Abstract
Vi setter ut for å studere viktige effektorer av motstand og følsomhet for ErbB2 tyrosin kinase hemmere, som lapatinib i ErbB2-positiv brystkreft og lungekreft. En cellebaserte
in vitro
seterettet mutagenese lapatinib motstand modell identifisert flere mutasjoner, inkludert gatekeeper ErbB2 mutasjon ErbB2-T798I, som medierende motstand. ErbB2-T798I utviklet cellemodeller faktisk vise motstand mot lapatinib men forblir følsomme for irreversible EGFR /ErbB2 inhibitor, PD168393, tankevekkende og eventuelle alternative behandlingsstrategier for å overvinne motstand. Genuttrykk profilering studier identifisert en utvalgt gruppe av nedstrøms mål regulert av ErbB2 signalering og definere PHLDA1 som umiddelbart downregulated gen på onkogene ErbB2 signale hemming. Vi finner betydelig nedregulering av PHLDA1 i primær brystkreft og PHLDA1 er statistisk signifikant mindre uttrykt i ErbB2 negativ i forhold til ErbB2-positive tumorer i overensstemmelse med reguleringen av ErbB2. Endelig PHLDA1 overekspresjon blokker AKT signalering, hemmer cellevekst og forbedrer lapatinib følsomhet ytterligere støtte en viktig negativ vekst regulator funksjon. Våre funn tyder på at PHLDA1 kan ha viktige hemmende funksjoner i ErbB2 drevet lunge- og brystkreftceller og en bedre forståelse av dens funksjoner kan peke på nye terapeutiske muligheter. Oppsummert våre studier definere nye måter å modulere følsomhet og resistens mot ErbB2 hemming i ErbB2 avhengig kreft
Citation. Li G, Wang X, Hibshoosh H, Jin C, Halmos B (2014) Modulation av ErbB2 blokade i ErbB2-Positiv Kreft: The Role of ErbB2 Mutasjoner og PHLDA1. PLoS ONE ni (9): e106349. doi: 10,1371 /journal.pone.0106349
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 17 september 2013; Godkjent: 06.08.2014; Publisert: 19.09.2014
Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society (gi Ingen RSG-08-303-01-TBE til BH) og NIH /National Cancer Institute Specialized Program for fremragende forskning i human Lung Cancer tilskuddet P50 CA90578-04 (BH). Histopatologi assistanse ble gitt av Molecular Pathology delt ressurs, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ErbB2 er en cellemembran overflate-bundet reseptor-tyrosin-kinase, og er involvert i signaloverføringsreaksjonsveier som fører til cellevekst og proliferasjon. Dette genet blir amplifisert i 10-20% av brystkreft, og forsterknings resulterer i overekspresjon protein, som betegner en aggressiv fenotype [1] – [4]. Overekspresjon, forsterkning og tidvis aktiverende mutasjoner i ErbB2 forekommer også i andre krefttyper, inkludert ikke-småcellet lungekreft [5], [6]. Det humaniserte antistoff trastuzumab (Herceptin) mot overuttrykt ErbB2 er påvist å være effektive i behandling av bryst og mage kreft med ErbB2 amplifikasjon [7]. Videre ble somatiske mutasjoner i kinase-domenet av ErbB2 oppdaget i forskjellige faste kreftformer, inkludert lunge- og brystkarsinomer [8] – [12]. Mer nylig har dual EGFR /ErbB2 tyrosinkinasehemmere også vist lovende i kliniske studier. En dobbel, reversible EGFR /ErbB2-inhibitor, lapatinibs (Tykerb) spesielt har vist betydelig aktivitet i ErbB2-positiv brystkreft og nå er godkjent til bruk i denne indikasjonen [13]. https://en.wikipedia.org/wiki/HER2/neu – cite_note-3Inhibition av ErbB2 tyrosin autofosforylering av lapatinib opphever nedstrøms Ras-Raf-ERK1 /2 og PI3K-AKT vekst /overlevelse signalering i ErbB2 overekspresjon brystkreftcellelinjer og hos pasienter med ErbB2-overekspresjon brystkreft [14].
Den jevne utviklingen av ervervet resistens mot lapatinib dessverre begrenser dens kliniske effekten. I analoge innstillinger, sekundære mutasjoner som KIT ekson 17 mutasjoner i imatinib-resistente GIST og EGFR T790M i EGFR-mutert lungekreft er vanlige resistensmekanismer [8], [15]. Det er ingen in vivo data for tiden tilgjengelig på mulige mekanismer for motstand mot lapatinib. I et in vitro modellsystem, den sekundære mutasjon, ErbB2 T798I bibringer den sterkeste lapatinibs motstand effekt i Ba /F3-celler, og er analog til den epidermale vekstfaktor-reseptor T790M [16] – [18]. En fersk studie antyder at i in vitro modellsystemer utviklingen av co-avhengighet ER-signalveier kan være en annen mulig mekanisme for å lapatinib motstand [19]. Det er også data som tyder på involvering av AXL aktivering i lapatinibs-resistens i ErbB2 positiv brystkreft [20]. Åpenbart andre mekanismer eksisterer også. Gitt vanskelighetene med å skaffe primære pasientprøver, er det viktig å konstruere eksperimentelle cellesystemer for å screene for relevant motstand mekanisme som deretter tillate testing av alternative hemmere for å overvinne motstanden. Det er entydig at AKT /PI3K og ERK /MAPK trasé er viktige umiddelbare nedstrøms effektorer av ErbB2 onkogene signalisering. Imidlertid har sin målgruppe alvorlige mangler i forhold til giftighet og et smalt terapeutisk gitt sine viktige fysiologiske roller. Derfor bør en bedre forståelse av hele utvalget av nedstrøms endringene gjør at identifisering av nye handlings mål og utvikling av mer effektive og holdbare strategier for behandling av ErbB2-positive kreft.
I vår studie har vi satt ut til å doble formål å fremme vår forståelse i begge disse sentrale områdene av onkogene ErbB2 SIGNAL ervervet resistens og nedstrøms effektor og modulator veier. Først etablerte vi følsomhet for lapatinib behandling av ErbB2-positive lunge og brystkreft cellelinjer, identifisert en rekke antatte ervervet resistensmutasjoner og viste at mutasjoner av ErbB2-T798 føre til motstand som kan overvinnes ved irreversibel ErbB2 inhibitor, PD168393. Deretter gjennomførte vi en genuttrykk profilering studien å identifisere en nøkkel gruppe tidlig ErbB2 målgener og identifisere PHLDA1 som en roman nedstrøms mål av ErbB2 signalering med en funksjonell rolle i negative tilbakekoblingsmekanismer for å finjustere resultatet av ErbB2 signalisering og dermed vesentlig styrking følsomheten av ErbB2-positiv brystkreft celler til lapatinibs. Våre studier gir flere nye veier for å utvide fordelene av ErbB2 hemming i forvaltningen av ErbB2 avhengige kreftformer.
Materialer og metoder
Pasient Material
brystkreft vev og det normale brystvev som omgir tumoren ble oppnådd fra samme pasient. De formalinfikserte vev ble anvendt for immunhistokjemi studien. Prosjektet ble godkjent av etikkomiteen av New York Presbyterian Hospital of Columbia University, og pasientene gav skriftlig samtykke i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Reagenser
EGF ble kjøpt fra Sigma- Aldrich (St. Louis, MO), ble PD168393 og CL387,785 kjøpt fra Calbiochem (Billerica, MA), lapatinib ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Legemidler ble oppløst i DMSO for å gi en 10 mmol /l stamløsning og den endelige DMSO-konsentrasjon i alle forsøk var mindre enn. 0,1%
Cell Culture
Calu3, HCC827, H1975, HCC202, HCC1569, HCC1937 og T47D-celler ble holdt i RPMI 1640 supplert med 10% FBS, ble SKBR3-celler opprettholdt i McCoys medium supplert med 10% FBS. MDA-MB-468 og MDA-MB-436-celler ble opprettholdt i Leibovitz L-15 medium supplementert med 10% FBS, ble MCF-7-celler opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% FBS. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2 og var i logaritmisk vekstfase ved begynnelsen av alle forsøk. MCF-7, MDA-MB-468 og MDA-MB-436 celler er gitt her courtesy of Dr. Matthew Maurer (Columbia University). Alle cellelinjer ble opprinnelig kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia)
ErbB2 mutagenese, bibliotek generasjon, og stoffet motstand skjermen
Plasmidkonstruksjonen pcDNA3.1. (-) – ErbB2-HA var genereres som tidligere beskrevet [8]. Vi innførte en ny enzymsete-AgeI i posisjon 1457 i ErbB2 cDNA. Da stokket vi hele trans og tyrosin kinase bindende domene av ErbB2 av AgeI-AfeI fordøyelse (AfeI site posisjon 3191). Ved hjelp av den muterte pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA plasmid, utførte vi tilfeldig mutagenese ved anvendelse av primere som spenner over området 1457-3191 i nærvær av 50 umol /L MnCl
2. Subkloning inn i p-GEM-T Easy vektor og sekvensering av individuelle kolonier viste at i det vesentlige alt av PCR-produktene inneholdt mutasjoner, med 50% av produktene inneholdende en 1-bp endring. Bassenget av amplifiserte DNA-fragmenter ble spaltet med AgeI og AfeI og religert inn i ryggraden pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA vektor. Foreldre SKBR3 celler ble transfektert med mutageniserte bibliotekene. Cellekloner ble selektert med friskt medium inneholdende 500 pg /ml G418 og 1 pmol /l lapatinibs etter 24 timers transfeksjon. En måned senere ble cellekolonier isoleres og ytterligere forsterket i nærvær av både G418 og lapatinib og deretter tyrosinkinase-domenet av ErbB2 ble resequenced. Sequence justering og analyse ble gjort med DNASTAR og Mutation SURVEYOR programvare (SoftGenetics, State College, PA).
Generering av ErbB2 T798I plasmid konstruere
ErbB2 T798I ekspresjonsvektor ble generert av site rettet mutagenese (Quickchange mutagenese kit, Stratagene, Santa Clara, CA) av pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA plasmidkonstruksjonen. Primerne anvendt for seterettet mutagenese ble T798I, 5′-CACGGTGCAGCTGGTGATACAGCTTATGCCCTATG-3 «(sense) og 5′-CATAGGGCATAAGCTGTATCACCAGCTGCACCGTG-3» (antisens). Den riktige sekvensen til den genererte konstruksjon ble bekreftet ved resequencing. Vi konstruerte også en ErbB2-villtype-ekspresjonskonstrukt som kontrollen for transfeksjon analyser. Forbigående transfeksjon studier ble gjort ved hjelp av COS-7 celler med disse rekonstruert plasmider. Western blot-analyse ble benyttet for å bekrefte suksess for transfeksjon ved bruk av et anti-hemagglutinin-tag antistoff. G418 (500 ug /ml) ble anvendt for å velge stabilt transfekterte celler og isolerte kolonier ble plukket ved hjelp av kloningsringer, og fortsatte å bli dyrket i nærvær av G418. Ekspresjon av ErbB2 T798I mutant protein ble bekreftet ved påvisning av ekspresjonen av hemagglutinin-taggen som ovenfor.
Cell Growth Inhibition Analyse
Celler ble sådd ut i hver brønn av 96-brønners plater i celle medium inneholdende 10% FBS. 24 timer etter plating ble cellene behandlet med angitte konsentrasjoner av inhibitorer. Konsentrasjonen av DMSO i mediet ble justert til 0,1%. Etter 72 timers inkubering, ble levedyktige celler målt ved anvendelse av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2
H
tetrazolium, indre salt (MTS, absorpsjon av formazan ved 490 nm; CellTiter96, Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens protokoll. Hvert forsøk besto av tre replikate brønner på den samme medikamentkonsentrasjonen. IC50 ble bestemt fra dose-responskurver.
Immunoblotting
For å vurdere ErbB2 signaliserer aktiveringen ble cellene sultet i 12 timer og deretter inkubert med lapatinib eller PD168393 i 3 timer, etterfulgt av EGF ( 100 ng /ml) eller heregulin (20 ng /ml) stimulering i 15 minutter. Helcellelysater ble separert på 8% SDS-polyakrylamidgeler, overført til nitrocellulose, og protein ekspresjon ble påvist ved anvendelse av Western Lightning Chemiluminescence Reagent (Perkin-Elmer Life Science, Wellesley, MA). Fosfor-Akt (Ser473), fosfor-ERK 1/2 (T202 /Y204), total-Akt, total-ERK og GAPDH antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot ErbB2 (C-18), PHLDA1 [21] – [23] og hemagglutinin tag (F-7) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoff rettet mot fosfor-ErbB2 (Y1248) ble kjøpt fra R 24 timer etter utplating media ble oppdatert til angitte konsentrasjoner av inhibitorer, så inkubert i ytterligere 72 timer. Cellene ble så trypsinert, vasket med PBS, resuspendert i Annexin /propidiumjodidfarging buffer (Roche Applied Science), og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Data ble analysert med FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon). Bromo-deoxyuridine (BrdU) celleproliferasjon Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (FITC BrdU Flow Kit, BD Pharmingen, San Diego, California). I korthet Calu3-celler ble behandlet med lapatinibs ved forskjellige konsentrasjoner (sluttkonsentrasjon: 0, 0,1, 1, 3, og 10 pmol /L) i 3 dager, deretter puls-merket i 60 minutter med 10 uM BrdU, oppsamlet ved trypsinering og permeabilisert med BD cytoperm buffer, farget med fluoriserende anti-BrdU-antistoff, motfarget med 7-amino-aktinomycin D for total DNA-innhold og analysert ved strømningscytometri. Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Oligonucleotide rekke analyse
Calu3 og SKBR3 celler ble dyrket til 60% konfluens i kulturmedium og deretter ble behandlet med lapatinibs (1 um) eller DMSO ( 0,01%) som en kontroll i 6 timer. Total cellulær RNA ble isolert ved anvendelse av RNAeasy mini-kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA kvalitet ble vurdert ved hjelp av Experion Automated Elektroforese Station (Bio-Rad) og kvantifisert ved fiberoptiske spektrofotometri hjelp av Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Inc., Wilmington, DE, USA). cDNA ble syntetisert, merket og hybridisert til Affymetrix HG-U133A mikromatriser og skannet. Uttrykket verdi for hvert gen ble beregnet ved hjelp av Affymetrix Genechip programvare og Robust multichip Average (RMA) metode for signal utvinning.
Forbehandling, filtrering, og Statistisk analyse
De microarray data ble analysert og den falske funnrate ble beregnet ved hjelp av SAM (Stanford University, California). Array normalisering og beregning av uttrykk verdier av brikken ble utført ved hjelp av DNA-Chip Analyzer (dchip). For annotering av de resulterende gener, ble genet ontologi leseren NetAffymetrix (https://ww.affymetrix.com) brukes. De differensielt uttrykte gener med ≥2 eller ≤0.5 ganger endring, q-verdi ≤1% ble analysert ved hjelp av t-test og gruppert med programvarepakken klyngen 3.0 [24].
Kvantitativ PCR-analyse
Total RNA fra triplikate prøver ble isolert ved hjelp av RNAeasy mini-sett (Qiagen). cDNA ble syntetisert med M-MLV-revers transkriptase (SuperScipt III revers transkriptase, Invitrogen, Grand Island, NY) ved bruk av oligo (dT) primere fra Invitrogen. Alle prøvene ble analysert ved Roche LightCycler hjelp av Syber grønne prober. Primersekvensene er vist i tabell S1. Nivåer av GAPDH uttrykket ble brukt som interne referanser til normal innspill cDNA. Forholdstall på nivå av hvert gen til GAPDH ble deretter beregnet.
Immunohistochemistry
Formalin-fiksert primær bryst svulst vevssnitt ble deparaffinized og rehydrert og inkubert med 0,6% hydrogenperoksid i metanol. Target gjenfinning oppløsning, pH 9,0 (Dako, Carpinteria, CA) ble anvendt for antigen gjenfinning. Glassene ble inkubert med primære antistoffer for over natten ved 4 ° C, etterfulgt av farging med R.T.U Vectastain Universal Kort kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) med hematoksylin atomkontra. Til slutt, lysbilder var dehydrert sekvensielt i etanol, klarert med xylen. Den anti-PHLDA1-antistoff ble anvendt i 1:50 fortynning (Santa Cruz Biotechnology). Intensiteten til farging av PHLDA1 ble scoret av et styre sertifisert brystkreft patolog som 0 (ingen uttrykk), 1+ (svak uttrykk), 2+ (moderat uttrykk) og 3+ (sterkt uttrykk) og prosentandel (0-1,0 ) av positivt fargede tumorceller ble også vurdert å generere en sammensatt H-score (intensitet poengsum X prosent positive, spekter av mulige verdier 0-3.0). Sølv in situ hybridisering (SISH) ble anvendt for å bestemme status ErbB2 i humane brystcancerprøver [25]. Forholdet mellom ErbB2 /kromosom 17 ble beregnet ved å dividere den totale poengsum for ErbB2 ved total poengsum for kromosom 17. Et forhold på 1,8 indikerte at ErbB2-genet ikke ble amplifisert, mens et forhold på 2,2 indikert amplifikasjon av genet . For tilfeller med et forhold mellom 1,8 og 2,2, ble signaler fra 20 flere tumor kjerner telles i hvert lysbilde og en ny forholdet ble beregnet.
plasmidkonstruksjoner og cellulær transfeksjon
full lengde cDNA-sekvensen av human PHLDA1 ble amplifisert fra genomisk DNA fra HCC827 celler. PHLDA1 ble deretter modifisert med en HA-tag ved den C-terminale ende ved overlappende PCR for å skille plasmid avledet fra native protein, og ble subklonet inn i pcDNA3.1 (-) ryggrad vektor. Nøyaktigheten av den konstruksjon ble bekreftet ved direkte DNA-sekvensering. SKBR3 celler ble transient transfektert med tom pcDNA3.1 (-) (pcDNA3.1 (-) – EV) eller PHLDA1 (pcDNA3.1 (-) – PHLDA1) ekspresjonsvektorer ved bruk av Fugene 6 (Roche Applied Science). Stabilt transfekterte subkloner ble selektert med G418 i en konsentrasjon på 500 mg /ml utgangs 48 h posttransfection
forankringsuavhengig vekst analyse og migrering assay
For forankringsuavhengig vekst assay pcDNA3.1 (. – ) -EV og pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 stabile transfekterte celler ble trypsinert, telles to ganger ved bruk av et hemocytometer, og sådd ut på 5000 celler /ml i den øvre plugg bestående av 0.4% Seaplaque agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME) i McCoys 5A medium. Etter 25 dager ble kolonier fotografert og telles. Forsøket ble gjentatt tre ganger med hver triplikater. Gjennomsnittlig antall kolonier fra hvert eksperiment ble plottet. For migreringsanalyser, konfluente monolag av pcDNA3.1 (-) – EV og pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 stabile transfekterte celler ble skrapet med en steril 10 mL pipettespissen. Platene ble deretter vasket og inkubert ved 37 ° C i 10% FBS /McCoys 5A medium i 48 timer
klonogene overlevelsesanalyse
to tusen pcDNA3.1. (-) – EV og pcDNA3 0,1 (-) – PHLDA1 SKBR3 celler ble sådd ut på 6 cm plater og ble tillatt å komme seg i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med 0,1 um eller 0,5 um lapatinib og fikk vokse i 10 dager. Deretter ble platene farget med metylenblått i 4 timer, og antallet kolonier med mer enn 50 celler i hver plate ble bestemt. Et sett med ubehandlede plater ble inkludert som kontroller for å bestemme pletteringseffektiviteten for individuelle cellelinjer. Det effektive antall celler /plate ble bestemt på grunnlag av pletteringseffektiviteten av hver cellelinje og antallet av celler pr plate belagt. Disse tallene ble så brukt for å beregne den prosentvise overlevelse. Dessuten ble hver behandling utført i tre paralleller for å bestemme den SD for hvert datapunkt.
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av chi-squared test eller to-prøve
t
-UNDERSØKELSER som hensiktsmessig, med
P
-verdi av 0,05 ansett som statistisk signifikant. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Dataene er representative for tre separate eksperimenter.
Resultater
Lapatinib og PD168393 indusere veksthemming og apoptose i ErbB2-positive Calu3 og SKBR3 celler
Vi først utført MTS cellevekst analyser for å undersøke hvorvidt inhibering av ErbB2 lapatinibs, en reversibel dobbel EGFR /ErbB2-tyrosinkinase-inhibitor, eller PD168393, som irreversibelt hemmer ErbB2, kan føre til vekst inhibering av ErbB2-positive cancerceller, slik som ErbB2-positive Calu3 lungekreft og SkBr -3 brystkreftcellelinjer. Vi har funnet at både lapatinib og PD168393 betydelig hemmet veksten av Calu3 og SKBR3 celler (Fig. 1A). Videre undersøkelser ved hjelp Annexin V farging viste at både lapatinib og PD168393 indusert fremtredende apoptose i både Calu3 og SKBR3 celler (Fig. 1B og 1C). BrdU-inkorporering analyse ble utført for å vise redusert spredning av disse to cellelinjer ved lapatinibs behandling. Den lapatinib behandlet Calu3 celler viste en signifikant høyere G
1 befolkningen i tråd med G
1 arrest sammenlignet med kontrollceller (fig. 1d), og dette ble ytterligere bekreftet i SKBR3 celler (Figur S1). Disse resultatene tyder på at lapatinib induserer cellesyklus arrest i G
1 fase og påfølgende apoptose i Calu3 og SKBR3 celler. For å bestemme virkningen på nedstrøms signalveier, ble fosforyleringen nivåer av MAP-kinase og AKT trasé vurdert i disse to ErbB2-positive cellemodeller, og robust blokkering av begge signalveiene ble funnet (fig. 1E, Fig S2). Dette funnet var korrelert med resultatene av veksthemmende analysene gjort, noe som tyder på at veksthemming forårsaket lapatinibs og PD168393 kan reguleres gjennom effektiv blokade av MAP-kinase og AKT trasé.
A. Cellular spredning av Calu3 og SKBR3 celler behandlet med ulike konsentrasjoner av lapatinib og PD168393 som bestemmes av MTS analysen. B. Lapatinib og PD168393 indusere cellulær apoptose i Calu3 og SKBR3 celler. Representant Annexin V /propidiumjodid- flowcytometri; tallene representerer prosentandelen av celler i den riktige kvadrant. C. Kvantifisering av apoptose. D. Lapatinib induserer cellesyklus arrest i Calu3 celler som oppdages av BrdU og 7-ADD-analysen. R1-G1 fase; R2-G2 fase; R3-S fase; R4-G0 fasen. E. Dose respons av lapatinib og PD168393 på fosforylering av ErbB2, AKT og ERK i Calu3 og SKBR3 celler som respons på EGF behandling. p-ErbB2: fosforylert ErbB2; t-ErbB2: total-ErbB2; p-AKT: fosforylert AKT; t-AKT: total AKT; p-ERK: fosforylert ERK; t-ERK. total ERK
Karakterisering av motstand mutant ErbB2-T798I
Neste, vi fulgt en tilfeldig mutagenese strategi for å vurdere sekundære mutasjoner av ErbB2 som kan føre til funksjonell motstand mot lapatinib. Først hele transmembrane og tyrosinkinase-domenet av ErbB2 (posisjonene 1457-3191) ble mutagenisert tilfeldig. Deretter ble mutagenisert ErbB2 stokkes inn i en pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA ryggrad og transfektert inn i SkBr-3-celler. Vi genererte medikamentresistente SkBr-3-cellekloner i nærvær av både 500 ug /ml G418 og 1 pmol /l lapatinibs og identifiserte 9 forskjellige aminosyresubstitusjoner som påvirker 5 rester fra isolerte klonale derivater. Erstatninger på fem posisjoner ble identifisert: P944L (3 tilfeller), T798I (2 tilfeller), T798M (1 sak), C576S (1 tilfelle), R487P (1 sak), og E542G (1 sak). Den kritiske gatekeeper treonin-rest i tilfelle av ErbB2 er T798- som tilsvarer T790 av EGFR, samt T315 på ABL kinase. Basert på nukleotidsekvensen til ErbB2, er det betydelig mer sannsynlig at en mutasjon skulle forandre sekvensen til T798I (krever en basepar-endring) versus T798M (krever to basepar endringer). Derfor T798I ble valgt for videre studier.
T798I ble regenerert ved sete-rettet mutagenese og anvendt for forbigående transfeksjon studier i Cos-7-celler. I pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt COS7-celler, 1 umol /L lapatinibs signifikant hemmet fosforylering av ErbB2. I motsetning til i pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I transfektanter, vedvarende ErbB2 fosforylering ble notert i nærvær av lapatinib i konsentrasjoner som varierte fra 0,1 til 10 pmol /L, bekrefter skifte i stoffet følsomhet tilsvarende funnene i MTS -analyser (fig. 2A). For å bekrefte denne observasjonen, vi også generert et stabilt transfektert Calu3 celle klone med pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I-HA plasmid konstruere og funnet veldig konsekvent resultat (figur 2B.). Vi har vurdert nivået på motstanden som pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I dratt til lapatinib ved å generere dose-responskurver av MTS analyser på pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I stabile transfektanter. Celler ble dyrket i nærvær av økende konsentrasjoner av lapatinibs strekker 0-10 umol /l. pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Calu3-celler ble hemmet av potente lapatinibs (IC
50, 2,3 umol /l). Calu3 celler som uttrykker pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I var mindre følsomme for lapatinibs med en IC
50, 6,5 umol /l (figur 2C).
A.. Dose respons av lapatinib og PD168393 på fosforylering av ErbB2 i COS7-celler etter 24 timers transient transfeksjon med ErbB2-wt og ErbB2-T798I vektorer. Total ErbB2, HA og GAPDH ekspresjonsnivået som kontroll. B. Dose respons av lapatinib og PD168393 på fosforylering av ErbB2, AKT og ERK i ErbB2-wt og ErbB2-T798I stabil Calu3 celle kloner. Total ErbB2, total AKT, total ERK, HA og GAPDH ekspresjonsnivået som kontroll. C. Doseavhengig vekst inhibering indusert ved behandling av lapatinib og PD168393 i 72 timer i ErbB2-wt og ErbB2-T798I stabil Calu3 cellekloner som påvist ved hjelp av MTS-analysen. D. Lapatinib og PD168393 indusere cellulær apoptose i ErbB2-wt og ErbB2-T798I stabil Calu3 celle kloner etter 72 timers behandling. E. Kvantifisering av apoptose.
Vi videre analysert de funksjonelle konsekvensene av T798I ved å vurdere cellulær apoptose indusert av lapatinib som definert av Annexin /propidiumjodid apoptose analyser. Behandling av pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Calu3 celler med 1 umol /L lapatinibs resulterte i en betydelig økning i andelen av apoptotiske celler, mens de samme konsentrasjonene hadde signifikant mindre indusert apoptose i pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I stabile transfektanter (fig. 2D og 2E). Disse resultatene var konsistente med forbigående transfeksjon studier forfulgt i SKBR3 celler (Figur S3, S4 og S5).
Et alternativ ErbB2 inhibitor PD168393 kan overvinne motstanden
Deretter testet vi T798I Calu3 kloner mot irreversible ErbB2 /EGFR-hemmer PD168393. Vi gjennomførte standard MTS analyser Følgende 72 timer medikamentell behandling ved hjelp av en rekke konsentrasjoner 0-10 pmol /L. Våre data viste at PD168393 kunne overvinne T798I indusert motstand mot lapatinib (Fig. 2C). Denne inhibitor var like effektiv mot pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I mot pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt transfektanter. I signaleringsstudier, har vi funnet at PD168393 fullstendig inhiberer AKT og ERK-fosforylering ved konsentrasjoner så lave som 0,03 umol /L, slik at for bedre å kunne vise den nedstrøms signalendring, vi brukte et område av konsentrasjoner 0 til 0,1 umol /l. Signale studier viste at behandling med PD168393 kan potent hemme nedstrøms signal korrelerer som fosfor-AKT og ERK (Fig. 2B). ErbB2 fosforylering nivå i celler med mutert ErbB2 ble endret, men i mindre grad av PD168393 inhibering forenlig med partiell inhibering (Fig. 2B). Annexin /propidiumjodid studier viste ytterligere induksjon av apoptose av denne forbindelse i begge pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt og pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I Calu3 cellekloner (Fig. 2D og 2E). Disse resultatene tyder på at T798I kan være en viktig motstand mekanisme i lapatinib-behandlede svulster, men også foreslå potensielle effekten av irreversible ErbB2 hemmere.
Gene uttrykk profilering av lapatinib-behandlede celler
Neste, vi satt ut for å studere et omfattende utvalg av nedstrøms endringer som følge av effektiv ErbB2 hemming. Tidligere i lignende studier har vi vist at så tidlig som etter 6 timer med signalehemming, irreversible EGFR-hemmer, CL-387785 kan indusere en vesentlig endring av transkripsjon i en liten og representativ gruppe av viktige nedstrøms effektorer av onkogene EGFR signalering, inkludert viktige pathway komponenter som Cyclin D1, DUSPs etc i EGFR mutante lungekreft [1], [26], [27]. I en analog måte, vi dro ut for å identifisere tidlige effektorer av ErbB2 indusert genuttrykk endringer i ErbB2-positive celler. For å identifisere de viktigste genene forskjellig uttrykt i SKBR3 celler behandlet med lapatinib (1 mikromol /l) i 6 timer, ble en genuttrykk profilering studie gjort i tre paralleller på totalt cellulært RNA ved hjelp av Affymetrix HG-U133A chips. Den rå ekspresjonsdata ble forhåndsbehandlet, rescaled, filtrert og analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Genene endret ved lapatinibs behandling er vist i Tabell S2. Denne analysen viste at 110 markørgener ble nedregulert og 73 gener ble oppregulert med de strenge kriteriene satt av en minst 2 ganger endring og Delta verdi 5 når lapatinib behandlede prøvene ble sammenlignet med kjøretøy-behandlede celler (den Delta verdi er en tuning parameter som kan dynamisk endre terskler for betydning).
en sammenligning av dette genet liste med våre tidligere data som identifiserer gen endringer ved EGFR hemming i EGFR-avhengig lungekreftceller [27], [28 ] viste en bemerkelsesverdig overlapping mellom signifikant modulerte gener i de to uavhengige eksperimenter (tabell 1). Mer enn halvparten av genene identifisert i vår tidligere studie av genregulering av EGFR blokade ble betydelig modulert på ErbB2 hemming i ErbB2-positive kreftceller samt foreslå svært delte onkogene veier. Seks av de beste ErbB2 /EGFR-regulert gener, DUSP6, DUSP4, PHLDA1, PHLDA2, CCNG2 og DRE1 ble valgt og bekreftet å være sterkt regulert av kvantitativ revers transkripsjon-PCR analyser på RNA hentet fra lapatinib-behandlede celler (Fig. 3) .
Kvantitativ PCR-analyse av genregulering av lapatinib behandling i 6 timer i SKBR3 og Calu3 celler. Brett induksjon i forhold til 0 time kontroll ble plottet etter normalisering av GAPDH. Δ: p 0,05; ×: p 0,01; †: p 0,005; *: P 0,001
PHLDA1 er nedregulert av EGFR /ErbB2 hemming
Vi har valgt å fokusere på en roman nedstrøms målet genet, PHLDA1 som et protein. som tidligere ikke ble identifisert til å delta i ErbB2 /EGFR drevet veier. Dette genet tilhører gruppen av pleckstrin-homologienheter domene proteiner og er spekulert til å fungere gjennom å forstyrre funksjonen av PI3-kinase og dermed begrenser AKT aktivering basert på arbeid på et annet familiemedlem, PHLDA3 [29]. Western blotting-analyse faktisk viste at PHLDA1 ble nedregulert betraktelig så tidlig som 6 timer inn EGFR eller ErbB2 inhibering på proteinnivået, så vel som representerer en øyeblikkelig respons (fig. 4). F.eks
