Abstract
Fangchinoline er en bisbenzylisoquinoline alkaloid isolert fra Radix
Stephaniae tetrandrae
S . Moore. Fangchinoline og dets struktur analog, tetrandrine, viste direkte binding affinitet med rekombinant humant proteasome β1 subenhet og også hemmet aktiviteten
in vitro
. I dyrkede prostata PC-3-celler og LNCaP-celler, kunne fangchinoline doseavhengig inhiberer celleproliferasjon og caspase-lignende aktivitet av cellulær proteosomet som er mediert av proteasom β1 subenhet. Den hemmende virkning av fangchinoline på kaspase-lignende aktivitet av proteasomet ble også observert i renset human erytrocytt 20S proteasomet. I PC-3 celler, fangchinoline indusert cellesyklus arrest i G0 /G1 fase og apoptose. Behandling av PC-tre tumorbærende nakne mus med fangchinoline hemmet tumorvekst, apoptose og også forårsaket nedgang i proteasomer aktiviteter i tumorxenotransplantater. Doseavhengig og tidsavhengig opphopning av ubiquitinmolekyler og viktige proteasomer substrater, så som p27, Bax og IkB-α ble observert i fangchinoline-behandlede celler. Over-uttrykk for proteasome β1 subenheten av plasmid transfeksjon økt følsomhet av celler til cytotoksisitet av fangchinoline mens knockdown av proteasome β1 subenhet bedres cytotoksisitet av fangchinoline i PC-3 celler. Resultater av denne studien antydet at proteasomhemmingen var involvert i anti-kreft effekt av fangchinoline. Fangchinoline og dets struktur analoger kan være nye naturlig proteasomhemmere rettet mot β1 subenheten
Citation. Li D, Lu Y, Sun P, Feng L-X, Liu M, Hu L-H, et al. (2015) Hemming på Proteasome β1 subenheten kan bidra til anti-kreft effekt av Fangchinoline i menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 10 (10): e0141681. doi: 10,1371 /journal.pone.0141681
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, TAIWAN
mottatt: 20 mars 2015; Godkjent: 11 oktober 2015; Publisert: 29 oktober 2015
Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Shanghai Science Teknologi Support Program (13431900401), Nature Science Foundation National of China (81373964), Shanghai Science Technology Innovation Handlingsprogram (15140904800), National Science Teknologi Major Prosjekt of China (2014ZX09301-306-03), og den tolvte femårs National Science Teknologi Support Program (2012BAI29B06). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd, gitt støtte i form av lønn for forfattere YL, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Yu Lu er ansatt i Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd Det er ingen patenter, produkter under utvikling, eller markedsført produkter til erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Proteasome har dukket opp som et viktig og effektivt mål for anti-kreft terapi [1]. I vår screening av naturlig proteasomhemmere, fangchinoline og tetrandrine, to bisbenzylisoquinoline alkaloider isolert fra tørket rot av
Stephaniae tetrandrine
S. Moore (familie, menispermaceae), kjent som Fangji i Kina, ble funnet å ha direkte bindende affinitet med rekombinant humant proteasome β1 subenhet og også hemmet aktiviteten
in vitro
. Fangji er en tradisjonell kinesisk medisin (TCM) som var blitt anvendt i klinikken som en smertestillende, antirevmatisk, og antihypertensive medikament for en lang tid i Kina [2, 3]. Rapporterte aktivitetene til Fangji inkludert anti-kreft effekt [2, 4], anti-inflammatoriske effekter [5], kardiovaskulære effekter [6, 7], og så videre De viktigste aktive komponentene i Fangji var blitt funnet å være fangchinoline og tetrandrine [2- ]. De kjemiske strukturer av fangchinoline og tetrandrine ble vist i figur 1A og figur 1B, respektivt. Renset tetrandrine var blitt tatt opp av Kina Food and Drug Administration for å bli brukt i klinikken for behandling av inflammatoriske sykdommer så som silikose [8] og ble også brukt i behandling av kreft [9]. Så vidt vi vet, verken noen renset forbindelse isolert fra Fangji eller rå ekstrakt av Fangji hadde blitt rapportert før å ha proteasomer hemmende effekter. Proteasomet er kjent for å spille roller i utvikling av kreft, inflammatoriske sykdommer og kardiovaskulære sykdommer [10]. Derfor kan det være interessant å undersøke om proteasomhemmingen er involvert i effektene av fangchinoline, tetrandrine samt Fangji.
(A) Kjemisk struktur av fangchinoline. (B) Kjemisk struktur av tetrandrine. (C) Real time bindende affinitet målinger av fangchinoline til rekombinant proteasome β1 subenheten protein. (D) Real time bindende affinitet målinger av tetrandrine til rekombinant proteasome β1 subenheten protein. (E) enzymaktiviteter av rekombinant proteasomet β1 subenhet med eller uten tilstedeværelse av fangchinoline ved forskjellige konsentrasjoner. (F) Enzymatiske aktiviteter av rekombinante proteasomet β1 subenhet med eller uten tilstedeværelse av tetrandrine ved forskjellige konsentrasjoner. Data var statistiske resultatene av tre uavhengige forsøk.
Begge fangchinoline [2, 11-14] og tetrandrine [4, 15-26] hadde blitt rapportert å ha anti-kreft effekt
in vitro Hotell og
in vivo
. I denne studien har vi fokusert på å studere de anti-kreft effekt av fangchinoline. Tidligere rapporter har vist at, fangchinoline kan indusere cellesyklus-stans [11, 13, 14, 27] og apoptose [2, 14, 27] i dyrkede kreftceller. Det var også en rapport om kreft aktiviteter fangchinoline
in vivo product: [13]. I den foreliggende undersøkelse, ble den anti-kreft-effekter av fangchinoline evaluert i dyrkede PC-3-celler, dyrket LNCaP-celler og PC-3 tumor-bærende nakne mus. Både hemmende effekter av fangchinoline på aktiviteter av mobilnettet proteasome i kreftceller og på aktiviteter renset menneskelige 20S proteasome ble sjekket. Effektiviteten av proteasomet som et mål for cancerterapi var basert på det faktum at de ubiquitin proteosomet systemet var ansvarlig for nedbrytning av mange viktige intracellulære proteiner som er involvert i kritiske cellulære prosesser som cellesyklusprogresjon, proliferasjon og apoptose [28-30]. Derfor er virkningen av fangchinoline behandling på nedbrytningen av viktige proteasomer substrater såsom p27 som spilte rolle i cellesyklusprogresjon, Bax som var involvert i apoptose, og IkB som er relatert til NF-kB veien [31] ble ytterligere sjekket ved den foreliggende studere. Videre har vi også observert påvirkning av over-uttrykk for proteasome β1 subenheten eller knockdown av proteasome β1 subenheten på følsomheten celler til cytotoksisitet av fangchinoline.
Samlet våre resultater antydet involvering av proteasomhemmingen i anti -cancer effekter av fangchinoline
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene av denne studien bidra til forståelsen av anti-tumor mekanisme av fangchinoline samt Fangji.
Materialer og metoder
Chemicals
Fangchinoline med en renhet mer enn 98% og tetrandrine med en renhet mer enn 98% ble begge kjøpt fra Shanghai Kilde Leaf Technology Co, Ltd (Shanghai, Kina). Fangchinoline eller tetrandrine ble oppløst i DMSO til en konsentrasjon på 0,1 M som stamløsning og lagret ved -20 ° C. Fluorogene peptidsubstrater Z-LLE-AMC for kontroll proteasome caspase-lignende (C-L) aktivitet og Z-ARR-AMC for å sjekke proteasome trypsin-lignende (T-L) aktivitet var fra Calbiochem, Merck. Fluorogent peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC for å sjekke proteasome chymotypsinlignende (CT-L) aktivitet var fra Sigma-Aldrich. Andre kjemiske midler, unntatt hvor spesielt bemerket, ble kjøpt fra Sigma-Aldrich.
Cell kultur
Menneske PC-3 prostatakreftceller og menneske LnCap prostata kreft celler ble kjøpt fra Cell Resource Center of Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. PC-3-celler og LNCaP-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2. Føtalt bovint serum, RPMI 1640, penicillin og streptomycin var alle fra Hyclone.
Surface plasmonresonans biosensor analyse
rekombinant humant proteasome β1 subenhet, produkt av PSMB6 genet, ble uttrykt som His-tag proteiner ved anvendelse av Escherichia coli, og så renset ved affinitetskromatografi som rapportert i vårt tidligere studium [32]. Bindingsaffinitetene av fangchinoline eller tetrandrine til rekombinant proteasome katalytisk β1 subenhet, ble analysert
in vitro
ved hjelp av en Biacore 3000 instrument (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Sverige) som rapportert før [33] . I korthet, ble rekombinant proteasomet β1 subenhetsprotein immobilisert på en CM5 sensorbrikke som ligand i 11624,5 RU sammen med N-etyl-N «- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid og N-hydroksysuksinimid i henhold til de vanlige primære amin-koblingsprosedyrer, og HBs- EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (v /v) overflateaktivt middel P20, pH 7,4) ble anvendt som den rennende buffer. Ekvilibrering av grunnlinjen ble utført ved en kontinuerlig strøm av HBS-EP gjennom chip overflate i 1 til 2 timer. BIAcore data ble samlet ved 25 ° C med HBS-EP som den rennende buffer ved en konstant strøm på 20 pl /min. Fangchinoline eller tetradrine ble serielt fortynnet til den løpende buffer til 0, 2,4, 3,43, 4,90, 7,0, 10 og 20 uM. Prøvene ble injisert inn i kanalene ved en strømningshastighet på 20 mL /min, etterfulgt av vasking med den rennende buffer. Bindings responsene ble registrert kontinuerlig i respons enheter (RU) med en frekvens på 1 Hz som sensorgrams og presentert som en funksjon av tid. Foreningen (
k
a) og dissosiasjon (
k
d) hastighetskonstanter, ble dissosiasjonslikevektskonstant () bestemmes ved analyse av sensorgram-kurver oppnådd ved forskjellige konsentrasjoner av forbindelsen ved anvendelse av BIA evalueringsprogramvare versjon 3.1 (Biacore) og 1: 1. Langmuir-binding passende modell
-analysen av enzymaktivitet av rekombinant proteosomet katalytisk subenhet β1
i korthet katalytiske aktivitet av rekombinant human-proteasomet β1 subenhet ble analysert ved tilsetning av rekombinant β1 subenhet protein (30 ug) til 100 ul av proteasomet aktivitet analysebuffer (10 mM Tris-HCL, pH 7,8, 5 mM adenosintrifosfat, 0,5 mM ditiotreitol og 5 mM MgCl
2 • 6 H
2o) inneholdende 50 pM Z-LLE-AMC i nærvær av fangchinoline eller tetrandrine ved forskjellige konsentrasjoner eller ikke. Hydrolasegenet aktiviteten proteasome katalytiske β1 subenhet kunne slippe det fluorogene AMC komponent fra underlaget Z-LLE-AMC og AMC utgivelsen ble målt etter to timers inkubering ved hjelp av en mikroplateleser Bio-Rad 550 med eksitasjon og emisjonsbølgelengder av 360 og 465 nm henholdsvis.
MTT analyse av virkningene av fangchinoline om spredning av PC-3 celler og LNCaP celler
De inhibitoriske effekten av fangchinoline om spredning av PC-3 celler eller LNCaP celler ble observert ved å sjekke cellelevedyktigheten av celler ved hjelp av MTT-analysen som beskrevet tidligere [33]. I korthet ble cellene sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml for PC-3-celle, og 4 x 10
4 celler /ml for LNCaP-celler. Etter dyrking over natten, ble mediet forandret til friskt medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av fangchinoline eller 0,1% DMSO (løsningsmiddel kontroll) til 24, 48 timer eller 72 timer. Cellelevedyktigheten ble evaluert ved å måle den mitokondrie-avhengige omdannelse av det gule tetrazoliumsalt MTT til lilla formazankrystaller ved metabolsk aktive celler. Den optiske tetthet (proporsjonal med antallet levende celler) ble målt med en mikroplateleser Bio-Rad 550 ved 570 nm. IC
50 verdi (halv-maksimal hemmende konsentrasjon) ble beregnet ved hjelp av Logit-metoden.
Assay av cellulære proteasomer aktivitetene av PC-3-celler og LNCaP-celler
Celler ble behandlet med enten Løsningsmidlet kontroll (0,1% DMSO), fangchinoline ved forskjellige konsentrasjoner, eller 1 uM carfilzomib (positiv kontroll) i 24 timer ved 37 ° C. De enzymatiske aktiviteter av cellulær proteasomet i cellelysat ble målt som rapportert i vårt tidligere papir [32]. I korthet ble cellene høstet, vasket med PBS og deretter lysert i proteasomet aktivitet analysebuffer i 30 min ved 4 ° C. Homogenatet ble deretter sentrifugert ved 12 000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble oppsamlet som helhet celleekstrakt, og proteininnholdet i supernatanten ble målt ved hjelp av Bradford-reagens. Katalytiske aktiviteter av cellulær proteasomet ble analysert ved tilsetning av hele celleekstrakt (inneholdende 30 ug protein) i 100 ul av proteasomet aktivitet analysebuffer inneholdende 50 uM fluorogene peptidsubstrater for eksempel Z-LLE-AMC for detektering av CL-aktivitet, Z-ARR-AMC for detektering TL aktivitet eller Suc-LLVY-AMC for detektering av CT-L-aktivitet, respektivt. Utgivelsen fluorogent AMC fra peptidsubstrater ble deretter målt som beskrevet ovenfor.
Analyse av CL aktivitet av renset humant 20S proteasomer
20S proteasome testsettet ble kjøpt fra Enzo Life Sciences, Inc . (Farmingdale, NY 11735, USA). K
m, V
max verdier av renset human erytrocytt 20S proteasome for fluorigenic peptidsubstrat Z-LLE-AMC er målt i henhold til instruksjonene fra produsenten. Inaktivering av renset human erytrocytt 20S-proteosomet ved fangchinoline ble bestemt ved overvåking av hydrolyse av substratet i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av fangcinoline. Analyser ble utført ved 37 ° C i en reaksjonsbuffer (50 ul) inneholdende 50 mM Tris /HCl, pH 7,5, 25 mM KCL, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl
2, 0,1 ug 20S-proteosomet og Z-LLE- AMC. Reaksjonene ble tillatt å fortsette i 120 minutter, og fluorescens data ble samlet hver 1 min, og deretter plottet som en funksjon av tid. Den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten, K
i
app, ble bestemt ved ikke-lineær minste-tilpasning av den fraksjon hastighet, v
i /v
0, som en funksjon av [I], der v
i er den stabile tilstand gjenværende aktivitet av enzymet i nærvær av inhibitor (i) og v
0 er den innledende hastighet i fravær av inhibitor (). Dissosiasjonskonstanten Ki, ble beregnet ut fra den tilsynelatende dissosiasjonskonstanten, K
i
app, ved hjelp av følgende uttrykk, hvor [S] er den substratkonsentrasjon og K
m er det substratbindende konstanten () .
induksjon av cellesyklus og apoptose ved fangchinoline i PC-3 celler
induksjon av cellesyklus og apoptose ved fangchinoline i PC-3 celler ble observert ved hjelp flowcytometrisk analyse som beskrevet i våre tidligere rapporter [32-34]. I korthet, for flowcytometri analyse av cellesyklusen, ble cellene samlet opp etter behandling, vasket med PBS og deretter fiksert med 70% etanol ved 4 ° C over natten. Etter PBS-vaskinger ble cellene resuspendert i buffer-farging (10 mg /ml RNase A og 5 mg /ml propidiumjodid i kald PBS) i 30 minutter i mørket ved romtemperatur og deretter analysert ved hjelp av FACSCalibur Flowcytometer. For flowcytometrisk analyse av apoptose, Alexa Fluor 488 Annexin V PI /død celle apoptose Kit (Invitrogen) ble anvendt. Celler ble samlet opp etter behandling, vasket med PBS og deretter resuspendert i bindingsbuffer og deretter inkubert med Annexin V-FITC og propidiumjodid i 15 minutter i mørket ved romtemperatur. Deretter flowcytometrisk analyse ble gjennomført og dataanalyse ble utført med Cellquest programvare.
PC-tre tumor xenograft eksperimenter
Mann naken immunodeficient mus Balb /c-nu-nu, i alderen 4 uker, ble kjøpt fra Shanghai Experimental Animal Center. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences. På dag 0, PC-3 celler (8 × 10
6 celler) suspendert i 0,2 ml serumfritt RPMI 1640 ble inokulert s.c. i den høyre flanken av hver mus (fem mus pr gruppe). 14 dager etter inokulering, ble musene tilfeldig delt inn i 3 grupper og begynte injeksjon med enten bærer eller kontroll fangchinoline ved 25 mg /kg (ip., QD) eller 50 mg /kg (ip., QD). Tumor størrelser ble målt etter 4 dager ved hjelp calipers og deres volumer ble beregnet ved hjelp av en standard formel: bredde
2 × lengde /2. Den relative tumorvolum (RTV) ble definert som forholdet mellom tumorvolumet ved en angitt tid og tumorvolumet ved begynnelsen av medikamentbehandling. Kroppsvekt ble målt daglig. På dag 30 etter vaksinasjon, ble musene avlivet av CO
2 innånding og tumorxenotransplantater ble dissekert. For å visualisere apoptose i tumorxenotransplantater ble TUNEL merking utført for å påvise apoptotiske kjerner ved hjelp In Situ Død Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals). Kort sagt ble tumorxenografter fiksert med 10% formalin løsning ved romtemperatur i 24 timer og deretter innleiret med parafin. Prøvene ble varmet opp i 1 time ved vannbad-Slide Drier (Leica H1 1220, tysk), inkubert med dimetylbenzen for to ganger (8 minutter), og deretter inkubert med 100%, 95%, 90% og 85% etanol i to ganger ( 3 min hver). Prøvene ble deretter inkubert med 0,1 M citratbuffer (pH 6,0) for mikrobølgebestråling. Etter vasking med PBS to ganger (3 min hver), ble skivene inkubert med reaksjonsbuffer (fra In Situ Døds Detection Kit) i en fuktig atmosfære ved 37 ° C i 1 time. Skivene ble deretter vasket med PBS tre ganger (3 minutter hver) for å fjerne ikke-inkorporerte fluorescein-deoksyuridin trifosfat. Kjerner ble motfarget med 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) 1 mg /ml i 3 min og deretter vasket med PBS tre ganger (3 minutter hver). Bilder ble tatt med en 20X objektiv (Olympus BX51, Japan) på en epifluorescence mikroskop. Videre ble proteasomer aktiviteter tumorxenotransplantater analysert. Kort sagt ble tumorxenotransplantater homogenerized i proteasomet aktivitet forsøksbuffer ved hjelp av FastPrep System (MP FastPrep-24, U.S.A), deretter sentrifugering ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatantene ble deretter brukt for analyse av proteasomer aktiviteter ved å bruke fremgangsmåten som beskrevet ovenfor for analyse av cellulære aktiviteter proteasomer.
Western blot-analyse
Western blotting-analyse ble utført som beskrevet tidligere [33, 34] . I korthet, en delmengde av protein (100 ug) Prøven ble applisert på en 12% SDS gel, separert elektroforetisk og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Etter at membranen ble inkubert med 10 mM TBS med 20% Tween 20 og 5% dehydrert skummet melk for å blokkere ikke-spesifikk proteinbinding, ble membranen inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. De primære antistoffer (alt fra Cell Signaling Technology) som ble brukt var kanin polyklonale antistoff mot humant IkB-α (# 4812, 1: 400), Bax (# 2772, 1: 400), proteasome β1 subenhet (PSMB6) (# 13267, 1 : 500), β-aktin (# 4967, 1: 400) og mus monoklonalt antistoff mot humant p27 Kip1 (# 3688, 1: 400) eller ubiquitin (# 3936, 1: 1000). Etter TBS vaskinger, ble blottene inkubert med sekundært antistoff i 2 timer ved romtemperatur ved en 1: 1000 fortynning og deretter visualisert ved hjelp av kjemiluminescens (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA). De sekundære antistoffene som ble brukt var HRP-bundet geit-anti-kanin-IgG (# 7074) og HRP-bundet heste anti-muse IgG (# 7076), begge fra Cell Signaling Technology.
Over-ekspresjon av proteosomet β1 subenhet i PC-3 celler med plasmid transfeksjon
celler med over-uttrykk for proteasome β1 subenheten ble oppnådd ved transfeksjon med pcDNA3.1 plasmid koding full-lengde human PSMB6 cDNA som beskrevet tidligere [34]. For plasmid transfeksjon, 5 x 10
5-celler ble inokulert i hver brønn i en seks-brønns plate inntil cellene nådde omtrent 80% konfluens etter dyrket i 24 timer. 2,5 ug plasmid-DNA som koder for pcDNA3.1 PSMB6 eller pcDNA3.1 plasmid DNA uten PSMB6 (som negativ kontroll) ble fortynnet i 250 ul serumfritt medium og deretter inkubert i 20 minutter ved romtemperatur med en blanding av 10 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen ) og 400 ul serumfritt medium. Den resulterende kompleks blanding ble deretter tilsatt til hver brønn i cellekulturplaten. Etter 6 timers inkubasjon ble komplekst medium erstattet med friskt minimum essensielt medium supplementert med 10% (v /v) FBS og la for å vokse over natten. Deretter G418 (Merck) ble tilsatt til mediet for å oppnå en endelig konsentrasjon som er lik den minste dødelige dose (400 ug /ml). Cellene ble tillatt å vokse og passasje i nærvær av G418 i over 2 uker. Ekspresjon av proteasomet β1 subenhet i de transfekterte cellene ble undersøkt ved hjelp av Western blotting-analyse og sammenlignet med den til villtype-celler og negativ-kontrollceller. Cytotoksisiteten av fangchinoline på celler med overekspresjon av proteasom-β1 subenheten ble deretter sjekket ved hjelp av MTT-analyse som beskrevet ovenfor, og sammenlignet med den til villtype-celler og negativ-kontrollceller.
knockdown av proteasomet β1 subenheten i PC-3 celler ved siRNA transfeksjon
Validert sirnas for PSMB6 (Sigma-Aldrich) ble transfektert inn i PC-3 celler ved hjelp Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll. Egge negative kontroll sirnas (Sigma-Aldrich) ble anvendt som negativ kontroll. Expression nivåer av PSMB6 (proteasomer β1 subenhet) i vide typen celler, PSMB6 knockdown celler (celler behandlet med sirnas for PSMB6), negative kontrollceller (celler transfektert med egge negativ kontroll sirnas) ble sjekket ved hjelp av Western blotting-analyse. For å sjekke påvirkning av proteasome β1 subenheten knockdown på cytotoksisitet av fangchinoline ble cellene transfektert med sirnas for PSMB6 eller egge negative kontroll sirnas for 24 timer. Deretter ble cellene sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 5 x 103 celler /brønn og virkningene av fangcinoline på celleformering ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyse som beskrevet ovenfor. Videre ble virkningene av fangchinoline på markører for apoptose og autofagi i celler med normalt eller knockdown av β1 subenhet kontrolleres ved hjelp av Western blotting-analyse som beskrevet ovenfor. I korthet, etter transfektert med sirnas for PSMB6 eller egge negative kontroll sirnas i 24 timer, ble cellene behandlet med fangchinoline ved 40 uM i 24 timer. Deretter ble cellene høstet for Western blotting-analyse. De primære antistoffene som ble brukt var kanin anti-caspase 3 antistoff (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9662), kanin anti-PARP antistoff (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9542) og kanin anti-LC3B antistoff ( 1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 2775). Det sekundære antistoff som ble brukt var HRP-bundet geit anti-kanin IgG (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 7074).
Statistisk analyse
Student
t Anmeldelser – test ble anvendt for å evaluere forskjellene mellom behandlede og kontrollgrupper. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, og resultatene fra minst 3 uavhengige eksperimenter ble anvendt for statistisk analyse. Stjernene viser en signifikant forskjell (P 0,05) sammenlignet med ubehandlet kontroll
Resultater
bindingsaffiniteter og direkte inhibitoriske effekten av fangchinoline /tetrandrine på rekombinant proteasome ß1 subenheten
Både fangchinoline (fig 1 C) og tetrandrine (fig 1D) viste direkte binding affinitet med rekombinant humant proteasome β1 subenhet. Som vist i figur 1C, øket med økende RU fangchinoline konsentrasjon, noe som indikerte at fangchinoline var i stand til å binde til proteasomet β1 subenheten på en doseavhengig måte. Lignende resultater ble observert for tetrandrine (Fig 1 D). Foreningen (
k
a), dissosiasjon (
k
d) og likevekt dissosiasjon (
K
D) konstanter av fangchinoline eller tetrandrine binding til proteosomet β1 subenheten er vist i tabell 1. resultatene antydet at fangchinoline og tetrandrine oppviste lignende bindingsaffinitet til proteasomet β1 subenhet. Videre kan både fangchinoline og tetrandrine direkte å inhibere enzymaktiviteten av rekombinant proteosomet β1 subenhet
in vitro
. Som vist i figur 1E, fangchinoline doseavhengig inhiberte aktiviteten til rekombinante proteasome β1 subenhet. Lignende resultater ble observert for tetrandrine (Fig 1F).
hemmende effekter av fangchinoline om spredning og cellulær proteasomer aktiviteter kreftceller
Som vist i figur 2A, kan fangchinoline doseavhengig og tidsavhengig reduksjon av levedyktigheten av PC-3-celler. IC
50 verdier av fangchinoline til å inhibere celleproliferasjon i PC-3-celler var 27,53 ± 3,346 uM i 24 timer 13,13 ± 1,579 uM i 48 timer, og 7,247 ± 0,3122 uM i 72 timer behandling, henholdsvis. Videre, som vist i figur 2B, kan fangchinoline doseavhengig inhiberer C-L-aktivitet av cellulær proteosomet, som ble formidlet av proteasom β1 subenhet. Inhiberingen på C-L-aktivitet var signifikant ved doser på 1 og 10 uM fangchinoline. Virksomheten til proteosomet trypsin-lignende (TL) og chymotrypsin-lignende (CT-L) aktiviteter, mediert av proteasomer β2 og β5 subenheten, ble ikke signifikant påvirket av fangchinoline behandling.
(A) Cellenes levedyktighet (MTT analyseresultat) av PC-3-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av fangchinoline til 24, 48 eller 72 timer. Data var statistiske resultater av tre uavhengige eksperimenter. (B) Cellular proteasomer aktivitetene av PC-3-celler behandlet med 0,1% DMSO eller fangchinoline ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. (C) Cellenes levedyktighet (MTT måle resultat) av LNCaP-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av fangchinoline til 24, 48 eller 72 timer. (D) Cellular proteasomer aktivitetene til kontroll PC-3-celler behandlet med 0,1% DMSO (løsningsmiddel kontroll) eller fangchinoline ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer. Data var statistiske resultater av tre uavhengige eksperimenter. *
p
0,05 vs. løsemiddel kontroll. Carfilzomib ble anvendt som positiv kontroll.
Lignende resultater ble observert i en annen cancercellelinje, LNCaP-celler. Fangchinoline en doseavhengig og tidsavhengig reduksjon av levedyktigheten av LNCaP-celler (figur 2C). IC
50 verdier av fangchinoline i inhibering av celleproliferasjon av LNCaP-celler var 36,18 ± 6,33 uM i 24 timer 11,59 ± 0,22 uM i 48 timer, og 12,73 ± 0,59 uM i 72 timer behandling, henholdsvis. Og fangchinoline også kunne hemme CL aktiviteten til mobil proteasome men ikke påvirke virksomheten til proteasome TL og CT-L aktiviteter i LNCaP celler (figur 2D).
hemmende effekter av fangchinoline på CL aktivitet av renset menneskelige 20S proteasomet
Hydrolysen kurven av β1 spesifikke fluorigenic peptidsubstrat Z-LLE-AMC ved forskjellige konsentrasjoner av renset menneskelige 20S proteasomet ble vist i figur 3A. K
m og V
maks av det rensede proteasome ble beregnet til 244,2 mikrometer og 9.749X10
-4 nmol /min, henholdsvis. De representative tidsavhengige hydrolyse kurver av Z-LLE-AMC (75 uM) ved proteasom med eller uten nærvær av 500 pM fangchinoline ble vist i figur 3B. Resultatene indikerte at hydrolysen av substratet ved proteasom var delvis hemmet i nærvær av fangchinoline. Den inhibitoriske effekten av fangchinoline ved forskjellige doser ble vist i figur 3C. K
i fra fangchinoline ble beregnet til å være 356,58 ± 30,63 mikrometer.
(A) Hydrolyse av β1 spesifikke fluorigenic peptidsubstrat Z-LLE-AMC ved forskjellige konsentrasjoner av renset menneskelige 20S proteasome. (B) Tidsavhengig hydrolyse av 75 uM substrat Z-LLE-AMC av 20S-proteasom, med eller uten nærvær av 500 pM fangchinoline. (C) inhiberende virkninger av fangchinoline ved forskjellige konsentrasjoner i hydrolyse-aktivitet av 20S proteasomet. Data var statistiske resultatene av tre uavhengige forsøk.
Fangchinoline indusert cellesyklus og apoptose i PC-3 celler
Representative resultatene av cellesyklus analyse ble vist i figur 4A og statistisk analyse resultatene er vist i tabell 1. Fangchinoline-behandlede PC-3-celler så ut til å samle seg på G0 /G1 fase med en samtidig reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen. Og, fangchinoline også doseavhengig måte induserte apoptose i PC-3-celler. Representative resultater av apoptose-analyse er vist i figur 4B og statistiske analyseresultater er vist i tabell 2.
(A) Representative flowcytometri analyseresultatene av DNA-histogrammer av PC-3-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av fangchinoline for 24 h. Cellesyklus arrest i G0 /G1 fase ble observert. (B) Representative flowcytometrisk analyse Resultatene av apoptose i PC-3-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av fangchinoline i 24 timer. Viste var representative resultatene av tre uavhengige forsøk.
Fangchinoline behandling hemmet veksten av PC-3 prostatakreft xenografter og indusert apoptose
Som vist i figur 5A, fangchinoline behandling ved 25 og 50 mg /kg kunne en doseavhengig inhiberer veksten av PC-3-xenografter. Dataene viste i figur 5A var relativt tumorvolum (RTV) som er definert som forholdet av tumorvolumet ved en angitt tid og tumorvolumet ved begynnelsen av medikamentbehandling. Dataene i tumorvolum (mm
3) for hver gruppe ble vist i tabell S1. Og som følge av de TUNEL merking (figur 5B) viste at apoptose ble indusert i PC-3-xenografter av dyr behandlet med fangchinoline.
(A) Tumorvekst kurve i nakne mus behandlet med vehikkel-kontroll, 25 mg /kg fangchinoline eller 50 mg /kg fangchinoline. (B) Apoptose (viste ved TUNEL merking) indusert av fangchinoline i tumorxenotransplantater av dyr behandlet med fangchinoline. Scale bar = 10 mikrometer. (C) Proteasome aktiviteter tumorxenotransplantater av dyr behandlet med kjøretøykontroll eller fangchinoline. *
P
. 0,05 vs. kontrollgruppen
proteasomhemmingen i xenografter av dyr behandlet med fangchinoline
Som vist i figur 5C resultater proteasominhiberingens aktivitet analysen av de tumorxenografter indikerte at proteasomer aktivitetene av xenografter av fangchinoline-behandlede grupper ble redusert sammenlignet med den for bærerkontrollen. Nedgangen i proteasome aktivitet var signifikant i 50 mg /kg fangchinoline-behandlede gruppen.
Fangchinoline indusert opphopning av ubiquitinmolekyler samt Ub-IκBα, Ub-p27 og Ub-Bax
Proteasome hemming ville føre til opphopning av ubiquitinmolekyler. Som vist i figur 6A og 6B Fig, fangchinoline induserte doseavhengig og tidsavhengig opphopning av ubiquitinmolekyler i cellene.
