA). BlotGlyco ble oppnådd fra Sumitomo Bakelite, Co (Tokyo, Japan). Menneskelig AGP og 2,5-dihydroksybenzosyre ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Trypsin, DTT, og andre organiske midler for BlotGlyco ble anskaffet fra Wako Pure Chemical Co. (Tokyo, Japan). Anti-human AGP-kaninserum ble oppnådd fra DAKO (Carpinteria, CA, USA) og peroksydase-konjugert anti-human AGP var fra Abcam (Cambridge, UK). Tumorassosierte antigener i serumprøver målt i denne studien var CEA, cytokelatin 19 fragmenter (Cyfra), CA 19-9, neuron spesifikk enolase (NSE), plateepitelkarsinom (SCC) og SLX-i. Nivåer av hvert antigen ble bestemt ved en ELISA med Cobas system (Roche for CEA, Cyfra, CA 19-9 og NSE), arkitekten system (Abbot for SCC) og ved en RIA (Otsuka for SLX-i) følge produsentens bruksanvisning. Standard cut-off verdiene for hvert antigen ble satt til 5,0 ng /ml for CEA, 2.8ng /ml for Cyfra, 37 U /ml for CA 19-9, 12 ng /ml for NSE, 1.5ng /ml for SCC og 38 U /ml for SLX-i, henholdsvis.
FUCAGP, relative overflod av fucosylated tri- og tetraforgrenede glykaner i AGP ble hentet fra MS analyse. AGP Konsentrasjoner ble bestemt med en ELISA. † En person (pasienten N i figur 3) ble ekskludert. Prøver som ble oppnådd ved en (*) og to (◆) postoperative dager. #Patients Gikk neoadjuvant kjemoterapi. Kliniske stadier av hver pasient ble vist i parentes. Loddrett strek indikerer cut-off nivå av FUCAGP satt i denne studien.
Bestemmelse av serum AGP nivåer
AGP nivåer i serumprøver ble målt med en sandwich-type ELISA hjelp anti-humant AGP-antistoff og pepperrot peroksidase-konjugert anti-human AGP som tidligere beskrevet [34]. Resultatene fra ELISA av AGP-konsentrasjoner i friske kontrollgruppen indikerte at cut-off-verdien var 807μg /ml [34].
Rensing av serum AGP
AGP ble renset fra 0,5 ml av serumprøver basert på den tidligere metoden [35] med en svak modifikasjon som tillater en rask og enkel renseprosedyren. Dermed vil en nyutviklet enhet (AGP-prep-DOCK) som består av direkte koblet fem søyler, nemlig en HiTrap avsalting, en HiTrap DEAE FF, to HiTrap avsalting og ett HiTrap SP søyler, ble satt opp. Det ble strømmet med et sett av forskjellige bufferløsninger [35] ved hjelp av en programmert pumpe gjennom den tre-veis hane forbundet med respektive kolonner. Ved hjelp av AGP-prep dokken, ble renset AGP oppløsning erholdt fra den endelige HiTrap SP kolonne i løpet av kort tid, og på samme renhet som tidligere beskrevet [35]. Den rensede AGP ble brukt til fremstilling av merket
N
-glycans fulgt av massespektrometrisk analyse.
Forberedelse og merket
N
-glycans av AGP
N
-Glycans og merket
N
-glycans av AGP ble fremstilt i henhold til protokollen til glykosyleringen kit (BlotGlyco) med en lett modifikasjon som tidligere beskrevet [35]. I korthet prøver ble spaltet med trypsin og PNGase F og den resulterende
N
-glycans ble merket ved hjelp av BlotGlyco. Etter merking med aoWR reagens, ble en nøyaktig ms av hver sukker endret som følger: MW merket sukker = [et nøyaktig ms] – [H
2o (18,0105)] + [aoWR (447,223)] + [CH
3 (14.0156) xn] + [H (1,0078)], der n angir antall
N
-acetylneuraminic syrerester.
Massespektrometrisk analyse av
N
-glycans av AGP
en ul av prøveoppløsningen ble blandet med 1 ul av matriseoppløsningen (10 mg av 2,5-dihydroksybenzosyre i en blanding av 300 ul acetonitril og 700μl destillert vann). Da en pl av den blandede oppløsningen ble avsatt på en MALDI måleplaten (Ground stål BC, Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland) og fikk tørke. Massespektrometri data ble oppnådd ved hjelp av et MALDI-TOF /TOF ultrafleXtreme (Bruker) i reflektoren, positive ion modus typisk summere 20.000 skudd. All spektra i massen område av m /z 1000-5000 ble innhentet og deisotopic massene for hver topp plukket ble eksportert som en masse topp liste med hver verdi av både tyngdepunktet masse og det tilsvarende området til hjemmelaget, drift programvare, AGPAS nylig utviklet [35].
Identifikasjon av
N
-glycans av AGP
Hver sukkermolekyl ble forkortet ved hjelp av et firesifret tall som angir antall galaktose ( gal),
N
-acetylglucosamine (GlcNAc), fucose (Fuc) og
N
-acetylneuraminic syre (NeuAc) rester som består av hver glykan unntatt felles kjerne struktur ([mannose (Man) ]
3 [GlcNAc]
2) (fig 1). Fire hundre og femti-tre teoretisk spådd glykaner og 154 denaturert glykaner maksimalt spådd til å bli gitt gjennom merking prosessen ble hentet for å utgjøre databasen av AGPAS [35]. Alle de primære strukturer av AGP-glykaner ble derfor plassert hurtig, og i tillegg, ble ikke bare den relative overflod av hver glykan, men også at av fucosylated tri- og tetraforgrenede glykaner (FUCAGP) samtidig beregnes ved hjelp av deres tilsvarende område. Cut-off verdi på FUCAGP var vilkårlig sett på gjennomsnitts + S.D. av friske kontroller (= 25,01), som beskrevet tidligere [35]. En bedre versjon med noen forbedring for tildeling av glykaner i AGPAS ble brukt i denne studien, og den relative overflod av glykaner helt hit var 76,18 ± 8,27% (n = 298).
Pasienter og behandlinger
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP fra 30 pasienter med forskjellige maligniteter og i forskjellige kliniske stadier sett i figur 2 ble samlet før og etter kirurgiske inngrep. Blant disse ble 17 pasienter med mage, spiserør, lunge og tykktarm adenokarsinomer fulgt for lange postoperative dager (POD). Den standard adjuvant kjemoterapi og forskjellige kjemoterapier inkludert neoadjuvant kjemoterapi (primær systemisk kjemoterapi, PSC) ble utført i 13 av de 17 pasienter i henhold til sine individuelle regimer med opp til den fjerde linje av behandlingen (tabell 1). Disse 17 pasienter ble klassifisert i 5 undergrupper basert på deres prognostisk status som følger. Pasienter som fikk kjemoterapi (Chemo /+) eller ingen kjemoterapi (Chemo /-) behandling og døde med en kort overlevelse etter operasjon (Short overlevelse); pasienter som døde med en forlenget overlevelse etter gjentatte behandlinger av kjemoterapi (Long overlevelse); pasienter som gjennomgikk kjemoterapi, svarte godt og overlevde under oppfølgingsperioden (Alive, Chemo /+); pasienter som overlevde uten kjemoterapi behandling i løpet av oppfølgingsperioden (Alive, Chemo /-).
Fastsettelse av en
FUT6
genet mangelfull pasient
Genomisk DNA ble ekstrahert fra perifere blodprøver ved standard fenol-kloroform-ekstraksjon metode.
FUT6
genet locus ble PCR-forsterket med ty-en og ty-2 primere [37]. Nukleotidsekvenser av PCR produktene ble bestemt ved en direkte sekvens ved hjelp av spesifikke primere for målet.
Resultater
Nivåer av FUCAGP og AGP i serumprøver fra kreftpasienter og friske kontroller
n
-glycans av AGP i serumprøver fra preoperative pasienter med forskjellige maligniteter og i ulike kliniske stadier (n = 30) og fra friske kontroller (n = 21) ble analysert ved et massespektrometer. Ved hjelp av den AGPAS programvaren, var relative overflod av hver glykan bestemt samtidig, og deretter, relative overflod av fucosylated tri- og tetraforgrenede glykaner i AGP (FUCAGP) ble oppnådd (Fig 2). Forholdsvis lave nivåer av FUCAGP ble funnet i fire av de åtte pasienter som Prøver ble oppnådd ved en dag etter operasjon (POD). Videre kan en av de to pasientene (pasient E i tabell 1) som gjennomgikk neoadjuvant kjemoterapi (PSO) viste det laveste nivået av FUCAGP (18,17%). Men nivåer av FUCAGP i kreftpasienter var fortsatt betydelig høy sammenlignet med friske kontroller (gjennomsnitt ± S.D .: 32,25 ± 6,89 vs. 20,70 ± 6,61;
P
0,05). Nivåer av serum AGP konsentrasjon i de samme prøvene ble også sammenlignet i både pasienter og friske kontroller, og signifikant økte nivåer ble funnet i pasienter (gjennomsnitt ± SD 2507,33 1093,14 ± vs. 1119,75 ± 456,65;.
P
3313 (a) 3312 (b), 4413 (c), 4414 (d), 4424 (e), 4412 (f), 4423 (g) og 3323 (h). Se detaljene i tekst.
Diskusjoner
Proteiner er ofte modifisert post-translatorisk og mer enn halvparten av alle proteiner i naturen er glykosylert [39] noe som resulterer i å være til stede som glykoproteiner med kovalent glykaner som har svært heterogene og varierte strukturer. Det må derfor være sannsynlig at disse glykaner har betydelig innblanding og ansvar for struktur og funksjon av slike glykoproteiner. Det har blitt anerkjent som glykaner spiller viktige roller i ikke bare proteinfolding og rydding, men også celle til celle interaksjon, anerkjennelse og bindende sammen med hyppige forekomster av endringer i glykaner seg [40-42].
